Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

Riepilogo

Vi presentiamo un dispositivo microfluidico centricomotore a motore in grado di coltivare sferoidi cellulari. Utilizzando questo dispositivo, sferoidi di tipo cellulare singolo o multiplo potrebbe essere facilmente costati in condizioni di alta gravità.

Abstract

Una coltura tridimensionale di cellule sferoidi può ottenere risultati più utili negli esperimenti cellulari perché può simulare meglio i microambienti cellulari del corpo vivente rispetto alla coltura cellulare bidimensionale. In questo studio, abbiamo fabbricato una piattaforma di laboratorio su un CD (disco compatto) azionata a motore elettrico, chiamata sistema di coltura di sferoidi a base microfugale centrifuga , per creare sferoidi cellulari tridimensionali (3D) che implementano una forza centrifuga ad alta dimensione. Questo dispositivo può variare la velocità di rotazione per generare condizioni di gravità da 1 g a 521 x g. Il sistema CMS ha un diametro di 6 cm, ha cento micropozzi di 400 m ed è realizzato stampando con polidimetilsilosa in uno stampo in policarbonato prefatto da una macchina di controllo numerico al computer. Una parete di barriera all'ingresso del canale del sistema CMS utilizza la forza centrifuga per diffondere le cellule in modo uniforme all'interno del chip. Alla fine del canale, c'è una regione di scorrimento che permette alle cellule di entrare nei micropozzi. Come dimostrazione, gli sferoidi sono stati generati dalla monocoltura e dalla cocultura delle cellule staminali derivate dall'adiposità umana e dei fibroblasti polmonari umani in condizioni di alta gravità utilizzando il sistema. Il sistema CMS ha utilizzato un semplice schema operativo per produrre sferoidi cocoltura di varie strutture concentriche, giano e sandwich. Il sistema CMS sarà utile negli studi di biologia cellulare e ingegneria tissutale che richiedono sferoidi e coltura organoide di tipi di cellule singole o multiple.

Introduzione

È più facile simulare microambienti biologici in vivo con colture di cellule sferoidi tridimensionali (3D) che con colture cellulari bidimensionali (2D) (ad esempio, colture convenzionali di parabole di Petri) per produrre sperimentali più fisiologicamente realistici risultati¹. I metodi di formazione degli sferoidi attualmente disponibili includono la tecnica di caduta appesa², latecnica di sovrapposizione dei liquidi³, la^tecnicadi cellulosa carboxymetil bioreattori⁶. Anche se ogni metodo ha i suoi benefici, è necessario un ulteriore miglioramento della riproducibilità, della produttività e della generazione di sferoidi cocoltura. Ad esempio, mentre la tecnica microfluidica basata sulla forza magnetica⁵ è relativamente poco costosa, gli effetti dei forti campi magnetici sulle cellule viventi devono essere attentamente considerati. I benefici della cultura degli sferoidi, in particolare nello studio della differenziazione e della proliferazione delle cellule staminali mesenchymic, sono stati riportati in diversi studi^7,8,9.

Il sistema microfluidico centrifugo, noto anche come lab-on-a-CD (compact disc), è utile per controllare facilmente il fluido all'interno e sfruttare la rotazione del substrato ed è stato quindi utilizzato in applicazioni biomediche come immunoasiste¹⁰, saggi colorimetrici per rilevare marcatori biochimici¹¹, analisi dell'acido nucleico (PCR), sistemi automatizzati di analisi del sangue¹²e dispositivi microfluidici centrizici all-in-one¹³. La forza motrice che controlla il fluido è la forza centripeta creata dalla rotazione. Inoltre, più funzioni di missaggio, valving e suddivisione dei campioni possono essere eseguite semplicemente in questa singola piattaforma CD. Tuttavia, rispetto ai suddetti metodi di analisi biochimica, ci sono stati meno studi che hanno applicato piattaforme CD alle cellule di coltura, in particolare gli sferoidi¹⁴.

