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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un approccio di imaging per la determinazione dello stato oligomerico oligomerico medio degli oligomeri mEGFP-tagged-receptor indotti dal legame del ligando nella membrana plasmatica delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B).

Abstract

Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, pochi metodi sono applicabili per rilevare gli eventi di clustering e misurare il grado di clustering. Qui, descriviamo un approccio imaging per determinare lo stato oligomerico medio degli omocomplessi del recettore mEGFP nella membrana delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B). N&B è un metodo simile alla spettroscopia fluorescenza-correlazione (FCS) e all'istogramma di conteggio dei fotoni (PCH), che si basano sull'analisi statistica delle fluttuazioni dell'intensità della fluorescenza dei fluorofori che si diffondono dentro e fuori da un'illuminazione volume durante un periodo di osservazione. In particolare, N&B è una semplificazione del PCH per ottenere informazioni sul numero medio di proteine nelle miscele oligomeriche. Le ampiezze di fluttuazione dell'intensità sono descritte dalla luminosità molecolare del fluoroforo e dal numero medio di fluorofori all'interno del volume di illuminazione. Pertanto, N&B considera solo il primo e il secondo momento della distribuzione dell'ampiezza, vale a dire l'intensità media e la varianza. Questo è, allo stesso tempo, la forza e la debolezza del metodo. Poiché vengono considerati solo due momenti, N&B non è in grado di determinare la frazione molare degli oligomeri sconosciuti in una miscela, ma stima solo lo stato medio di oligomerizzazione della miscela. Tuttavia, può essere applicato a serie temporali relativamente piccole (rispetto ad altri metodi di momento) di immagini di cellule vive su base pixel per pixel, semplicemente monitorando le fluttuazioni temporali dell'intensità della fluorescenza. Riduce il tempo effettivo per pixel a pochi microsecondi, consentendo l'acquisizione nell'intervallo di tempo di secondi a millisecondi, che è necessario per l'oligomerizzazione rapida cinetica. Infine, è possibile esplorare grandi aree cellulari e compartimenti subcellulari.

Introduzione

Descriviamo un approccio di imaging TIRF-N&B (Total Internal Reflection Fluorescence-Number and Brightness) per determinare lo stato oligomerico medio delle molecole recettoriali alla membrana plasmatica delle cellule vive, con l'obiettivo di collegare l'assemblaggio del recettore funzione biologica delle proteine (Figura 1).

Al momento del legame del ligando extracellulare, i recettori avviano la trasduzione del segnale intracellulare a seconda della loro conformazione, oligomerizzazione, potenziali co-recettori e composizione della membrana. Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, riconosciuto come un evento chiave nella segnalazione cellulare1,2,3,4,5,6, 7, pochi metodi possono rilevare gli eventi di clustering e misurare il grado di clustering sperimentalmente8,9. Il volume confocale (x,y : 300 nm, z ) non è sufficientemente risolto per dimostrare l'interazione molecolare e la stoichiometria, anche dopo l'ottimizzazione da parte degli algoritmi di ripristino delle immagini10. La composizione di sottounità di oligomeri proteici non può essere risolta su base puramente spaziale anche con metodi di super-risoluzione a risoluzione x,y di 20-70 nm come PALM11, STORM12e STED13. Inoltre, la loro risoluzione temporale (nell'ordine dei minuti per immagine) non può seguire la cinetica nell'intervallo di secondi. Lo sbiancamento a passo di singola molecola risolve la stoichiometria degli oligomeri proteici solo se sono immobili14.

