Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di formare insiemi di motori molecolari sulle nanostrutture di origami del DNA e osservare la motilità dell'insieme utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna.

Abstract

I motori citoscheletrici sono responsabili di un'ampia varietà di funzioni nelle celle eucariotiche, tra cui mitosi, trasporto merci, motilità cellulare e altri. Molte di queste funzioni richiedono motori per operare in generale. Nonostante la ricchezza di conoscenze sui meccanismi dei singoli motori citoscheletrici, si sa relativamente meno sui meccanismi e sui comportamenti emergenti degli insiemi motori, tra cui esempi di cambiamenti nella processizia e nella velocità dell'insieme con modifica del numero del motore, della posizione e della configurazione. La nanotecnologia del DNA strutturale, e la tecnica specifica degli origami del DNA, consentono la costruzione molecolare di architetture ben definite di insiemi motori. La forma delle strutture di carico così come il tipo, il numero e il posizionamento dei motori sulla struttura possono essere tutti controllati. Qui, forniamo protocolli dettagliati per la produzione di questi insiemi e osservandoli utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna. Anche se queste tecniche sono state specificamente applicate per i motori citoscheletrici, i metodi sono generalizzabili ad altre proteine che si assemblano in complessi per svolgere i loro compiti. Nel complesso, il metodo degli origami del DNA per la creazione di insiemi ben definiti di proteine motorie fornisce un potente strumento per sezionare i meccanismi che portano a un comportamento motile emergente.

Introduzione

La dineina e la cinesia sono proteine motorie citoscheletriche responsabili di una miriade di funzioni nelle cellule eucariotiche¹. Convertendo l'energia chimica dell'idrolisi ATP in lavoro produttivo, questi motori traslocano sui microtubuli per trasportare e distribuire vari carichi intracellulari. Si coordinano anche nei massicci riarrangiamenti intracellulari associati alla mitosi, dove esibiscono forze orchestrate che contribuiscono al posizionamento e alla separazione dei cromosomi. I saggi strutturali, biochimici e biofisici, comprese le osservazioni su singola molecola, hanno rivelato i meccanismi di questi motori a livello individuale (ben esaminati nei lavori precedenti^2,3,4). Tuttavia, molti dei compiti dei motori richiedono loro di lavorare in piccoli gruppi di motori simili e misti. Comparativamente meno si intende i meccanismi che coordinano l'attività e la motilità emergente finale di questi insiemi^5,6. Questa lacuna di conoscenze è dovuta, in parte, alla difficoltà di creare insiemi con caratteristiche controllabili, come il tipo di motore e il numero di copia. Nell'ultimo decennio, le tecniche di costruzione molecolare degli origami di DNA sono state impiegate per risolvere questo problema. Per i motori basati su microtubuli, alcuni esempi di queste indagini includono osservazioni a singola molecola di insiemi di dineeina citoplasmica-1^7,8,9, dineina intraflagellare¹¹, vari motori kinesin^12,13, e miscele di dine e kinesins^7,14,15. Qui, forniamo dettagli sulla purificazione e l'etichettatura oligonucleotide dei motori da lievito^{7,16,17,18,19,20}, il piegamento e purificazione degli origami di DNA segmentato con conformità regolabile⁸e l'imaging dei motori di lievito che prospettano le strutture del telaio^7,18.

Costruire insiemi motori per l'osservazione in vitro a singola molecola richiede tre sforzi primari. Il primo è l'espressione, la purificazione e l'etichettatura dei costrutti motori adatti per l'attaccamento agli origami di DNA. Il secondo è la produzione e la purificazione di strutture definite di origami di DNA (spesso chiamato "telaio"). E la terza è la coniugazione dei motori alla struttura del telaio seguita dall'osservazione utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF). Qui, forniamo protocolli stabiliti per questo processo per motori ricombinanti a base di microtubuli purificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. Sono stati studiati insiemi motori basati su origami di DNA utilizzando sia kinesin ariente¹⁵ che dynein^7,8,18 costrutti prodotti in questo sistema di espressione del lievito^{16 ,17,18,19}. Questo protocollo è valido per questi costrutti, dato che sono controllati dal promotore indotto da galactose, e fusi agli stessi tag proteici per la purificazione (linker proteasete TEV) e per la coniugazione dell'oligo del DNA (SNAPtag).

