Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Riepilogo

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Abstract

C. elegans è il sistema principale per l'analisi sistematica delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici durante lo sviluppo embrionale. Una sfida è che l'embriogenesi si sviluppa dinamicamente in un periodo di circa 13 h; questa scala cronologica di mezza giornata ha limitato la portata degli esperimenti limitando il numero di embrioni che possono essere immagine. Qui, descriviamo un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging time-lapse 3D simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni a risoluzione temporale moderata, da un massimo di 14 condizioni diverse, in una singola esecuzione notturna. Il protocollo è semplice e può essere implementato da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di visita del punto. L'utilità di questo protocollo è dimostrata usandola per immaginare due ceppi personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave della specifica e della morfogenesi dello strato germinale. Per analizzare i dati, è stato costruito un programma personalizzato che ritaglia singoli embrioni da un campo visivo più ampio in tutti i canali, i passi z e i punti temporali e salva le sequenze per ogni embrione in una pila tiff separata. Il programma, che include un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva, semplifica l'elaborazione dei dati isolando, pre-elaborazione e orientando uniformemente i singoli embrioni in preparazione per la visualizzazione o l'analisi automatizzata. Viene fornita anche una macro ImageJ che compila i dati dei singoli embrioni in un file multi-pannello che visualizza la proiezione della fluorescenza massima e immagini del campo luminoso per ogni embrione in ogni punto di tempo. I protocolli e gli strumenti descritti nel presente file sono stati convalidati utilizzandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale a seguito di 40 geni dello sviluppo descritti in precedenza; questa analisi ha visualizzato fenotipi dello sviluppo precedentemente annotati e ne ha rivelato di nuovi. In sintesi, questo lavoro descrive in dettaglio un metodo di imaging semi-alto-velocità accoppiato con un programma di ritaglio e uno strumento di visualizzazione ImageJ che, se combinato con ceppi che esprimono marcatori fluorescenti informativi, accelera notevolmente gli esperimenti da analizzare sviluppo embrionale.

Introduzione

L'embrione di C. elegans è un importante sistema modello per la biologia delle cellule meccanicistiche e l'analisi delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici che guidano lo sviluppo embrionale^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Fino ad oggi, gran parte della caratterizzazione sia degli eventi a livello cellulare che delle specifiche del destino cellulare nell'embrione è stata ottenuta utilizzando esperimenti di imaging uno alla volta relativamente ad alta risoluzione temporale (cioè acquisizioni ogni 10-100 s) di embrioni che esprimono fluorescenti. Anche se adatto per eventi in ordine da secondi a decine di minuti, questo approccio diventa tecnicamente limitante per la caratterizzazione di processi più lunghi, nell'ordine di ore a giorni. Lo sviluppo embrionale dalla prima scissione fino alla fine dell'allungamento richiede circa 10 h. A questo ritmo temporale, metodi semi-alti che consentirebbero l'imaging simultaneo a risoluzione temporale più bassa (cioè l'acquisizione a intervalli di tempo di 5-20 min) di coorti di embrioni più grandi, a diverse condizioni, avrebbero aperto una nuova serie di esperimenti; ad esempio, consentendo sforzi sistematici di screening su larga scala e l'analisi di un numero sufficiente di embrioni per confrontare le conseguenze delle perturbazioni molecolari.