Uno dei metodi più versatili per misurare la densità e l'oligomerizzazione delle proteine fluorescenti all'interno di singole immagini è l'analisi della distribuzione dell'intensità spaziale (SpIDA), che si basa sul campionamento spaziale. È applicabile sia alle cellule chimicamente fisse che vive e consente l'analisi di diverse regioni di interesse della cellula contemporaneamente utilizzando la microscopia a fluorescenza standard15. In alternativa, i metodi del momento, come la spettroscopia fluorescenza-correlazione (FCS)16, l'istogramma di conteggio fotone (PCH)17e il numero e la luminosità (N&B)18,19, sono adatti per oligomeri quantitativi Misure. Questi metodi analizzano le fluttuazioni di intensità della fluorescenza che possono essere osservate nel tempo in cui i fluorofori si diffondono dentro e fuori da un volume di illuminazione. Le ampiezze delle fluttuazioni di intensità possono essere descritte in modo univoco dalla luminosità molecolare del fluoroforo e dal numero medio di fluorofori (n) all'interno del volume di illuminazione17 (Figura 2). Tipicamente, il coefficiente di diffusione dei fluorofori e il numero medio di molecole (inversamente correlate al valore G(0) all'interno del volume di illuminazione possono essere ottenuti da FCS20. Tuttavia, poiché il tempo di diffusione si adatta solo alla radice cubica della massa, la FCS non è sufficientemente sensibile per rilevare i cambiamenti nella massa molecolare21. In pratica, fcS monocolore non è in grado di rilevare la dimerizzazione dei recettori della membrana. PCH risolve con precisione le miscele di diversi oligomeri. Utilizzando più di due momenti della distribuzione dell'ampiezza, rileva molecole di luminosità diversa che occupano lo stesso volume di illuminazione. Scansione FCS22 e sviluppi, come l'interessante coppia-correlazione di luminosità molecolare (pCOMB) approccio23, introdotto per estendere la gamma di applicabilità dei metodi di correlazione della fluorescenza nei sistemi biologici24 , rimangono metodi a punto singolo privi della capacità di misurazioni veloci in un'ampia area di una cella, richiedendo molte osservazioni consecutive ad ogni pixel e l'acquisizione di dati nell'ordine di secondi.

N&B è una versione semplificata di PCH che considera solo il primo e il secondo momento dell'ampiezza della distribuzione della fluorescenza, vale a dire l'intensità media, , e la varianza,2 (Figura 2)18,19 e, per questo motivo, non può determinare la frazione molare di oligomeri sconosciuti in una miscela, ma stima solo lo stato medio di oligomerizzazione della miscela. Tuttavia, N&B ha il vantaggio di lavorare con serie temporali relativamente più piccole di immagini di cellule vive rispetto al PCH su base pixel per pixel, semplicemente monitorando le fluttuazioni al momento dell'intensità di fluorescenza. Poiché N&B riduce il tempo per pixel a pochi microsecondi, può seguire cinetiche di oligomerizzazione veloce su grandi aree cellulari, consentendo l'acquisizione di immagini su una scala temporale di secondi nella microscopia a scansione raster (ad esempio, confocale, 2 fotone) e millisecondi microscopia basata su fotocamera (ad es. TIRFM).

Diversi rapporti hanno dimostrato la capacità di N&B di quantificare il numero di sottounità nei cluster proteici mediante l'imaging di regioni cellulari estese. Gli ammassi di Paxillin-EGFP sono stati rilevati nei siti di adesione nelle cellule CHO-K125e l'aggregazione intracellulare del peptide patogeno Httex1p è stata descritta nelle cellule COS-726. N&B è stato richiesto per seguire l'oligomerizzazione guidata dal ligando del recettore ErbB27e l'effetto del ligand FGF21 su Klothob (KLB) e FGFR1c nelle celle HeLa28. La combinazione di imaging TIRF e analisi N&B è stata utilizzata per dimostrare che la dinamina-2 è principalmente tetramerica in tutta la membrana cellulare29. Abbiamo applicato N&B sia alla scansione raster che alle immagini TIRF per dimostrare la dimerizzazione guidata dal ligando dei recettori della membrana cellulare uPAR e FGFR130,31.

I metodi di correlazione della fluorescenza, come N&B, FCS e PCH, si basano sull'idea che in un volume aperto il numero di occupazione delle particelle segua una distribuzione di Poisson. Poiché possono essere rilevati solo i fotoni emettiti dai fluorofori, il valore medio per un'intensità di fluorescenza misurata rispetto al tempo in un pixel dell'immagine, figure-introduction-7044 è il prodotto del numero medio di fluorofori nel volume di illuminazione, n, e la loro luminosità molecolare,17:

figure-introduction-7264

dove il numero di fotoni emessi per unità di tempo (convenzionalmente al secondo) per molecola quando la molecola è al centro del volume di illuminazione.

