Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Riepilogo

Gli effetti degli inibitori migrastatici sulla migrazione delle cellule tumorali del glioma nei saggi di invasione tridimensionale (3D) utilizzando un inibitore della deacetylasi istone (HDAC) sono caratterizzati da microscopia confocale ad alta risoluzione.

Abstract

La scoperta e lo sviluppo di farmaci nella ricerca sul cancro si basa sempre più su schermi di farmaci in formato 3D. Nuovi inibitori mirati al potenziale migratorio e invasivo delle cellule tumorali, e di conseguenza alla diffusione metastatica della malattia, vengono scoperti e considerati come trattamenti complementari in tumori altamente invasivi come i gliomi. Pertanto, è necessaria la generazione di dati che consentano analisi dettagliate delle cellule in un ambiente 3D dopo l'aggiunta di un farmaco. La metodologia qui descritta, che combina i saggi di invasione degli sferoidi con l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e l'analisi dei dati mediante microscopia a scansione laser confocale (CLSM), ha permesso una caratterizzazione dettagliata degli effetti del potenziale inibitore anti-migranti MI-192 su cellule glioma. Gli spheroid sono stati generati dalle linee cellulari per i saggi di invasione in piastre aderenti di 96 pozze e poi preparati per l'analisi CLSM. Il flusso di lavoro descritto è stato preferito rispetto ad altre tecniche di generazione di sferoidi comunemente utilizzate a causa sia della facilità che della riproducibilità. Questo, combinato con la maggiore risoluzione dell'immagine ottenuta dalla microscopia confocale rispetto agli approcci convenzionali a campo largo, ha permesso l'identificazione e l'analisi di cambiamenti morfologici distinti nelle cellule migratorie in un ambiente 3D a seguito trattamento con il farmaco miestatico MI-192.

Introduzione

Le tecnologie di sferoide tridimensionali per la scoperta preclinica di farmaci e lo sviluppo di potenziali farmaci antitumorali sono sempre più favorite rispetto agli schermi di farmaci convenzionali; vi è quindi un maggiore sviluppo della droga migrastatica , migrazione e invasione. La logica alla base di questi sviluppi nel trattamento del cancro è chiara: i saggi sferoidi 3D rappresentano un approccio più realistico per lo screening di potenziali farmaci anti-cancro in quanto imitano l'architettura tumorale 3D più fedelmente rispetto alle colture di momostrato cellulare, ricapitolare le interazioni farmaco-tumore (cinetiche) in modo più accurato e consentire la caratterizzazione dell'attività farmacologica in un ambiente correlato al tumore. Inoltre, l'aumento della resistenza ai farmaci chemiotossici in molti tipi di cancro e alti tassi di mortalità tra i pazienti oncologici a causa di metastasi potenziati dalla capacità delle cellule tumorali di migrare verso siti tumorali distanti supporta l'inclusione di agenti chemioterapici mirare al potenziale migratorio delle cellule tumorali come trattamento adiuvante in futuri studi clinici sul cancro¹. Ciò è particolarmente vero nei tumori altamente invasivi, come i glioblastomi di alta qualità (GBM). La gestione GBM include chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Tuttavia, anche con il trattamento combinato, la maggior parte dei pazienti recidiva entro 1 anno dalla diagnosi iniziale con una sopravvivenza mediana di 11-15 mesi^2,3. Negli ultimi anni sono stati compiuti enormi progressi nel campo della tecnologia 3D: sistemi rotativi, strutture microfabbricate e scaffold 3D, e altri saggi individuali vengono continuamente migliorati per consentire test di routine su larga scala^{4, 5,6,7}. Tuttavia, i risultati ottenuti da questi saggi devono essere analizzati in modo significativo perché l'interpretazione dei dati è spesso ostacolata dai tentativi di analizzare i dati generati in 3D con sistemi di analisi delle immagini 2D.

Nonostante sia preferibile in termini di velocità di acquisizione delle immagini e ridotta foto-tossicità, la maggior parte dei sistemi sul campo aperto rimane limitata dalla risoluzione⁸. Così, a parte le letture dei dati relative all'efficacia dei farmaci, gli effetti dettagliati dell'azione farmacologica sulle strutture cellulari 3D delle cellule migratorie sono inevitabilmente persi se vengono immagini utilizzando un sistema a campo largo. Al contrario, la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) cattura immagini di alta qualità sezionati otticamente che possono essere ricostruite e renderizzate in 3D dopo l'acquisizione utilizzando un software per computer. Pertanto, CLSM è facilmente applicabile all'imaging di strutture cellulari 3D complesse, consentendo così l'interrogatorio degli effetti degli inibitori anti-esmigrastati su strutture 3D e analisi approfondite dei meccanismi di migrazione cellulare. Ciò guiderà senza dubbio lo sviluppo futuro di farmaci migrastatici. Qui, viene descritto un flusso di lavoro combinato di generazione di sferoidi, trattamento farmacologico, protocollo di colorazione e caratterizzazione mediante microscopia confocale ad alta risoluzione.