Qui, descriviamo un metodo semi-alto per il monitoraggio dell'embriogenesi C. elegans che consente l'imaging time-lapse simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni, da un massimo di 14 condizioni diverse, in un'unica esecuzione notturna. Il protocollo è semplice da implementare e può essere eseguito da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di point visiting. I passaggi principali di questo protocollo sono descritti nella Figura 1. In breve, gli embrioni vengono sezionati da adulti gravidi a predare che esprimono marcatori fluorescenti di interesse e trasferiscono embrioni giovani (stadio cellulare 2-8) a pozzi di una piastra di 384 pozze per l'imaging. In questo formato, le dimensioni relativamente piccole dei pozzi incanalano gli embrioni in un'area stretta, che facilita l'identificazione di campi contenenti più embrioni per l'imaging time-lapse. Per mantenere lo sviluppo approssimativamente sincrono attraverso la coorte di embrioni, le dissezioni vengono eseguite in supporti refrigerati e la piastra viene tenuta sul ghiaccio, il che impedisce uno sviluppo significativo durante la finestra temporale di dissezione della durata di un'ora. La piastra viene trasferita al microscopio e gli embrioni vengono filmati in una stanza a temperatura controllata durante la notte, a intervalli di tempo di 20 min, utilizzando una lente 60x di immersione dell'olio 1,35 NA, per raccogliere l'intera gamma z in 2 gradini. Cinquanta campi, ciascuno contenente tra 1 e 5 embrioni, sono immagine in un'unica pernottamento. A seconda dell'esperimento desiderato, la risoluzione del tempo potrebbe essere aumentata (ad esempio, l'imaging a intervalli da 5 a 10 min) diminuendo proporzionalmente il numero di campi immagine.

Con questo protocollo, anche una singola esecuzione notturna genera una notevole quantità di dati (80-100 embrioni distribuiti su 50 campi) e esperimenti più grandi possono diventare rapidamente ingestibili per quanto riguarda l'analisi dei dati. Per facilitare l'elaborazione, la visualizzazione e semplificare l'analisi di questi dati, è stato costruito un programma per ritagliare e orientare gli embrioni ed eseguire passaggi di pre-elaborazione (opzionale), e una macro ImageJ che compila i dati per semplificare la visualizzazione. Questi programmi possono essere utilizzati per elaborare immagini raccolte utilizzando approcci convenzionali, in quanto sono indipendenti dal metodo di imaging, che richiedono un solo piano di campo luminoso. Il primo programma prende in un campo 4D contenente più embrioni (opzione GUI o codice sorgente embryoCrop.py) o più campi 4D contenenti più embrioni (screenCrop.py), ben da muntire embrioni e li orienta in una configurazione anteriore-posteriore. Questi programmi offrono inoltre agli utenti la possibilità di eseguire la sottrazione in background, la correzione della deriva e la correzione dell'attenuazione. I file risultanti sono uniformemente pre-elaborati, impilati tiff strettamente tagliati per ogni embrione che sono modificabili per l'analisi automatica delle immagini. Per rendere più semplice visualizzare tutti gli embrioni per ogni condizione, è stata scritta una macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), che assembla tutti gli embrioni da una determinata condizione in un unico stack tiff e array immagini luminose e colore di proiezione massima intensità ( RGB) sovrapposizioni, affiancate, per ogni embrione. I metodi sono stati convalidati usandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale dopo aver abbattuto 40 geni di sviluppo descritti in precedenza in una coppia di ceppi fluorescenti personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave dello strato di germinale specifiche e morfogenesi^10,11. Insieme, il protocollo di imaging embrionale semi-alto e gli strumenti di elaborazione delle immagini consentiranno esperimenti con numero di campioni più elevato e sforzi di screening su larga scala volti a comprendere i processi di sviluppo. Inoltre, questi ceppi forniranno anche un mezzo efficiente per esaminare gli effetti delle perturbazioni molecolari sull'embriogenesi.

Protocollo

1. Preparazione di C. elegans Embrioni per l'imaging semi-alto a velocità effettiva

NOT: L'obiettivo di questa parte del protocollo è quello di caricare una popolazione di embrioni C. elegans semi-sincronizzati (da 2 a 8 celle), sezionati da ceppi di pennarelli adatti (Figura 2), in una piastra di 384 pozzetti con fondo di vetro per l'imaging. Anche altri formati di lamiere potrebbero funzionare, ma le 384 lastre di pozzo sono preferite perché le piccole dimensioni del pozzo limitano la diffusione degli embrioni in un'area relativamente piccola, il che facilita l'identificazione di campi contenenti embrioni multipli per l'imaging time-lapse. La sincronizzazione approssimativa degli embrioni garantisce che l'intero decorso dello sviluppo venga catturato per ciascuno degli embrioni in un campo.