Ceppi di lievito specifici producono costrutti motori specifici. Ad esempio, la dineina utilizzata per studiare il ruolo della conformità del carico è stata purificata dal ceppo RPY1084^7,8. In generale, i ceppi contenenti costrutti motori con le opportune modifiche genetiche per l'espressione e la purificazione possono essere richiesti ai laboratori dopo aver pubblicato l'uso di tali motori. I costrutti con nuovi attributi come mutazioni o tag possono essere realizzati utilizzando tecniche genetiche ricombinanti, come la trasformazione acetato di litio²¹ e i kit commerciali. Sono stati pubblicati protocolli dettagliati per la creazione di proteine motorie modificate nel lievito per studi su singole molecole¹⁹. Oltre ai motori fusi al SNAPtag, le oligo utilizzate per etichettare i motori devono essere coniugate al substrato SNAP, benzylguanine (BG); Protocolli pubblicati in precedenza descrivono la formazione e la purificazione dei coniugi BG-oligo¹⁸. La strategia globale qui descritta è stata impiegata anche per motori basati su actin (vedi lavori precedenti per gli esempi^22,23,24) e motori purificati da altri organismi e sistemi di espressione (vedi precedenti funziona per gli esempi^{7,9,10,11,12,13,14}).

I microtubuli polimerizzati (MT) vengono utilizzati in questi esperimenti in due diverse procedure. La purificazione dell'affinità MT dei motori funzionali richiede MT che non sono etichettati con altri gruppi funzionali, mentre l'analisi motilità motor-ensemble TIRF richiede MT etichettati con biotina e fluorofori. In tutti i casi, le MT sono stabilizzate con taxol per prevenire la denaturazione. Il passaggio di purificazione dell'affinità MT viene utilizzato per rimuovere tutti i motori non motile con un'elevata affinità MT, in quanto questi motori possono alterare la motilità dell'insieme se coniugati a un telaio. Durante questo processo, i motori attivi dislegano le MT e rimangono in soluzione, mentre i motori a legame stretto girano verso il basso nel pellet MT. Questo aiuta a garantire che tutti i motori sul telaio provengono da una popolazione attiva.

Una varietà di strutture di origami di DNA sono stati utilizzati per studiare gli insiemi motori citoscheletrici. Con l'aumentare della comprensione meccanicistica del trasporto di insiemi, le strutture di origami del DNA impiegate negli esperimenti sono cresciute in complessità. In linea di principio, qualsiasi struttura potrebbe essere adattata a questo scopo a condizione che venga modificata per includere siti di fissaggio del DNA a filamento singolo per motori e fluorofori. Specifici progetti e attributi del telaio possono essere utili per sondare particolari domande sul comportamento emergente dei motori incui. Ad esempio, le aste rigide sono state utilizzate per sviluppare una conoscenza fondamentale di come il numero di copie influenzi il trasporto da parte di squadre di dine e kinesins^7,15,18e piattaforme 2D sono state utilizzate per studiare l'ensemble di miosina navigazione delle reti actin²². Strutture con flessibilità variabile o regolabile sono state utilizzate per comprendere i ruoli di accoppiamento elastico tra motori e per sondare come la sincronizzazione passo influisce sulla sincronizzazione influisce sulla motilità^8,24. Più recentemente, le strutture sferiche vengono utilizzate per ottenere informazioni su come i vincoli geometrici alla rilegatura del motore influenzano la dinamica della motilità²⁵.

In questo protocollo, offriamo passaggi specifici per esperimenti di ensemble su telai segmentati con rigidità variabile. I siti di legame sullo chassis sono a volte indicati come "maniglie", mentre le sequenze di DNA complementari che legano queste maniglie sono chiamate "antihandle". Il numero di motori su questi telai è determinato da quali segmenti contengono punti metallici estesi con complementarità all'oligo antihandle sui motori con etichetta oligo. L'utilizzo di sequenze di maniglie diverse su segmenti diversi consente di associare diversi tipi di motori a posizioni specifiche sullo chassis. Il telaio qui dettagliato è composto da 7 segmenti rigidi sequenziali, ciascuno composto da 12 eliche di DNA a doppio filamento disposte in 2 anelli concentrici⁸. I segmenti rigidi contengono le maniglie del motore e sono collegati attraverso regioni che possono essere sia DNA a filamento singolo flessibile o DNA a doppio filamento rigido, a seconda dell'assenza o della presenza, rispettivamente, di graffette "linker". La conformità della struttura del telaio è quindi determinata dalla presenza o dall'assenza di questi elementi di base "linker". Vedere i rapporti precedenti per ulteriori dettagli e specifiche sequenze di DNA⁸. Inoltre, è possibile utilizzare più metodi per purificare lo chassis²⁶. Il metodo di centrifugazione del gradiente di glicerolo di tasso-zonale²⁷ è descritto qui.