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Protocollo

1. Generazione di sferoidi cellulari

Giorno 1

1. Preparare il mezzo di coltura standard come richiesto dalla linea cellulare in esame.
2. Eseguire tutte le fasi associate alla coltura tissutale in una cappa di coltura tissutale utilizzando tecniche di manipolazione sterile.
3. Provare e contare le cellule tumorali. Utilizzare 20 mL di sospensione cellulare per piastra. Mantenere le sospensioni cellulari in tubi universali sterili chiaramente etichettati.
4. Aggiungere un numero predeterminato di celle a ogni pozzo. Sia il numero iniziale di cellule che la dimensione finale dello sferoide richiesto dipende dal tasso di proliferazione della linea cellulare in fase di studio.
   NOT: Per le linee cellulari glioma stabilite come U251 e KNS42^9,10, 5 x 10³ cellule/mL produrrà uno sferoide microscopicamente visibile (200 o 800 m) dopo 4 giorni di incubazione.
5. Risospendere le cellule in tubi universali con una leggera inversione per evitare l'agglomerazione delle cellule. Pipetta 200 L della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra da 96 pozze. Se tutti i pozzi non sono necessari, si consiglia di aggiungere 200 -L di 1x PBS ad ogni pozzo vuoto per evitare l'evaporazione.
6. Incubare le cellule in un'incubatrice come di consueto a 37 .
   NOT: Linee cellulari come le linee cellulari del cancro del glioma formeranno sferoidi entro 24 h. Permetterà che l'architettura cellulare 3D si formi incubano lo sferoide per 72 h.

Giorno 2

7. Controllare le cellule mediante microscopia a campo luminoso dopo 24 h. A seconda della linea cellulare, le cellule potrebbero aver formato uno sferoide rilevabile nella parte inferiore del pozzo.
   NOT: Le linee cellulari del cancro del glioma stabilite formano facilmente sferoidi entro 24 h. Le linee cellulari del cancro al glioma derivate dal paziente possono richiedere fino a 1-2 settimane.

2. Assay invasione del collagene

Giorno 3

1. Mettere il collagene, il mezzo di coltura 5x, 1 M NaOH e un tubo da 20 mL sul ghiaccio.
2. Aggiungere con attenzione e lentamente 10,4 ml di collagene freddo in un tubo di coltura refrigerato. Evitare le bolle. Questa quantità di collagene è sufficiente per una piastra da 96 pozze. L'upscaling è possibile, ma si consiglia di preparare un tubo da 20 mL per piastra alla volta.
3. Aggiungere delicatamente 1,52 mL di mezzo di coltura 5x sterile a freddo. Evitare le bolle.
4. Poco prima dell'uso, aggiungere delicatamente 72 - L of cold sterile 1 M NaOH. Mantenere la soluzione sul ghiaccio.
5. Mescolare delicatamente pipettando. Evitare le bolle. Una miscelazione efficiente porta a un cambiamento di colore (dal rosso al rosso-arancione (pH 7.4) nel mezzo. Lasciare il composto sul ghiaccio fino all'uso.
6. Passo cruciale: Togliere 190 gradi l di supernatante dalla piastra 96-well preparata il giorno 1. Fare molta attenzione a non disturbare gli sferoidi che si sono formati nella parte inferiore del pozzo. Utilizzare la pipetta ad un angolo verso il lato, non il centro, del pozzo.
7. Aggiungere delicatamente 100 l del mix di collagene ad ogni pozzo. Per evitare qualsiasi disturbo sferoide, pipettare il mix lungo il lato del pozzo. Evitare le bolle. Conservare il mix di collagene rimanente nel tubo da 20 mL a temperatura ambiente per valutare la polimerizzazione.
8. Incubare la piastra nell'incubatrice per almeno 10 min per consentire al collagene di polimerizzare. Come linea guida, se il collagene rimasto è impostato, diventando semisolido e spugna-like, gli sferoidi sono pronti per essere trattati con inibitore.
9. Aggiungere i farmaci o gli inibitori a concentrazione 2x al mezzo di coltura. Aggiungere delicatamente il mezzo ad ogni pozzo (100 l per pozzo). Ancora una volta, pipette il mezzo lungo il lato del pozzo per evitare disturbi sferoidi.
10. Osservare e immaginare ogni sferoide con microscopia a campo luminoso a volte T : 0 h, 24 h, 48 h, e 72 h per valutare l'attività del farmaco. Quindi riportare la piastra all'incubatrice.
    NOT: A seconda del comportamento invasivo della linea cellulare, la migrazione lontano dal nucleo sferoide originale può essere osservata a partire da 24 h.