1. Preparare 5-10 mL di 0,1 mg/mL di anetico tetramisole (TMHC) anestetico sciolto nel mezzo M9 freddo ghiaccio (0,45 M Na₂HPO_4x7H2O, 0.11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH₄Cl) da utilizzare durante l'uso durante dissezione e imaging. Questo supporto include un anestetico per garantire che le larve tratteggiate in movimento non interrompano l'imaging degli embrioni nelle fasi precedenti dello sviluppo.
   NOT: Se si utilizzano gli strumenti di ritaglio e visualizzazione per analizzare i dati acquisiti utilizzando i metodi standard di montaggio del pad agarose, passare alla sezione 3 di seguito.
2. Aliquota 70 -L della soluzione preparata in singoli pozzi di una piastra di 384 pozzetti con uno per ogni condizione; evitare le due file esterne della piastra per evitare effetti di bordo.
   NOT: È utile mascherare i pozzi circostanti utilizzando un foglio di lastra PCR adesivo (vedere l'esempio nella Figura 1D) questo conserva pozzi adiacenti per esperimenti futuri e rende più facile individuare pozzi appropriati al microscopio di dissezione. Una volta che la soluzione è aliquota, tenere la piastra e la soluzione rimanente sul ghiaccio per tutta la dissezione.
3. Generare pipettatori bocca per il trasferimento di embrioni dal vetrino depressione (dove gli ermafroditi gravidi sono sezionati) ai pozzi. Tirare i pipet capillari (25-L calibrati pipet) su una fiamma e rompersi per generare un'estremità conica fine(Figura 1D). È necessario un pipet per condizione per prevenire la contaminazione incrociata; scartare pipet dopo l'uso.
4. Utilizzare una pinzetta fine per trasferire 10 adulti gravidi a 10 adulti gravidi sotto un mirino di dissezione in 150 -L della soluzione TMHC ghiacciata su uno scivolo di depressione per ogni condizione. Utilizzando le pinzette e un bisturi, sezionare i vermi per rilasciare gli embrioni.
5. Caricare un tubo capillare tirato nell'attacco dell'aspiratore incluso con i pipettai e un tubo per trasferire tutti gli embrioni da 2 a 8 celle in un pozzo individuale della piastra preparata (Figura 1D). Evitare di trasferire embrioni in fase avanzata e detriti di dissezione. Esaminare sotto un ambito di dissezione e se sono presenti aggregati di embrioni, pipet bocca su e giù o toccare ciuffi di embrioni con punta del pipet per disperdersi.
   NOT: Per evitare la contaminazione incrociata, pulire l'attrezzatura di dissezione e utilizzare un nuovo tubo bocca durante lo spostamento tra le condizioni. Conservare la piastra sul ghiaccio tra le dissezioni.
6. Una volta che i vermi di tutte le condizioni sono stati sezionati e gli embrioni posizionati nel loro pozzo appropriato, girare la piastra 384-pozzetto per 1 min a 600 x g per risolvere gli embrioni.