Protocollo

1. Crescita, espressione e raccolta di proteine motorie controllate da un promotore indotto da galactose

1. Utilizzando un piatto di coltura lievito-peptone-dextrose (YPD) e un bastone sterile inoculante, striscia desiderata ceppo di lievito congelato e incubare per 3-4 giorni a 30 .
2. Giorno 1 della crescita culturale: nel pomeriggio, aggiungere 10 mL di media di cultura YP con 2% di decaforo a un tubo di coltura del vetro di 1" di diametro e inocularlo con una singola colonia dal piatto. Crescere in un tamburo a rulli a rotazione rapida a 30 gradi durante la notte.
3. Giorno 2: Nel pomeriggio, trasferire i 10 mL di cultura a un flacone da 250 mL contenente 50 mL di supporti di coltura YP con 2% raffinose. Incubare per una notte a 30 gradi centigradi agitando a 250 giri al rinfusa su uno shaker orbitale.
4. Giorno 3: Nel pomeriggio, trasferire i 60 mL di cultura a un pallone da 3 L contenente 1 L di supporti di coltura YP con 2% di galactose. Incubare per una notte a 30 gradi centigradi agitando a 250 giri al rinfusa su uno shaker orbitale.
5. Giorno 4: A partire dalla mattina, monitorare la densità ottica (OD) della coltura a 600 nm ogni 2 h. Quando la coltura è tra un OD 1.5 e 2, continuare con i seguenti passaggi per raccogliere le cellule. La raccolta al di fuori di questo intervallo di OD può ridurre la resa a causa dei bassi conteggi delle cellule prima dell'OD 1.5 o della quiescenza cellulare e della degradazione delle proteine al di sopra dell'OD 2.
6. Decant la coltura cellulare in bottiglie centrifuga e girare a 6200 x g a 4 gradi centigradi per 8 min. Versare il supernatante e scartare.
7. Risospendere il pellet cellulare nella bottiglia con H₂O a doppia distillazione (ddH₂O).
8. Girare le cellule a 6200 x g a 4 gradi centigradi per 8 min. Versare il supernatante e scartare.
9. A seconda della viscosità del pellet cellulare, aggiungere fino a 2 mL di ddH₂O per creare un fluido di soluzione sufficiente per il pipettaggio.
10. Utilizzando un controller di pipetta motorizzato dotato di una pipetta da 10 mL, eroga lentamente il liquame cellulare in azoto liquido una goccia alla volta. Questo produrrà pellet congelati di cellule di lievito.
11. Conservare le celle congelate a -80 gradi centigradi fino a quando non sono pronte per la purifica.