La luminosità è una proprietà di ogni fluoroforo in una data acquisizione impostata, mentre l'intensità è la somma di tutti i contributi di tutti i fluorofori. Nei concorsi biologici, la luminosità aumenterà con l'aumento del numero di fluorofori che fluttuano insieme, fornendo informazioni sullo stato di oligomerizzazione della proteina fluorescente. Le ampiezze di fluttuazione in un determinato pixel vengono misuratedalla varianza del segnale di fluorescenza,

figure-introduction-8029

Dove la media del quadrato figure-introduction-8133 di intensità, , e il figure-introduction-8209 quadrato della media di intensità, , vengono calcolati dai singoli valori di intensità in ogni pixel di ogni fotogramma:

figure-introduction-8413

dove K è il numero di fotogrammi totali nella serie temporale. Sperimentalmente, è necessario calcolare per l'intera serie di immagini la varianza che descrive la dispersione dei singoli valori di intensità in ogni pixel di una singola immagine intorno al valore di intensità media. La varianza include tutte le fluttuazioni di origini diverse. In una prima approssimazione, la varianza dovuta alla diffazione delle particelle di fusione nel volume di illuminazione,20, può essere separata dalla varianza a causa del rumore del rivelatore,2d. Le due varianze sono indipendenti; pertanto, la varianza totale è data dalla loro somma:

figure-introduction-9203

La varianza, dovuta alle fluttuazioni molecolari all'esterno e all'esterno del volume di rilevamento, dipende linearmente dalla luminosità e dall'intensità molecolari:

figure-introduction-9476

Riorganizzazione di eq. 6 in base a eq. 1:

figure-introduction-9624

Secondo il concetto tipico nella spettroscopia di correlazione a fluorescenza, l'equazione 7 afferma che la varianza dovuta al numero di fluttuazioni dipende dal quadrato della luminosità della particella.

Quindi, la varianza dovuta alle fluttuazioni del rivelatore è una funzione lineare dell'intensità rilevata, partendo dal presupposto che il rivelatore sia azionato al di sotto del suo limite di saturazione19:

figure-introduction-10196

Nel caso dei rilevatori di conteggio dei fotoni unvalore 1 e c.0, quindi la varianza del rivelatore è uguale all'intensità media:

figure-introduction-10450

Per applicare questi concetti alle misurazioni reali nelle cellule vive, Gratton e colleghi18 definiscono la luminosità apparente, B, per ogni pixel come rapporto della varianza rispetto all'intensità media:

figure-introduction-10788

B è il parametro misurato sperimentalmente. In questo lavoro, le immagini di serie temporali dei recettori FGFR1 nella membrana plasmatica delle cellule HeLa vengono catturate dalla microscopia TIRF e la luminosità media apparente, B, è determinata dall'analisi N&B. Quindi, dopo l'aggiunta di FGF2, serie temporali consecutive vengono catturate per seguire i cambiamenti nell'auto-assemblaggio delle molecole recettoriali nella superficie della membrana dopo la stimolazione del recettore con il ligando canonico.

Tuttavia, poiché il rilevatore del microscopio TIRF è una telecamera EMCCD, l'espressione per la luminosità apparente deve essere modificata come19:

figure-introduction-11611

dove offset è l'offset di intensità dell'elettronica di rilevamento che è una caratteristica delle impostazioni del rivelatore. La varianza e l'intensità media per un rilevatore analogico sono date rispettivamente da:

figure-introduction-11945

dove G è il guadagno analogico nei livelli digitali (DL/fotoni), S, i livelli digitali per fotone19, è dato dalla pendenza di un'intensità rispetto al grafico di varianza per una fonte di luce con intensità costante (senza fluttuazioni temporali). Il fattore z è correlato alla forma del volume di rilevamento dei pixel. Secondo Hassler et al.32, il fattore z è pari a 0,3 per l'imaging TIRF che lavora al massimo guadagno della telecamera di rilevamento19. I parametri offset, S e G sono caratteristiche della fotocamera e del microscopio. La luminosità apparente, B, si ottiene riorganizzando eq. 11 secondo eq. 12 e 13:

figure-introduction-12756

Dal punto di torto dal punto di toesa dal punto di tordo, è una funzione complessa dell'intensità del laser e dell'efficienza di rilevamento del sistema. Tuttavia, dal momento che B/S dipende linearmente da , è importante solo determinare il valore relativo di , per una determinata modalità di rilevamento:

figure-introduction-13170

dove è proporzionale a " s" . Tuttavia, una calibrazione viene eseguita utilizzando un riferimento interno.