7. Pulire il fondo della piastra con una salvietta imbevuta di etanolo per rimuovere eventuali residui e posizionare la piastra su un microscopio confocale dotato di un supporto a piastre in un ambiente a temperatura controllata.
   NOT: I passaggi che seguono illustrano in dettaglio questo metodo utilizzando l'impostazione del lab. modificare le condizioni di acquisizione in base alle esigenze e alle attrezzature sperimentali. Qui, una scatola scanner confocale dotata di un disco rotante Nipkow doppio potenziato microlens, una fotocamera EM-CCD 512 x 512, una fotocamera auto-XY-Stage ad alta precisione (risoluzione designata 0,1 m) e il controllo motorizzato dell'asse z (risoluzione designata 0,1 m). Questo sistema è conservato in una stanza di 16 gradi centigradi, che mantiene la temperatura del microscopio tra i 21 e i 23 gradi centigradi durante l'imaging notturno.
8. Per identificare i campi con embrioni adatti, eseguire una pre-scansione di ogni pozzo utilizzando un obiettivo 10x 0.4 NA e un software di imaging adatto. I campi più ottimali conterranno più di un embrione in fase iniziale che si trova nello stesso piano focale degli altri embrioni e idealmente avranno un contatto minimo tra embrioni adiacenti. Contrassegnare le posizioni delle regioni adatte.
9. Per selezionare i campi di imaging, passare all'obiettivo 60x e regolare il piano focale in ogni visita punto per sezionere in modo appropriato gli embrioni. 1–4 campi per pozzo sono immagine, per un totale di 50 campi in 14 pozzi, e ogni campo può contenere da uno a cinque embrioni. Complessivamente, da 4 a 15 embrioni vengono selezionati da ogni condizione per l'imaging ad alta risoluzione.
   NOT: Una variabile chiave in questa fase è l'uso di olio sufficiente; posizionare l'olio sull'obiettivo, visitando i punti in ogni pozzo per stendere l'olio intorno alla superficie di tutti i pozzi e quindi applicare un ulteriore goccio di olio all'obiettivo prima della selezione dei campi.
10. Immagina i campi selezionati utilizzando un obiettivo 60x 1.35 NA per acquisire sezioni di 18 z a intervalli di 2 m ogni 20 min per 10 h. Le condizioni di imaging che utilizzano i ceppi di reporter a strato germinale e morfogenesi sono le seguenti: campo luminoso, potenza del 90%, 25 ms, 20% di guadagno; 488 nm, 100% di potenza, 200 ms, 60% di guadagno; 568 nm, 45% di potenza, 150 ms, 60% di guadagno.
11. Una volta completata l'imaging, valutare la letalità embrionale eseguendo un basso ingrandimento (10x 0,4 NA obiettivo) di una scansione completa del campo luminoso da 20 a 24 h dopo l'inizio dell'imaging notturno.