2. Purificazione delle proteine motorie dalle cellule di lievito

1. La lisi cellulare e l'estrazione di proteine solubili
   1. Preparare 1 mL di una soluzione fresca di 0,1 M PMSF in etanolo puro. Attendere di aggiungere il PMSF ai buffer acquosi in quanto è instabile in acqua; inoltre, evitare l'esposizione all'acqua fino a 20 min (l'emivita approssimativa di PMSF in acqua) di utilizzo.
   2. Preparare 50 mL di 4x lisi buffer sul ghiaccio con integratori dal brodo 5x di tampone di lisi, ma non aggiungere PMSF fino a poco prima che il buffer viene applicato al pellet lievito.
   3. Macinare i pellet di lievito congelato con azoto liquido in una polvere fine con un macinino da caffè di tipo lama che è stato pre-raffreddato con azoto liquido.
      NOTA: Questa estrazione di proteine inizia in genere con il pellet cellulare raccolto da 2 L di coltura di lievito. La quantità iniziale di coltura del lievito può essere regolata verso l'alto o verso il basso con regolazioni commisurate ai volumi di perline IgG e oligodi DNA nei passaggi 2.2.2 e 2.3.1 di seguito.
   4. Aliquota 15 mL del buffer di lisi 4x con DTT e Mg-ATP sul ghiaccio e aggiungere PMSF al buffer per ottenere una concentrazione finale di 2 mM, completando la preparazione del buffer di lisi 4x con integratori.
   5. Raccogliere la polvere di lievito in un bicchiere di vetro pre-raffreddato da 100 mL sul ghiaccio. Aggiungere un piccolo volume del buffer di lisi 4x con integratori nella polvere in modo che la concentrazione finale del buffer non superi 1x. In genere, aggiungere 1,5 mL del buffer per ogni 10 mL di lievito in polvere.
   6. Scongelare rapidamente la polvere alla fase liquida mettendo il becher in un bagno d'acqua a 37 gradi con agitazione costante utilizzando una spatola.
   7. Riposizionare il becher di lisalate sul ghiaccio subito dopo lo scongelamento, stimare il volume di lisato utilizzando un tubo conico da 50 mL e aggiungere più buffer di lisi 4x con integratori in modo che la concentrazione finale del buffer sia di 1x. Tipicamente, 2 L di coltura lievito produce un totale di 25-35 mL di lisadi contenenti 1x buffer di lisi.
   8. Distribuire uniformemente il lisato per centrifugare le bottiglie sul ghiaccio. Bilanciare con attenzione le bottiglie in una differenza di massa non superiore a 0,01 g tra ogni coppia, assicurandosi che ogni bottiglia sia superiore al volume minimo necessario per evitare il collasso della bottiglia. Centrifuga a 290.000 dollari x g per 25 min a 4 gradi centigradi.
   9. Raccogliere il supernatante contenente proteine solubili in un tubo conico da 50 mL sul ghiaccio e scartare il pellet contenente detriti cellulari e grandi organelli. Evitare di raccogliere parti torbide del supernatore, in quanto possono intasare la colonna del flusso di gravità utilizzata nei passaggi successivi. Risparmia 10 l del super-valore supernatale per l'analisi SDS-PAGE.
2. Purificazione dell'affinità IgG
   1. Durante lo spin sopra, impostare una colonna di cromatografia a gravità-flusso sul ghiaccio o in una stanza fredda.
   2. Trasferire alla colonna una punta di pipetta P-1000 tagliata con una lama di rasoio per ingrandire il diametro della porta di ingresso. Se purificando più o meno di 2 L di pellet di coltura cellulare, regolare proporzionalmente il volume del liquame di perline, con un volume minimo di 100 l.
   3. Aliquota altri 15 mL del buffer di lisi 4x con DTT e Mg-ATP e aggiungere PMSF al buffer per ottenere una concentrazione finale di 2mM. Diluire il tampone 4x sul ghiaccio a 1x aggiungendo ddH₂O.
   4. Lavare le perline 2x con 5 mL di 1x tampone di lisi con integratori.
   5. Risospendere le perline in 200 - L di 1x tampone di lisi con integratori.
   6. Aggiungere la sospensione del tallone all'estratto di proteine ottenuto dalla centrifugazione e incubare la miscela a 4 gradi centigradi per 1 h con una leggera rotazione.
   7. Durante l'incubazione, preparare 25 mL del buffer di lavaggio (ricetta dettagliata nella tabella 1)sul ghiaccio e 50 mL di 1x tampone TEV (ricetta dettagliata nella tabella 1) sul ghiaccio.
   8. Dopo l'incubazione di 1 h, filtrare la miscela di lisa-perline sul ghiaccio o nella stanza fredda attraverso la stessa colonna di cromatografia utilizzata al passo 2.2.2 sopra. Risparmiare 10 l del flow-through per l'analisi SDS-PAGE.
   9. Lavare le restanti perline legate al motore sul ghiaccio 2x con 5 mL di tampone di lavaggio. Risparmiare 10 l del primo lavaggio per l'analisi SDS-PAGE.
   10. Lavare le perline sul ghiaccio una volta con 5 mL di 1x tampone TEV. Consentire allo svuotamento completo del buffer dalla colonna.
3. Etichettatura con oligonucleotidi di DNA e scissione TEV
   1. Rimuovere la colonna cromatografia dall'impostazione e capovolfare la parte inferiore della colonna. All'interno della stessa colonna, incubare le perle motorie con 100-L di 1x tampone TEV contenente 10-20 M del BG-oligo purificato a temperatura ambiente (RT) per 10-15 min. Se purificando più o meno di 2 L di pellet a coltura cellulare, regolate il volume del tampone 1x TEV e purificate le oligo BG in modo proporzionale. Aumentare il tempo di incubazione secondo le istruzioni del produttore, se necessario, per aumentare la resa e il tasso di etichettatura del motore, ma essere consapevoli del fatto che tempi di incubazione più lunghi possono anche aumentare la percentuale di motori disfunzionali a causa della denaturazione proteica a RT.
   2. Respendere delicatamente le perline ogni minuto dell'incubazione.
   3. Lavare le perline motorie etichettate 4x con 4 mL di 1x tampone TEV utilizzando la stessa colonna di cromatografia e l'impostazione di prima. Lasciare che il lavaggio finale dreni completamente dalla colonna.
   4. Capovolgere la parte inferiore della colonna, risospendere le perle motorie in non più di 200 luna di 1x TEV Buffer, e trasferire a un tubo di microcentrifuga rotondo-fondo da 2 mL.
   5. Incubare le sospensioni con 0,3 unità di proteasi TEV per la miscela di perline motorie a 16 gradi centigradi per 1 h con rotazioni delicate. Il tubo deve essere montato in modo da ridurre al minimo la superficie totale del tubo con cui le perline entrano in contatto.
   6. Centrifugare il tubo in una microcentrifuga a 21.130 x g per 30 s in una stanza fredda per concentrare la miscela sul fondo del tubo.
   7. Sempre nella stanza fredda, utilizzare una punta di pipetta P-1000 tagliata per trasferire la miscela in una colonna di spin e centrifugare a 21.130 x g per 30 s. Raccogliere il filtrato contenente i motori purificati TEV. La proteasi TEV sarà nel filtrato così come i motori.
   8. Risparmiare 10 l del filtrato per l'analisi SDS-PAGE. Aliquota in volumi di 2 gradi per esperimenti TIRF o 50 per la purificazione dell'affinità dei microtubuli. Flash congelare le aliquote in azoto liquido e conservare a -80 gradi centigradi.
   9. Risospendere le perline rimanenti nel filtro nel buffer TEV 1x per l'analisi SDS-PAGE. Utilizzare lo stesso volume di 1x buffer TEV del passaggio 2.3.4 precedente.