Protocollo

1. Preparazione del campione

  1. Primo giorno. Cellule di semi HeLa in mezzo completo ad una concentrazione di 100.000-200,000 cellule / mL in piatti in vetro-fondo. Seme 6-8 replicare piatti.
    NOT: In questo esempio, il mezzo è integrato con il 10% di calore inattivato Siero Fetale Bovino (FBS), 1 mM di pirata di sodio, 100 U/100 g di penicillina/streptomicina. Diversi piatti replicare sono preparati.
  2. Giorno 2-3. Quando le cellule sono a sub-confluenza, trasfect metà dei piatti con il plasmide proteico e la seconda metà con plasmidi di riferimento (monomero e dimero), in mezzo senza siero.
    NOT: La trasfezione è fatta in mezzo senza siero integrato con antibiotici, 0.1% Bovine Serum Albumin e 25 mM HEPES tampone, senza Phenol Red.
  3. Giorno 3-4. Verificare che le cellule trasfette siano aderenti al fondo dei piatti e che la membrana cellulare sia fluorescente. Scartare i piatti con cellule incolte o con fluorescenza molto bassa.
    NOT: Non lasciare che le cellule crescano troppo. Le celle devono essere ben distribuite ed essere aderenti all'area di vetro del piatto (Figura 1A). I piatti di fondo in vetro prerivestito possono essere utilizzati per favorire l'adesione cellulare. La coltura cellulare viene testata per la contaminazione da micoplasma prima di qualsiasi esperimento. In questo esempio, le cellule vengono trafettate con un plasmid (A207K)mEGFP-FGFR1 e le celle di riferimento vengono transinfettate con un ploto GPI-(A207K)mEGFP e gpI-(A207K)mEGFP-(A207K)mEGFP utilizzando protocolli standard. Per la microscopia a cellule vive, si consiglia un mezzo privo di indicatori; Viene aggiunto il buffer HEPES da 25 mM per evitare cambiamenti di pH durante l'imaging.

2. TIRF Imaging - Allineamento della linea laser e ottimizzazione dell'illuminazione TIRF

  1. Quattro ore prima dell'esperimento, attivare l'incubatrice di temperatura del microscopio a 37 gradi centigradi.
  2. Accendere il microscopio, computer e telecamere e attendere che le telecamere raggiungano la temperatura di lavoro corretta.
    NOT: La temperatura di lavoro della telecamera utilizzata in questo studio è -75 gradi centigradi.
  3. Mettere una piccola goccia di olio sull'obiettivo. Mettere in atto un piatto campione. Chiudete le porte dell'incubatrice e lasciate che la temperatura del piatto sia equilibrata (10 min).
  4. Accendere la lampada a epifluorescenza e il laser da 488 nm.
  5. Selezionare la modalità contrasto dell'epiorescenza per esplorare il campione, cercando una cella per mettere a fuoco l'oculare.
    NOT: L'uso di una lampada fluorescente per la ricerca di cellule attraverso l'oculare non è obbligatorio. Al suo posto è possibile utilizzare una linea laser adatta.
  6. Selezionare il filtro appropriato per la raccolta dell'emissione verde attraverso la telecamera al microscopio (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, o simili.
  7. Passare dalla porta oculare alla porta della fotocamera (#1 della telecamera nella Figura 1) in modalità epifluorescenza, perfezionare la messa a fuoco e passare alla modalità TIRF. Le modalità di epifluorescenza e TIRF potrebbero essere denominate con una nomenclatura diversa a seconda della marca del microscopio.
    NOT: Ci possono essere problemi di messa a fuoco o allineamento del laser se non ci sono marcatori fluorescenti all'interfaccia coverslip. Per allineare correttamente il laser (essenziale per un buon TIRF), concentrarsi sul coperchio. Spesso è molto difficile determinare se il coverslip è a fuoco. Come suggerimento, concentrati sui bordi delle celle.
  8. Attivare l'allineamento automatico seguendo le istruzioni del microscopio TIRF.
    NOT: In breve, per i passi da 2.4 a 2.8, prima trova le cellule attraverso l'oculare e concentrati su di esse, quindi invia l'emissione alla porta della telecamera del microscopio TIRF, rifocalici le cellule sullo schermo del computer al microscopio e attiva la procedura per l'allineamento laser. L'allineamento consiste nel trovare l'angolo critico in cui l'illuminazione diventa evanescente (Figura 3). I microscopi commerciali potrebbero avere protocolli di allineamento leggermente diversi e anche essere completamente automatizzati; altri potrebbero avere una piccola fotocamera per facilitare la visualizzazione delle condizioni critiche dell'angolo.
  9. Scegliere una profondità di illuminazione adatta e ottimizzare la direzione del campo evanescente (Figura 3).
    NOT: La profondità di penetrazione è mantenuta costante per tutti i controlli e campioni.