2. Punteggio di letalità embrionale

1. Utilizzando i campi scansionati 10x post-esecuzione, valutare la letalità embrionale e i difetti larvali contando i vermi covati e gli embrioni non tratteggiati per ogni pozzo.
2. Ottenere embrioni come letali. Escludere gli embrioni arrestati da uno a quattro stadi da un numero di letalità, poiché i giovani embrioni sezionati a volte non riescono a completare la formazione del guscio d'uovo (se la meiosi II non è ancora completa) e i difetti di permeabilità possono portare a complicazioni osmotiche durante i primi due Divisioni.
3. Punteggio vermi parzialmente schiusi o completamente schiusi con morfologia del corpo o difetti comportamentali, come dumpy o paralizzato, come 'larva anormale'.

3. Ritaglio automatico (Figura 3A)

NOT: Il software è ospitato in due posizioni: (1) zenodo ospita una versione user-friendly del software¹² che non richiede alcuna esperienza di programmazione. (2) Github contiene il codice sorgente per il nostro embryoCropUI.py e screenCrop.py software¹³, che richiedono competenza con Python. Le istruzioni dettagliate per il download e il funzionamento di entrambe le versioni del programma sono disponibili di seguito.

1. Ritaglio automatico con versione eseguibile embryoCropUI (versione user friendly)
   1. Per utilizzare il programma embryoCropUI, scaricare prima il programma da .enodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Scarica la versione in formato MacOS o Windows del programma (si noti che la versione MacOS richiede MacOS X10.11 o superiore).
      2. Scaricare il file di istruzioni (GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx), che fornisce istruzioni dettagliate per il test e l'utilizzo del programma embryoCropUI.
      3. Scaricare test_files.zip per verificare se il programma funziona correttamente sulla piattaforma (vedere le istruzioni).
   2. Una volta scaricato, decomprimere e navigare per trovarel'eseguibile embryoCropUI (... Fare doppio clic per avviare (o scegliere 'apri con' terminale) ed eseguire l'eseguibile embryoCropUI.
   3. L'eseguibile GUI ritaglia un campo visivo 4D alla volta. Nell'angolo in alto a sinistra, selezionare il pulsante Apri per caricare il campo specifico da ritagliare (multitiff). Se si ritaglia una serie tiff, con più dimensioni (ad esempio, z, tempo, canale), caricare solo la prima immagine della serie all'interno della cartella (una serie tiff per cartella).
   4. Una volta caricate le immagini, specificare le seguenti informazioni: numero di sezioni z, (z), numero di punti temporali (T), numero di canali (C), il canale che corrisponde a DIC o brightfield (primo, secondo, 2 e così via).
   5. Selezionare l'elaborazione aggiuntiva da eseguire sulle immagini. Il programma offre la correzione della deriva, la sottrazione in background e la correzione dell'attenuazione.
   6. Specificare i parametri per Topologia in background e Correzione attenuazione per guidare le attività di elaborazione nel prompt GUI. Per Sottrazione in background, definire la dimensione della feature più grande per riflettere la dimensione del segnale significativo; questa dimensione della funzione non deve essere considerata come sfondo e deve essere un valore numerico dispari. Immettere un valore compreso tra 0 e 1 per Correzione attenuazione. Il valore Correzione attenuazione riflette la percentuale dell'intensità originale che rimane alla profondità più lontana dell'oggetto che si sta immagine.
      NOT: La sottrazione in background e la correzione dell'attenuazione devono essere eseguite insieme.
   7. Specificare l'ordine di raccolta delle immagini (ad esempio, channel-z-time (czt) o z-channel-time (zct)).
   8. Specificare i micron per pixel per le immagini in base alla fotocamera utilizzata.
      NOT: Se le dimensioni in pixel non sono definite correttamente, si verificherà un ritaglio di immagine scadente.
   9. Selezionare Esegui nell'angolo in basso a sinistra. Una nuova sottocartella denominata "crop" verrà creata nello stesso percorso della cartella non ritagliata; le versioni ritagliate verranno salvate in questa posizione. A seconda delle dimensioni del file, il ritaglio dovrebbe essere completato in pochi secondi a minuti.
2. Ritaglio automatico con screenCrop.py (versione batch alternativa alla GUI embryoCrop descritta sopra;Solo utenti esperti di Python)^10,13