3. Polimerizzazione dei microtubuli (MT)

1. Preparazione di miscele di tubuline per i saggi TIRF
   1. In una stanza fredda, sciogliere separatamente la tubulina liofilizzata di ogni tipo (tubulina bovina non etichettata, tubulina biotinylata e tubulina fluorescente) nel buffer di ricostituzione (ricetta dettagliata nella tabella 2) per fare una concentrazione finale di 10 mg/mL. Lasciare in ghiaccio un po' di tempo.
      1. Mescolare i seguenti componenti e lasciare sardo sul ghiaccio per 10 min nella stanza fredda (le concentrazioni finali sono indicate tra parentesi): 18 L di tubulina bovina (8,9 mg/mL), 2 -L di tubulina biomutata (0,9 mg/mL) e 2 -L di tubulina fluorescente (0,9 mg/mL).
   2. Preparare 3 aliquote della miscela di tubulina e congelare il flash in azoto liquido. Conservare le miscele a -80 gradi centigradi.
2. Preparazione della tubulina per la purificazione dell'affinità MT dei motori
   1. In una stanza fredda, sciogliere tubulina bovina lofilizzata nel tampone di ricostituzione per fare una concentrazione finale di 10 mg/mL. Lasciare in ghiaccio un po' di tempo.
   2. Preparare 3 aliquote della miscela di tubulina e congelare il flash in azoto liquido. Conservare le miscele a -80 gradi centigradi.
3. Polimerizzazione della tubulina in MT
   1. Togliere un'aliquota di tubulina di 3 lbulina dal congelatore a -80 gradi e scongelare molto rapidamente e brevemente la fase liquida tenendo il fondo del tubo. Mettere immediatamente sul ghiaccio e incubare per almeno 3 min.
   2. Delicatamente strato 3 - L di 2x mix di polimerizzazione (ricetta dettagliata nella tabella 2) sulla parte superiore della soluzione tubulina. Mescolare facendo scorrere delicatamente il tubo, ma non mescolare con il pipetting, in quanto le forze di taglio possono interrompere la nucleazione e l'allungamento della MT.
   3. Incubare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min.
   4. Delicatamente strato 6 -L di RT 1x BRB80 con integratori (ricetta dettagliata nella tabella 2) sulla parte superiore e mescolare sfarfallando. Non mescolare con il pipettaggio.
   5. Incubare la miscela a 37 gradi centigradi per almeno 10 min.
   6. Procedere alla purificazione dell'affinità MT, o se si fanno i saggi TIRF, incubare MT al buio alla RT durante la notte per formare MT più lunghi.
   7. Conservare le MT polimerizzate per settimane al buio presso RT.