3. TIRF Imaging: Cattura della serie temporale

  1. Definire un'area di interesse (ROI) di almeno 256 x 256 pixel.
    NOT: In questa configurazione, l'acquisizione viene eseguita con la fotocamera #2 sotto un software che controlla direttamente solo la fotocamera (vedere La legenda della Figura 1).
  2. Impostare l'esposizione a 1 ms e il guadagno EM a 1.000 (questo è il fattore G in eq. 12 e 13). A tale velocità, potrebbe essere necessario regolare o aumentare la potenza del laser. Qui la potenza del laser è di 0,5 mW.
    NOT: A seconda del tipo di fotocamera e dei limiti imposti dal coefficiente di diffusione della proteina, dall'intensità della fluorescenza e dallo sfondo, i criteri generali per impostare la potenza laser non sono di saturare il rivelatore, ridurre al minimo il fotosbleaching e veloce possibile ad un ragionevole S/N. Il guadagno EM è sempre impostato al massimo della fotocamera (vedi Introduzione).
  3. Eseguire una prima sequenza di prova nelle condizioni iniziali e stimare approssimativamente il valore S/N. Le condizioni sono accettabili a S/N : 2-3 o superiore, come misurato nel primo fotogramma della prima serie temporale.
  4. Utilizzare il dispositivo di scorrimento del sistema di divisione delle emissioni che collega la telecamera #2 al microscopio per mascherare un lato dell'immagine (Figura 1B, Figura 4A-B)
    NOT: In questa configurazione viene installato un connettore di imaging multicanale sulla fotocamera #2 per consentire l'acquisizione simultanea di due immagini identiche spazialmente. Il sistema è dotato di vetrini per il montaggio di diversi filtri di emissione. Uno dei cursori monta una maschera nera per coprire un lato dell'immagine. L'area mascherata viene utilizzata per la calibrazione interna di ogni serie temporale, per determinare i parametri della telecamera (eq. 12 e 13). In questo modo non è necessaria una fase di calibrazione indipendente e, soprattutto, la calibrazione viene eseguita in parallelo all'acquisizione di ogni serie temporale. In assenza di questo sistema, la telecamera può essere calibrata applicando i protocolli pubblicati33.
  5. Selezionare l'opzione di salvataggio automatico del file della fotocamera.
  6. Avviare l'acquisizione della serie di immagini. Acquisire un minimo di 700 fotogrammi ad un rapporto S/N minimo di 2.
    NOT: Il numero di fotogrammi necessari per l'analisi dipende dalla stabilità del campione al fotosbiancamento e dalla dispersione dei dati. Pertanto, la qualità di ogni serie temporale viene valutata durante l'analisi N&B.
  7. Senza togliere il piatto dal microscopio, aggiungere il ligando.
  8. Selezionare una cella con una membrana a fluorescenza luminosa e iniziare rapidamente la prima serie temporale della corsa cinetica.
    NOT: Se l'aggiunta del ligando viene eseguita rapidamente, questa prima cattura imposta il punto - 0 tempo della cinetica ligando. Il software registra l'ora esatta dell'acquisizione.
  9. Cerca una seconda cella e acquisisci il secondo punto temporale della cinetica.
    NOT: Routine di osservazione dei punti sono disponibili in alcuni microscopi dotati di stadi motorizzati x,y,z. Questi consentono la memorizzazione di più posizioni sulla parabola cellulare, e possono aiutare a mantenere un intervallo di tempo più costante tra la serie di immagini su celle diverse.
  10. Cattura una nuova cella per ogni punto temporale della corsa cinetica.
    NOT: Dopo l'acquisizione, una cella viene parzialmente fotosbiancata e non può essere riesaminata. Per questo scopo, la cinetica si ottiene combinando serie temporali di molte celle, ognuna catturata in un punto temporale diverso.
  11. Per ogni nuovo piatto, ripetere il protocollo dal punto 2.3 al 3.9.
    NOT: Per i piatti di riferimento, aggiungere un volume del veicolo (PBS integrato con 0.01% di semastro bovino albumin) equivalente a quello utilizzato per il ligando.