In questo studio, mostriamo le prestazioni del sistema di sferoidi a base microfluidica centrifuga (CMS) per monocoltura o cocultura di cellule staminali derivate da adiposi umane (hASC) e fibroblasti polmonari umani (MRC-5). Questo documento descrive in dettaglio la metodologia di ricerca del nostro gruppo¹⁵. Così, la piattaforma lab-on-a-CD di coltura sferoide può essere facilmente riprodotta. Viene presentato un sistema di generazione CMS che comprende un chip di coltura CMS, un supporto per chip, un motore DC, un supporto motore e una piattaforma rotante. Il supporto motore è stampato in 3D con acrylonitrile butadiene styrene (ABS). Il supporto del chip e la piattaforma rotante sono CNC (controllo numerico al computer) lavorati con il PC (policarbonato). La velocità di rotazione del motore è controllata da 200 a 4.500 rpm codificando un algoritmo PID (proporzionale-integrale-derivato) basato sulla modulazione larghezza-impulso. Le sue dimensioni sono 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, rendendolo facile da maneggiare. Utilizzando il sistema CMS, gli sferoidi possono essere generati in varie condizioni di gravità da 1 x g a 521 x g, quindi lo studio della promozione della differenziazione cellulare sotto alta gravità può essere esteso da cellule 2D^16,17 a 3D sferoide. La cocultura di vari tipi di cellule è anche una tecnologia chiave per imitare efficacemente l'ambiente in vivo¹⁸. Il sistema CMS può facilmente generare sferoidi monocoltura, così come sferoidi coculture di vari tipi di strutture (ad esempio, concentrico, Giano e sandwich). Il sistema CMS può essere utilizzato non solo in semplici studi sferoidi, ma anche in studi organoidi 3D, per considerare le strutture degli organi umani.

Protocollo

1. Fabbricazione di chip a base mistrali centrifuga (CMS)

1. Crea stampi per PC per gli strati superiore e inferiore del chip di coltura CMS mediante lavorazione CNC. Le dimensioni dettagliate del chip sono riportate nella Figura 1.
2. Mescolare la base PDMS e l'agente di polimerità PDMS ad un rapporto di 10:1 (w/w) per 5 min e mettere in un desiccatore per 1 h per rimuovere le bolle d'aria.
3. Dopo aver versato la miscela PDMS negli stampi del chip di coltura CMS, rimuovere le bolle d'aria per 1 h di più e curare in una camera di calore a 80 gradi centigradi per 2 h.
4. Metteteli nel detergente al plasma aspirato con le superfici da legare rivolto verso l'alto ed esposteli al plasma assistito dall'aria ad una potenza di 18 W per 30 s.
5. Legare i due strati del chip di coltura CMS e metterlo nella camera di calore a 80 gradi centigradi per 30 minuti per aumentare la forza di adesione.
6. Sterilizzare il chip di coltura CMS in uno sterilizzatore autoclave a 121 e 15 psi.

2. Preparazione delle cellule

1. Scongelare il 1 mL della fiala contenente 5 x 10⁵–1 - 10⁶ cellule hASC o MRC-5s in un bagno d'acqua a 36,5 gradi centigradi per 2 min.
2. Aggiungete 1 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) su una fiala e mescolate delicatamente con una pipetta da 1.000 ll.
3. Mettete 15 mL del DMEM preriscaldato a 36,5 gradi centigradi in una parabola Petri di 150 mm di diametro utilizzando una pipetta e aggiungete le cellule dalla fiala.
4. Dopo 1 giorno, aspirare il DMEM e sostituire con 15 mL di DMEM fresco. Successivamente, cambiare i supporti ogni 2 o 3 giorni.
5. Per staccare le cellule dalla parabola Petri, aggiungere 4 mL di prova ai piatti Petri e metterli in un'incubatrice a 36,5 gradi centigradi e il 5% di CO₂ per 4 min.

3. Formazione di sferoidi monocoltura

1. Mettere 2,5 mL di 4% (w/v) soluzione pluronica F-127 nel foro di ingresso del chip di coltura CMS (Figura 2A) durante la rotazione del chip a 500–1,000 rpm e quindi ruotare il chip a 4.000 rpm per 3 min utilizzando il sistema CMS (Figura 2B).
   NOTA: il rivestimento pluronico impedisce l'attacco cellulare alla porta di ingresso mentre il chip ruota. Assicurarsi che l'aria non sia intrappolata nei micropozzi.
2. Incubare il chip di coltura CMS riempito con soluzione pluronnica durante la notte a 36,5 gradi centigradi nel 5% di CO₂.
3. Rimuovere la soluzione pluronica, lavare la soluzione pluronnica rimanente con DMEM e asciugare il chip per 12 h su una panca pulita.
4. Aggiungere 2,5 mL di DMEM al chip di coltura CMS e ruotare il chip a 4.000 rpm per 3 min per la lunghezza dell'interno del chip.
5. Interrompere la rotazione ed estrarre 100 L di DMEM per fare spazio all'iniezione della sospensione cellulare.
6. Aggiungere 100 l di sospensioni cellulari che contengono 5 x 10⁵ hASC o 8 x 10⁵ MRC-5 tramite il pipettaggio Distribuisci uniformemente le celle conpipendo 3-5 volte per la sospensione.
7. Ruotare il chip a 3.000 giri/m per 3 min per intrappolare le cellule in ogni microwell con forza centrifuga.
   NOTA: un'eccessiva velocità di rotazione può causare l'escape cellulare attraverso fori di espulsione della soluzione.
8. Coltura le cellule per 3 giorni in incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% di umidità, e 5% CO₂, ruotando a 1.000-2.000 rpm. Cambiare la cultura media ogni giorno.