4. Purificazione dell'affinità di microtubuli (MT)

1. Rimozione di tubuline non polimerizzizzate mediante centrifugazione
   1. Mescolare i seguenti componenti per creare un cuscino glicerolo 60%: 1x BRB80 (senza integratori; ricetta descritta nella tabella 2), 20 -M di taxol (sciolto in DMSO), 1 mM DTT e 60% glicerol.
   2. Trasferire 60 -L del cuscino glicerolo in un tubo di ultracentrifuga. Delicatamente strato 12 -L delle MT non etichettate polimerizzato in precedenza sopra il cuscino. Per evitare la taglio delle TM, trasferirle utilizzando una punta di pipetta tagliata.
   3. Centrifugare la miscela a 97.300 x g a 22 gradi centigradi per 15 min. Dopo lo spin, le tubuline in eccesso rimangono nello strato liquido superiore, mentre le MT formano un pellet nella parte inferiore. Contrassegnare il bordo esterno del tubo prima dello spin per aiutare a localizzare il pellet, in quanto il pellet potrebbe non essere visibile ad occhio nudo.
   4. Rimuovere con cura lo strato liquido (12 dollari luna) sopra il cuscino di glicerolo e risparmiare 10 l per l'analisi SDS-PAGE.
   5. Sciacquare delicatamente l'interfaccia tra lo strato liquido e il cuscino con 20 . Rimuovere e scartare il risciacquo di 20 L.
   6. Rimuovere con cura il cuscino di glicerolo (60 dollari ll) e risparmiare 10 -L per l'analisi SDS-PAGE. Fare attenzione a non disturbare il pellet MT.
   7. Sciacquare delicatamente il pellet con 60-L di 1x BRB80 con integratori (ricetta dettagliata nella tabella 2). Fare attenzione a non disturbare il pellet MT. Eliminare la soluzione di risciacquo.
   8. Risospendere il pellet MT in 24 gradi ll di tampone di lisi integrato con Taxol (ricetta dettagliata nella tabella 3)utilizzando una punta di pipetta tagliata.
2. Purificazione dei motori funzionali mediante cromatografia di affinità basata su MT
   1. Togliere dal congelatore -80C due aliquote di 50 ll di motori purificati dal lievito e scongelare rapidamente la fase liquida. Mettere immediatamente sul ghiaccio.
   2. Aggiungere i seguenti componenti a un nuovo tubo a ultracentrifuge nell'ordine indicato e incubare la miscela a RT per 10 min: (1) 100 l dei motori purificati dal lievito, (2) 29 l di 5x atP/Taxol mix (ricetta dettagliata nel tavolo 3), quindi (3) 12 - L di MT purificati trance svasato con una punta pipetta taglio.
   3. Centrifugare la miscela a 97.300 x g e 22 gradi centigradi per 15 min. Dopo lo spin, i motori funzionali rimangono nel supernatante, e le MT formano un pellet, insieme ai motori non funzionali legati a loro.
   4. Raccogliere il supernatante, lampeggiare congelare in 2 - l'aliquota, e conservare a -80 gradi centigradi.
   5. Risparmia 10 l del super-valore supernatale per l'analisi SDS-PAGE. Risospendere il pellet in 141 - L di 1x BRB80 anche per l'analisi SDS-PAGE. Utilizzare gli standard proteici, come l'actina, per creare una curva standard per quantificare la concentrazione dei motori purificati come precedentemente dettagliato¹⁷.
   6. Utilizzare queste informazioni di concentrazione quando si coniugano i motori al telaio nel passaggio 6.1.3.

5. Produzione di telaio origami di DNA segmentato

1. Formazione del telaio
   1. Ordinare gli oligonucleotidi di base elencati nelle tabelle precedentemente pubblicate⁸ in 96 piatti ben bagnati a 250 M nel buffer di Tris, o asciugarli e poi risospende a 250 M con tampone Tris.