4. Numero & Luminosità (N&B): Controllo qualità della serie temporale

  1. Convertire e salvare come . TIFF i file acquisiti con il software della fotocamera (file .sif in questo esempio).
  2. Importazione. FILE TIFF nella routine del software di analisi attivando il N&B graphical user interface (GUI) MATLAB.
    NOT: Qui viene utilizzata una routine N&B eseguibile Matlab personalizzata (analisi N&B presso https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Aprendo un file . TIFF, la routine genera l'immagine di intensità media, il profilo di intensità media e consente di ispezionare la serie fotogramma per fotogramma (Figura supplementare 1). Altri software sono disponibili per l'analisi N&B (ad esempio, il software SimFCS).
  3. Eliminare le serie per le quali il profilo di intensità media mostra più del 10% di fotosbiancamento, e serie in cui c'è stata un'evidente distorsione della membrana cellulare o traduzione durante l'acquisizione.
  4. Ritagliare le cornici evidentemente sfocate.
    NOT: Uno strumento di ritaglio viene implementato nella routine per eliminare singoli o più fotogrammi all'interno della serie di immagini. Questa operazione è consentita perché il tempo da fotogramma a fotogramma non è critico, mentre il tempo di perlatura in pixel (tempo di esposizione) è (vedere Discussione).
  5. Conservare solo per l'analisi serie con almeno 500 intervalli di tempo.

5. Numero e luminosità (N&B): Determinazione dei parametri della fotocamera (Offset,

  1. Attivare la fotocamera Calibratedi routine .
  2. Selezionate un'area di almeno 20 x 50 pixel nella regione di disturbo del rivelatore (Figura 4).
    NOT: La routine origina un istogramma dei valori (definito anche Digital Level, DL) e restituisce un grafico logaritmo della frequenza rispetto ai livelli digitali.
  3. Nel grafico Frequenza di registro rispetto a livello digitale, spostare il cursore rosso lineare per delimitare la parte gaussiana e la parte lineare della curva.
    NOT: Il cursore rosso divide le due sezioni della curva e attiva la routine di restituzione dell'offset, che è il centro della funzione gaussiana della risposta della fotocamera, la slittamento gaussiana e il fattore S, che è la pendenza della parte lineare dei respons della fotocamera e (Figura 4C-D).