3. Preparazione di sferoidi incorporati di collagene e cellule migratorie per la microscopia confocale

1. Collocare la piastra in una cappa di coltura tissutale e rimuovere delicatamente il supernatante (200 o L). Ancora una volta, fare attenzione a non disturbare lo sferoide ed evitare di toccare il collagene, in quanto ciò potrebbe interferire con la spina di collagene.
2. Sostituire il supernatante con 100 L di 1x PBS. Ripetere questo passaggio 3x.
3. Rimuovere il lavaggio finale e sostituire con il 4% di formaldeide in 1x PBS (100 -L per pozzo).
   ATTENZIONE: La formaldeide è un potenziale cancerogeno. Maneggiare con cura in conformità con le linee guida per la salute e la sicurezza.
4. Mettere la piastra da 96 pozzetto su una panca da laboratorio, coprire con un foglio e lasciare per 24 ore a temperatura ambiente.
5. Rimuovere con attenzione la formaldeide e sostituirla con 1x PBS. Ripetere questo 1x lavaggio PBS 3x.
6. Preparare lo 0,1% Triton X-100 in 1x PBS. Rimuovere il lavaggio 1x PBS e sostituire con 100 gradi della soluzione Triton X-100. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare la soluzione di blocco con 1x PBS e 0.05% latte scremato in polvere e mescolare accuratamente.
7. Rimuovere Triton X-100 e lavare 3x con 1x PBS. Aggiungere 100 l di soluzione di blocco ad ogni pozzo e incubare per 15 min.
8. Diluire l'anticorpo primario richiesto nel buffer di blocco alla concentrazione predeterminata. Qui, utilizzare anticorpo di tubulina acetoso anti-topo (1:100).
9. Centrifugare la miscela di buffer anticorpo-blocco primario per 5 min a 15,682 x g. Rimuovere con cura la soluzione di blocco e aggiungere il super-atlente (25-50 l) ad ogni pozzo. Incubare al buio a temperatura ambiente per 1 h.
10. Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare 3x con 1x PBS (100 gradi l per pozzo).
11. Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di bloccaggio alla concentrazione raccomandata o predeterminata oltre a eventuali macchie fluorescenti aggiuntive. Qui, utilizzare 1:500 anti-mouse fluoroforo-488 anticorpo coniugato, phalloidin-594 (1:500) per la colorazione dell'atto, e la macchia di DNA (DAPI).
12. Ancora una volta, centrifugare la soluzione anticorpale secondaria per 5 min a 13.000 rpm.
13. Rimuovere la soluzione di blocco da ogni pozzo e aggiungere 25-50 l della miscela anticorpo/phalloidin/DAPI secondaria. Incubare al buio per 1,5 h a temperatura ambiente.
14. Rimuovere la soluzione di tintura anticorpale secondaria e lavare 3x con 1x PBS (100 per pozzo).
15. Sollevare con cura i singoli tappi di collagene per aspirazione con una pipetta di plastica (200 o L) al centro di uno scivolo in vetro chiaro di alta qualità.
16. Aggiungere una goccia di un montatore adatto alla spina di collagene, assicurando che la spina sia completamente coperta. Evitare le bolle.
17. Applicare coverldello dello spessore ottimale per l'obiettivo del microscopio che verrà utilizzato per l'imaging e consentire di impostare durante la notte. Conservare i vetrini a temperatura ambiente al buio.

4. Microscopia a fluorescenza

1. Cattura immagini fluorescenti utilizzando un microscopio confocale adatto.

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Risultati

La tecnologia degli sferidi tridimensionali sta portando avanti la comprensione delle interazioni farmaco-tumorale perché è più rappresentativa dell'ambiente specifico per il cancro. La generazione di sferoidi può essere ottenuta in diversi modi; bassa aderenza sono state utilizzate piastre di 96 pozze in questo protocollo. Dopo aver testato diversi prodotti di diversi produttori, le piastre utilizzate qui sono state scelte perché hanno costantemente funzionato meglio in termini di p...

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Discussione

Viene descritto un nuovo modo per creare sferoidi delle cellule tumorali per l'identificazione dell'attività dei farmaci migrastatici utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione. L'uso di piastre aderenti basse rispetto ad altre tecniche, come le gocce appese¹⁵, ha facilitato un mezzo di generazione di sferoidi riproducibili e uniformi da utilizzare nei saggi di migrazione e invasione del collagene. I punti critici in questo protocollo sono la rimozione del mezzo di crescita dalla pi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.