   1. Per utilizzare screenCrop.py, la versione software Python per il ritaglio di set di dati più grandi in formato batch, clonare o scaricare il codice sorgente da Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Leggere le istruzioni per la configurazione di un ambiente virtuale appropriato e seguire il sistema di denominazione dei file descritto; entrambi dettagliati nel file README nel repository Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Una volta che le variabili ambientali e le convenzioni di denominazione sono state stabilite correttamente, aprire parameters.py e screenCrop.py in un editor di scelta.
   4. Per modificare i parametri regolabili senza toccare il codice sorgente, modificare il file parameters.py.
      NOTA: è anche possibile modificare direttamente i parametri all'interno dell'intestazione di screenCrop.py.
      1. Se si utilizza il file di configurazione parameters.py, modificare l'impostazione use_configure su True. Se si utilizza la modifica diretta all'interno di screenCrop.py, lasciare l'impostazione use_configure su False.
      2. Individuare le seguenti informazioni all'interno del file parameters.py e apportare le modifiche necessarie ai parametri di imaging desiderati e alla struttura dei file:
         1. loadFolder (riga 9): passare all'unità in cui sono memorizzati i file (ad es.D://,
         2. data (riga 7): passare alla cartella contenente i file per la sessione di imaging. Questa operazione viene definita "Nome cartella dell'esperimento" nel file di monitoraggio CSV (vedere le istruzioni).
         3. trackingFile (riga 11): consente di passare al percorso del file CSV in cui sono memorizzate le informazioni sull'esperimento.
         4. z (linea 13): impostare come numero di piani z.
         5. nT (linea14): impostare come numero di punti temporali.
         6. nWells (riga 19): Impostare come numero di pozze utilizzate.
         7. pointVisits (linea 20): impostare come numero massimo di visite a punti (per pozzo).
         8. Nella riga 10 trovare la posizione attualmente occupata da 'CV1000/' e immettere la cartella esterna utilizzata nel percorso del file. Per evitare problemi, utilizzare la convenzione seguente: 'XXXXXXX/'.
         9. Nella riga 12 immettere un percorso di file valido per l'archiviazione dei dati delle proporzioni per i dati ritagliati.
         10. Nelle righe 15, 16, 17 e 18 immettere True/False per verificare se le immagini vengono sottoposte all'elaborazione seguente:
             1. Immettere True o False per la correzione della deriva sulla riga 15.
             2. Immettere True o False per lo sfondo sottrarre sulla riga 16. Le dimensioni delle entità geografiche devono essere determinate empiricamente per diversi ceppi di marcatori e dimensioni dei pixel. Nella configurazione qui, la dimensione della funzione è stata definita come 41 per la deformazione Germ-Layer e 201 per la deformazione Morphogenesis. La sottrazione in background deve essere eseguita in combinazione con la correzione dell'attenuazione.
             3. Immettere True o False per la correzione dell'attenuazione sulla riga 17.
             4. Ingresso True o False per la rotazione posteriore anteriore sulla linea 18.
   5. Una volta apportate tutte le modifiche, è possibile iniziare il ritaglio. A tale scopo, passare a screenCrop.py e selezionare l'icona di riproduzione nella barra degli strumenti, nel menu a discesa selezionare Esegui come > Python Run.
   6. Poiché il ritaglio può richiedere diverse ore per un set di dati di grandi dimensioni (50 visite 18 z passaggi, 3 canali, 31 timepoint), tenere traccia dello stato di avanzamento del ritaglio nella finestra della console. Una volta completato il ritaglio, una piccola finestra mostrerà le anteprime delle immagini ritagliate prima di salvare. Per ogni immagine ci sono 3 opzioni:
      1. Salva: Premere la barra spaziatrice per salvare l'immagine se l'immagine viene ritagliata correttamente senza aree di interesse tagliate.
      2. X: Premere X se l'immagine sembra avere aree di interesse tagliate; l'immagine verrà salvata con una X davanti al nome per separarla dalle altre immagini.
      3. Elimina: Premere D per eliminare l'immagine ritagliata se l'immagine non viene ritagliata correttamente o se l'embrione non è soddisfacente.
         NOTA: le immagini verranno salvate in una sottocartella denominata "Rifilato" nella cartella di caricamento (definita nella riga 9 del programma).