   2. Creare un pool di graffette di base mescolando 5 luna di ogni graffetta di base (vedere la tabella S1 in Driller-Colangelo 2016⁸).
   3. Creare un pool di elementi di base del linker combinando 5 luna di ogni graffetta del linker (vedere la tabella di base del linker in Driller-Colangelo 2016⁸).
   4. Creare una pozza di punti metallici di rilegatura mescolando 5 luna di ogni maniglia fluoroforo (vedere tavolo a manico fluoroforo in Driller-Colangelo 2016⁸).
   5. Mescolare 50 reazioni di piegatura con i seguenti componenti: 1x tampone pieghevole; 100 nM 8064 impalcatura; 600 nM piscina di base di base; 600 nM piscina di base fluoroforo; 9 filamenti di fluoroforo m (vedi tavolo antihandle fluoroforo in Driller-Colangelo 2016⁸); per ogni sito di rilegatura del motore, 4,2 - fili di maniglia estesa o 600 nM fili senza maniglie come desiderato (vedi maniglia del motore / tabella graffette antihandle in Driller-Colangelo 2016⁸); 600 linker nM come desiderato⁸; ulteriori 6 mM MgCl₂; e acqua.
   6. Piegare in un ciclore termico utilizzando il seguente programma: Riscaldamento rapido a 80 gradi centigradi, raffreddamento a incrementi di un singolo grado a 65 gradi centigradi su 75 min, quindi raffreddamento aggiuntivo in incrementi di singolo grado a 30 gradi centigradi su 17,5 h.
   7. Qualità di piegatura di analisi su un gel di agarose del 2% in buffer TBE 0,5x (vedi tabella 4 per ricetta) integrato con 11 mM MgCl₂ e macchia di gel di DNA (vedi Tabella dei materiali). Eseguire gel in buffer 0.5x TBE integrato con 11 mMMgCl₂ a 70 V per 60-90 min.
   8. Immaginare il gel utilizzando condizioni adatte alla macchia del gel di DNA utilizzata al punto 5.1.7.
2. Purificazione del telaio
   1. Nel tardo pomeriggio del giorno prima della purificazione, creare gradienti di glicerolo sovrapponendo delicatamente 80 gradi ciascuno a 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% e 15% glicerolo in 1x buffer di piegatura origami in un tubo di centrifugio (vedere tabella 4 per ricetta). I limiti tra i livelli devono essere leggermente visibili.
   2. Incubare le pendenze a 4 gradi centigradi durante la notte.
   3. La mattina successiva, aggiungere il 45% glicerolo nel buffer pieghevole 1x origami alla soluzione del telaio piegato per una concentrazione finale del 10% glicerolo. Mescolare delicatamente e strato sulla parte superiore del gradiente nel tubo di centrifuga.
   4. Girare la pendenza con il telaio a 243.000 x g per 130 min a 4 gradi centigradi.
   5. Raccogliere 50 frazioni dal tubo in direzione dall'alto verso il basso.
   6. Gettare un gel di agarose del 2% nel buffer TBE 0,5x integrato con 11 mM MgCl₂ e macchia di gel di DNA.
   7. Caricare 5 -L di ogni frazione sul gel e far funzionare il gel in buffer TBE da 0,5 m integrato con 11 mM MgCl₂ per 90-120 min a 70 V. Gel Run in un bagno d'acqua ghiacciata o in una stanza fredda per evitare un eccessivo riscaldamento e la successiva denaturazione delle strutture del telaio.
   8. Immaginare il gel utilizzando condizioni adatte alla macchia del gel di DNA utilizzata al punto 5.2.6.
   9. Seleziona le frazioni per gli esperimenti futuri che presentano strutture monomeriche ben piegate prive di graffette non incorporate.
   10. Concentrazioni quantificate di frazioni selezionate utilizzando metodi spettroscopici appropriati, come l'assorbimento UV a 260 nm. Utilizzare queste informazioni di concentrazione quando si coniugano i motori al telaio nel passaggio 6.1.3.