6. Numero e luminosità (N&B): calcolo dei valori B in Regione di interesse (ROI) selezionata

  1. Attivare il tasto B.
    NOT: Questa azione genera l'immagine di intensità media (Figura 5, prima colonna) e l'immagine B in cui ogni singolo valore B è associato al pixel correlato nell'immagine (Figura supplementare 1).
  2. Applicare un raccoglimento minimo (2 2) per ridurre la dispersione dei dati e generare l'istogramma B-I(Figura 5, seconda colonna).
    NOT: L'istogramma B-I rappresenta la distribuzione dei valori B di tutti i pixel dell'immagine rispetto all'intensità dei pixel. Y - B/S; X (-figure-protocol-12703 offset)/S(Figura supplementare 1 ed eq. 11 e 15).
  3. Esaminare l'istogramma B-I utilizzando il cursore quadrato interattivo.
  4. Selezionare un ROI quadrato per l'analisi (Figura 5, terza colonna).
    NOT: Il cursore sincronizza una maschera mobile sull'immagine di intensità media, evidenziando i pixel selezionati all'interno dell'area del cursore quadrato (Figura supplementare 1). Con questa ispezione, è possibile escludere dall'analisi lo sfondo e le aree con intensità molto bassa.
  5. Generare la mappa B del ROI selezionato (Figura 5, quarta colonna).
  6. Salvare il file ASCII dei valori B associati alla selezione.
  7. Importare il file ASCII in un software grafico per calcolare la distribuzione della frequenza dei dati e ottenere il valore Medio B - S.E (Figura 5, quinta colonna).
    NOT: Se i dati sono omogenei, la distribuzione della frequenza dei valori B si avvicina a una distribuzione gaussiana.
  8. Applicare eq. 15 per figure-protocol-13923 derivare la luminosità media - figure-protocol-14004 - 1 [(conteggi/molecola) per tempo di abitare] per ogni cellula ad ogni punto temporale della corsa cinetica. Normalizzare i dati in base a:
    figure-protocol-14198
    dove figure-protocol-14256 è il valore Medio B misurato al momento "t" dopo l'aggiunta del ligando, ed figure-protocol-14382 è il valore Medio B misurato al momento di t-0 (10-20 s dopo l'aggiunta del ligando).
    NOT: La normalizzazione dei risultati consente il confronto diretto degli esperimenti che vengono effettuati in giorni diversi. Compensa le differenze nella luminosità misurata a causa della potenza del laser e delle fluttuazioni tecniche.
  9. Tracciare la luminosità media normalizzata rispetto al tempo di acquisizione per costruire la corsa cinetica (Figura 6).

Risultati

I risultati per due celle HeLa-mEGFP-FGFR1 rappresentative seminato nello stesso piatto di coltura sono mostrati nella Figura 5 e nella Tabella supplementare 1. Le due celle sono state catturate al momento 0 min (Figura 5A, superiore) e 7 min (Figura 5A, fondo) dopo l'aggiunta del ligando FGF2.

Discussione

N&B richiede diverse precauzioni nella scelta del modello di cella e della strategia di etichettatura. Può essere applicato solo alle cellule vive che rimangono aderenti stabilmente durante il tempo di acquisizione dell'immagine. Le fluttuazioni extra dovute allo spostamento rigido dell'intera cellula potrebbero essere gestite con approcci appropriati per il ripristino dell'immagine38. Tuttavia, generalmente quando una cellula si muove, anche la membrana cellulare si deforma e la deformazione del...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Il CNIC è supportato dal Ministero della Ciencia, Innovacion y Universidades e dalla Pro CNIC Foundation, ed è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Siamo inoltre sostenuti dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FEDER) "Una manera de hacer Europa". UC riconosce il sostegno dell'Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, dell'Associazione per la Ricerca Internazionale sul Cancro (ora nota come Worldwide Cancer Research) e del Ministero della Salute italiano. A.T. riconosce la "Banca banca del Monte di Lombardia" in parte sostenendo il suo lavoro con la Pv Fellowship "Progettoità Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimunSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAA7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPESGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA21063029Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX IGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10566-016Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Biowest, Nuaillé, FranceX0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, BrazilGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA1027010610% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishesMatTek, Ashland, MA, USAP35G-0.170-14-Cuncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad PrismGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cellsMillipore-Sigma ECACC, Darmstadt, GermanyCB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis softwareOxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UKThis camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routineUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spaindownload at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018bThe MathWorks, Inc. Natick, MA, USAhttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100xBiowhittaker Inc. Walkersville, MD, USALONZA 17-602Esupplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vectorUnit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, ItalyZamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vectorUnit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, SpainHellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2PeproTech EC, Ltd., London, UKLigand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCOThermoFisher Scientific113600701 mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection ReagentMirusBio LLC, Madison, WI, USAMIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA25200056
Type F Immersion liquid 10 mLLeica Microsystems, Wetzlar, Germany11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)ThermoFisher ScientificAM26180.1% supplement for medium without phenol red used for transfections

Riferimenti

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