4. Visualizzazione (Figura 4)

NOTA: OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12 è una macro ImageJ che creerà un file tiff facile da visualizzare da tutte le immagini per una deformazione e una condizione specifiche. È necessaria l'installazione di FIJI/ImageJ^14,15. Questa macro viene eseguita in base alla nostra struttura di file; dovrà essere modificato per funzionare con altre strutture di file. Una guida alla struttura corretta dei file e la descrizione dettagliata di considerazioni importanti sono disponibili alla fine del file GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx nel repository. Si prega di leggere queste istruzioni completamente prima di imaging per nome e struttura correttamente i file per interfacciarsi meglio con questa macro. Per riferimento, la struttura della posizione dei file è simile alla seguente:For reference, our file location structure looks like this:
Identificatore univoco delle cifre ,,.tif , n. #_C #_Z #F .
ad esempio, : : : cropped EMBD0001_GLS , Emb1_EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_C1.tif

1. Scaricare OpenandCombine_embsV2 e GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx da .enodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Preparare le seguenti informazioni:
   -La posizione in cui sono memorizzate le cartelle delle immagini (dopo il ritaglio).
   -I nomi delle cartelle dell'immagine per le condizioni specifiche da elaborare (ad esempio, EMBD0002). Questo è indicato come "Target" nell'esempio precedente
   -Un identificatore univoco alfanumerico di 15 cifre specifico di un determinato esperimento notturno: questo identificatore è il nome della cartella di acquisizione dei dati (ad esempio, 20140402T140154) e l'identificatore univoco è incorporato nel singolo nome di file tiff (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_'01_C1) per ogni embrione di immagine in quel giorno. La macro utilizza questo identificatore per verificare la presenza di embrioni acquisiti nella stessa data e può assemblare condizioni ripetute, con date separate, in file ImageJ separati.
3. Aprire ImageJ e trascinare il file della macro OpenandCombine_embsV2.ijm, sulla barra ImmagineJ oppure aprire direttamente la macro.
4. Una volta aperta la macro, individuare le righe 3 e 4. Inserire le informazioni raccolte nella sezione 4.2 in base ai seguenti passaggi:
   1. Nella riga 3 (RNAL), immettere il nome di destinazione per le immagini da elaborare. Immettere ogni destinazione nella struttura seguente newArray("XXXXXXXX/"); includere le citazioni. Per eseguire più condizioni contemporaneamente, separare con una virgola e mantenere tutti i nomi di destinazione all'interno della parentesi (ad esempio, newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. Nella riga 4 (data), immettere l'identificatore univoco alfanumerico di 15 cifre nelle virgolette, ad esempio newArray("20140402T140154").
5. Premere Esegui nella parte inferiore sinistra della finestra della macro. Apparirà una finestra che avvierà un prompt per passare alla cartella esterna contenente le cartelle di immagini ritagliate (specificate in 4.4.1).
6. Una volta selezionata, apparirà un'altra finestra, che permetterà la specifica dei parametri di imaging.
   1. Immettere il numero di canali, il numero di sezioni, la dimensione del carattere per il testo utilizzato nell'etichettatura delle immagini compilate e il colore per ciascuno dei canali.
   2. Controllare on/off auto a contrasto in tutti i canali.
7. Una volta specificati tutti i parametri, fare clic su OK nella parte inferiore della finestra. Il file composito inizierà ad assemblarsi; questo richiederà diversi minuti, per condizione, per completare.
8. Una volta completato, rivedere i file che vengono lasciati aperti se lo si desidera. Essi possono essere chiusi senza salvare, come la macro ha già salvato i file in una cartella appena creata che è denominato nel modo seguente: il nome della cartella esterna (specificato nel prompt della sezione 4.5) - "-fiji-processed-output" (cioè, cropped-fiji-processed-output-EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Risultati

Una sfida significativa nel caratterizzare l'effetto delle perturbazioni molecolari sullo sviluppo embrionale di C. elegans è che ci vogliono circa 10 h per gli embrioni per progredire dalla prima scissione alla fine dell'allungamento a 20 .¹⁶. Un metodo semi-alto in cui grandi coorti di embrioni possono essere imagete simultaneamente è utile per gli eventi su questa scala temporale perché consente l'imaging di più condizioni in parallelo con una dimensione sufficiente dell'ensemble p...

Discussione

Questo lavoro descrive una suite di strumenti e metodi che sono stati sviluppati per consentire sforzi su larga scala per profilare la funzione dei geni nello sviluppo embrionale in C. elegans. Il nostro metodo semi-alto-velocità consente l'imaging 3D time-lapse dello sviluppo embrionale a 20 minuti di risoluzione per 80-100 embrioni in un unico esperimento. Sebbene questo protocollo possa essere adattato per l'uso con qualsiasi ceppo o ceppo di marcatori desiderato, questo lavoro dimostra il potenziale del met...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832