6. Fare camere di saggio slide

1. Fare una camera di svelto di saggio attaccando due strisce di nastro adesivo a due lati su uno scivolo di vetro e mettendo un coperchio sulla parte superiore. La camera è lo spazio stretto inserito tra il coperchio e lo scivolo di vetro, fiancheggiato dalle due strisce di nastro. Figura 1 illustra la camera di saggio.
2. Quando si prepara il vetrino con soluzioni, utilizzare una pipetta per far scorrere qualsiasi fluido nella camera da un lato e utilizzare una striscia di carta da filtro per raccogliere il flusso del fluido dall'altro lato.

7. Attesa tiRF di motilità motor-ensemble

1. Coniugazione di motori al telaio del DNA
   1. Sul ghiaccio, preparare fresco 1 mL ciascuno dei BRB80 integrati con DTT, buffer di lisi con tristi e buffer di lisi con tristi (ricette descritte nella tabella 5). Trasferire 200 l di ogni tampone su un tubo RT.
   2. Sempre sul ghiaccio, utilizzare il buffer di lisi integrato con caseina fredda per preparare l'energia 4x e le miscele di scavenger 4x (ricette descritte nella tabella 5).
   3. Incubare 10 l di motori purificati da 300 nM con 5 di 10 nM di telaio di DNA sul ghiaccio per 15-30 min. Queste concentrazioni di motori hanno dimostrato di saturare i siti di rilegatura del motore del telaio per questo tempo di incubazione.
      NOTA: l'occupazione del motore non è al 100%, probabilmente a causa di graffette maniglie stochasticamente mancanti nelle singole strutture del telaio^8,28.
   4. Durante l'incubazione, diluire le MT con etichetta biotina e fluoroforo 100 volte con il buffer di lisi di lisi integrato con RT Taxol e preparare una resina di filtrazione in gel appropriata per la cromatografia della colonna di esclusione delle dimensioni seguendo la procedura descritta di seguito.
2. Rimozione dei motori in eccesso dai coniugi del telaio motore si confermano le dimensioni della cromatografia a colonne di esclusione
   1. In un tubo conico da 50 mL, lavare 5 mL della resina di filtrazione del gel 2x con 45 mL di ddH₂O. Per ogni lavaggio, mescolare la resina con acqua nel tubo conico e far girare la miscela a 460 x g per 1 min. Scartare il supernatante e salvare la resina.
   2. Lavare la resina 2x con 45 mL di 1x buffer di lisi (ricetta descritta nella tabella 5) utilizzando lo stesso metodo descritto in precedenza.
   3. Risospendere la resina lavata nel buffer di lisi 1x in un rapporto 1:1, in modo che la resina diventi un liquame di tipo 50% nel buffer. La resina lavata può essere conservata a 4 gradi centigradi per almeno 1 mese.
   4. Trasferire 800 l della sospensione di resina in una colonna di spin. Scolare il buffer in eccesso dal flusso di gravità per 5 min. Rimuovere il buffer rimanente con un giro di 2 s a 1.000 x g. Il volume finale della resina dovrebbe essere di circa 350-400 gradi.
   5. Diluire il mix motore-telaio con il buffer di lisi integrato in caseina-Taxol ad un volume finale di 50 -L. Trasferire il mix diluito nella colonna di spin imbostata con resina.
   6. Centrifugare la colonna di spin a 1.000 x g per 6 s (questa volta è comprensivo del tempo di accelerazione e decelerazione). Raccogliere i coniugati puro telaio motore salvando la filtrata e scartare la colonna che mantiene i motori in eccesso.
3. Preparazione dei vetrini per l'imaging
   1. Flusso 13 - L di 1 mg/mL biotinylated albumina siero bovino (biotina-BSA) in una camera di analisi slide. Incubare per 2 min per consentire la legatura di BSA al vetro.
   2. Lavare la camera 2x con 20 o L del BRB80 integrato RT DTT scorrendo nel buffer su un lato della camera e allontanando il liquido in eccesso dall'altro lato utilizzando una striscia di carta da filtro.
   3. Flusso in 20 - L di 0,5 mg/mL di streptavidin. Incubare per 2 min per consentire il legame di streptavidina alla biotina sulla BSA.
   4. Lavare la camera 2x con 20 gradi l del tampone di lisi integrato con RT Taxol.
   5. Scorrono delicatamente in 20 -L delle MT diluite con una punta di pipetta tagliata. Incubare per 2 min per consentire il legame tra la biotina su MT e streptavidin.
   6. Lavare 2x con 20 l del buffer di lisi con supplemento di caseina-Taxol. Incubare per 2 min per consentire alla caseina di permeare l'intera camera.
   7. Diluire il coniugato del telaio motore purificato da 5 x a 10 volte a condizioni a singola molecola (10-100 pM) con il buffer di lisi integrato con caseina fredda. Mescolare i seguenti componenti per produrre una miscela finale del telaio motore: 10 litri della diluizione motore-telaio, 5 luna di 4x miscela di energia e 5 - L of 4x scavenger mix.
   8. Scorrere in 20 - L della miscela finale del telaio motore alla camera di scorrimento di analisi e procedere alla microscopia TIRF.
4. Imaging e acquisizione dei dati
   1. Immagine immediata della diapositiva con un microscopio TIRF. In genere, ogni diapositiva rimane utilizzabile per un numero compreso tra 30 e 60 min.
   2. Acquisire un'immagine fissa nel canale MT e un filmato nel canale dello chassis. Per i motori di questo protocollo, 10 min filmati con una frequenza fotogrammi di 0,5 fps e un tempo di esposizione di 200 ms sono appropriati.
   3. Dal filmato chassis, generare un kymograph per ogni MT in ImageJ o un software di elaborazione di immagini simile²⁹. Analizzare le velocità e le lunghezze di corsa degli insiemi motore-telaio misurando le pendenze e le distanze orizzontali delle rampe sul kymograph³⁰.

Risultati

Le purificazioni di successo dei motori e delle strutture del telaio sono state svolte dall'elettroforesi in gel. L'analisi SDS-PAGE ha confermato la riuscita estrazione della dineina dal lievito (Figura 2), poiché il filtrato finale raccolto al punto 2.3.7 ha mostrato una banda chiara e nitida alla posizione di 350 kDa. Come previsto, questa banda didina era assente dal flusso e lavaggio che ha rimosso le proteine indesiderate, e le perline da cui la dinein...

Discussione

Le tecniche di costruzione molecolare degli origami del DNA forniscono un modo unico per costruire insiemi motori con architetture definite, numeri motori e tipi, consentendo studi su come il comportamento emergente deriva da specifiche configurazioni motorie³¹. Mentre gli studi strutturali e cellulari continuano a chiarire esempi di motori citoscheletrici che lavorano in team, le tecniche per isolare e studiare i meccanismi biofisici e biochimici dei motori negli insiemi stanno crescendo in utili...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure	Cytoskeleton.com	T333P-A
Biotin-BSA	Sigma	A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm	Beckman Coulter	356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm	Beckman Coulter	355603
Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL	GE Healthcare	17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty	Bio-Rad	7326204EDU
P8064 Scaffold	Tilibit	2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550
ProTev Protease	Promega	V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser	amazon.com	N/A
Sephacryl S-500 HR	GE Healthcare	17061310
Streptavidin	Thermo Fisher	434302
SYBR Safe DNA stain	Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton.com	T240-B
Tubulin, HiLyte 647	Cytoskeleton.com	TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes	Beckman Coulter	344090