4. Formazione di sferoidi della cocultura

1. Formazione di sferoidi concentrici
   1. Aggiungere le prime celle, 2,5 x 10⁵ hASC, e ruotare il chip a 3.000 rpm. Dopo 3 min, aggiungere le seconde celle, 4 x 10⁵ MRC-5s, e ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min. Iniettare un totale di 100 - L di sospensioni cellulari tramite pipettaggio. Quando le cellule vengono iniettate, spostare la velocità di rotazione a 500-1.000 rpm.
   2. Coltura le cellule nell'incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% umidità%, e 5% CO₂ ruotando a 1.000-2.000 rpm. Gli sferoidi concentrici vengono creati entro 24 ore. Per la cultura a lungo termine, cambiare il mezzo culturale ogni giorno.
2. Formazione di Giano sferoidi
   1. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le prime celle, 2,5 x 10⁵ hASC, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
   2. Incubare il chip a 36,5 gradi centigradi, a >95% di umidità e 5% di CO₂ ruotando a 1.000-2.000 giri/min per 3 h.
   3. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti il secondo set di celle, 4 x 10⁵ MRC-5, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
   4. Coltura le cellule nell'incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% di umidità, e 5% di CO₂ ruotando a 1.000-2.000 rpm. Gli sferoidi di Giano vengono creati entro 24 ore. Per la cultura a lungo termine, cambiare il mezzo culturale ogni giorno.
3. Formazione di sandwich sferoidi
   1. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le prime celle, 1,5 x 10⁵ hASC, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
   2. Incubare il chip a 36,5 gradi centigradi, a >95% di umidità e 5% di CO₂ ruotando a 1.000-2.000 giri/min per 3 h.
   3. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le seconde celle, 3 x 10⁵ MRC-5, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
   4. Incubare il chip a 36,5 gradi centigradi, >95% di umidità% e 5% CO₂ ruotando a 1.000-2.000 rpm per 3 h.
   5. Aggiungete 100 l di sospensioni cellulari contenenti le terze celle, 1,5 x 10⁵ hASC, pipettando mentre il chip ruota a 500–1.000 giri/min. Quindi, ruotare il chip a 3.000 rpm per 3 min.
   6. Coltura le cellule nell'incubatrice a 36,5 gradi centigradi, >95% umidità%, e 5% CO₂ ruotando a 1.000-2.000 rpm. Gli sferoidi sandwich vengono creati entro 12 h. Per la cultura a lungo termine, cambiare il mezzo culturale ogni giorno.

5. Colorazione delle cellule

1. Riscaldare il colore a fluorescenza cellulare a temperatura ambiente (20 gradi centigradi).
2. Aggiungere 20 l di metilsulfossido di anidroladide (DMSO) per fiala per creare una soluzione da 1 mM.
3. Diluire la fluorescenza fino a una concentrazione di lavoro finale di 1 M utilizzando DMEM.
4. Aggiungere la fluorescenza alla sospensione cellulare e sospendere delicatamente utilizzando una pipetta.
5. Incubare 20 min a 36,5 gradi centigradi, umidità di >95% e 5% di CO₂.

Risultati

Il chip di coltura CMS di 6 cm di diametro (Figura 2) è stato realizzato con successo seguendo il protocollo di cui sopra. In primo luogo, il chip è stato fatto separatamente da uno strato superiore e uno strato inferiore e poi legato insieme da incollaggio al plasma. Gli sferoidi risultanti possono essere facilmente raccolti staccando il chip. Il canale del chip di coltura CMS comprende una porta di ingresso e regioni centrali, scorrevoli e microwell (Figura 3

Discussione

Il CMS è un sistema chiuso in cui tutte le cellule iniettate entrano nel microwell senza rifiuti, rendendolo più efficiente ed economico rispetto ai metodi convenzionali di generazione di sferoidi a base di microwell. Nel sistema CMS, il supporto viene sostituito ogni 12-24 h attraverso un foro di aspirazione progettato per rimuovere il supporto nel chip (Figura 3A). Durante il processo di aspirazione dei supporti, a malapena qualsiasi supporto fuoriesce dall'interno del microposimo a caus...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021