Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Riepilogo

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Abstract

L'ubiquitina (ubiquitina) e le modifiche post-traduzionali dipendenti (ubl) delle proteine svolgono ruoli normativi biologici fondamentali all'interno della cellula controllando la stabilità delle proteine, l'attività, le interazioni e la localizzazione intracellulare. Consentono alla cellula di rispondere ai segnali e di adattarsi ai cambiamenti nel suo ambiente. Le alterazioni all'interno di questi meccanismi possono portare a gravi situazioni patologiche come le malattie neurodegenerative e i tumori. Lo scopo della tecnica qui descritta è quello di creare profili ptMs dipendenti ub/ubls, rapidamente e con precisione, da linee cellulari coltivate. Il confronto di diversi profili ottenuti da diverse condizioni consente l'identificazione di alterazioni specifiche, come quelle indotte ad esempio da un trattamento. La trasduzione cellulare mediata Lentiviral viene eseguita per creare linee cellulari stabili che esprimono una versione a due tag (6His e Flag) del modificatore (ubiquitina o un ubl come SUMO1 o Nedd8). Queste etichette permettono la purificazione dell'ubiquitina e quindi delle proteine ubiquitinate dalle cellule. Questa operazione viene eseguita tramite un processo di purificazione in due fasi: il primo viene eseguito in condizioni di defatura utilizzando il tag 6His e il secondo in condizioni native utilizzando il tag Flag. Ciò porta ad un isolamento altamente specifico e puro delle proteine modificate che vengono successivamente identificate e semi-quantificate dalla cromatografia liquida seguita dalla tecnologia di spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). La facile analisi informatica dei dati MS utilizzando il software Excel consente la creazione di profili PTM eliminando i segnali in background. Questi profili vengono confrontati tra ogni condizione al fine di identificare alterazioni specifiche che saranno poi studiate in modo più specifico, a partire dalla loro convalida mediante tecniche di biochimica standard.

Introduzione

Il metodo qui proposto è dedicato allo studio dei PTM mediati dai membri della famiglia ubiquitina da cellule di mammiferi coltivati al fine di identificare potenziali alterazioni associate a una condizione specifica (trattamento, differenziazione, ecc.). I PTM rappresentano l'ultimo passo della regolazione delle funzioni delle proteine¹. Infatti, una volta prodotte dalla macchina traslazionale, la maggior parte se non tutte le proteine subiscono diversi tipi di PTM che modulano la loro attività, interazioni molecolari e posizione intracellulare¹. Tra le pletora di PTM sono quelli mediati dalla famiglia ubiquitina di proteine, ubiquitina stessa e tutti i tipi di ubiquitina, hanno il potenziale per regolare tutte le proteine intracellulari o parzialmente citoplasmate². Poiché sono esse stesse proteine, possono essere coniugate tra loro, formando catene omogenee ed eterogenee di topologie diverse, ciascuna associata a specifiche funzioni normative². Sono necessari strumenti per cercare di decifrare e comprendere questo complesso macchinario. Molti approcci sono stati sviluppati in tutto il mondo, con i propri vantaggi e svantaggi, e qui ne proponiamo uno con alte prestazioni adatte per le cellule coltivate.

Il vantaggio principale di questo metodo è la sua precisione. Infatti, la purezza delle proteine isolate modificate è altamente migliorata dall'uso combinatorio dei due tag (6His e Flag) e le due step-procedure e quindi è molto più selettiva di una fusione a singolo tag Ub/Ubl^3,4. La presenza del 6His tag consente un primo passo di purificazione in una condizione di denatura completamente evitando così qualsiasi co-purificazione di proteine contenenti domini di legame dell'ubiquitina o altre proteine che si legano a quelle ubiquitinate. Si tratta di un problema tecnico riscontrato da diversi altri approcci basati sulla purificazione dell'affinità dei proteomi ubiquiturati utilizzando specifici anticorpi⁵ o elementi di legame dell'ubiquitina tandem (TUBEs)⁶. È importante sottolineare che questa tecnica non è di parte a favore della purificazione di un certo tipo di ubiquitinazione, come potrebbe essere il caso per alcuni altri approcci, dal momento che sia mono e diversi tipi di poliubiquitinations sono stati identificati⁷. Di conseguenza, una volta trovata, un'alterazione dell'ubiquitazione dovrà essere studiata in maggiori dettagli da approcci biochimici standard al fine di identificare il tipo esatto di ubiquitinazione coinvolto.

Infine, un altro vantaggio tecnico di questo protocollo è l'uso di lentivirus, che crea facilmente e rapidamente linee cellulari che esprimono stabili con ragionevole livello di espressioni di modificatore con tag senza interferire con il normale comportamento cellulare.

Mentre un ruolo importante dell'onniquitazione è quello di colpire le proteine per la degradazione proteasomica, è ora noto che ha molte altre proprietà regolatorie per le proteine potenzialmente più intracellulari o parzialmente intracellulari¹. Il numero di queste funzioni è ulteriormente accresciuto dall'esistenza di molte ubiquitine come proteine, formando una famiglia di proteine che regolano quasi tutti i meccanismi cellulari¹. Le loro alterazioni possono avere un impatto drastico sulla biologia cellulare e possono condurre o partecipare a situazioni patologiche⁸, come il cancro⁹. Quindi, sono necessari strumenti per esplorare questo vasto paesaggio e identificare le alterazioni associate a una condizione patologica che potrebbe servire come nuovi bersagli terapeutici.

Questo protocollo è dedicato alle cellule in coltura poiché devono essere trasdotte per esprimere Ub/Ubl esogeno. Una volta create, queste linee cellulari stabili possono essere utilizzate per generare profili Ubl dalla coltura in 2D o 3D o xenografts, estendendo così l'orizzonte dei diversi modelli sperimentali che possono essere applicati per studiare i profili PTMs.

Protocollo

1. Generazione di linee cellulari stabili che esprimono 6His-Flag-Ubl

NOTA: Co-trasfezione di cellule HEK-293T con pCCL-6HF-Ubl, pVSVG e delta-Helper.

1. Giorno 0: Seme 293T cellule in una piastra 6-bene per ottenere 50-70% confluenza il giorno dopo.
2. Giorno 1: Co-transfett 50-70% cellule confluenti con una miscela di 1 g di pCCL-6HF-Ubl o pCCL-GFP, 1 g di pVSVG e 1 g di vettori delta-helper, utilizzando un reagente di trasfusione e un protocollo per la produzione di lentivirus lentivirus. Dopo 6 h di trasfezione, cambiare il mezzo in uno fresco corrispondente alle cellule da trasdure. Semina le cellule da tradursi in una piastra di 6 pozze al fine di ottenere una confluenza del 10-20% il giorno dopo (il giorno di inizio della trasduzione).
3. Giorno 2: 24 h dopo la trasfezione, recuperare il mezzo contenente particelle lentivirali e filtrare utilizzando filtri 0,45 m. Se necessario, aggiungere un nuovo mezzo a questo punto al fine di produrre un secondo lotto di lentivirus. Sostituire il mezzo di cellule da tradur (confluenza del 10-20%) da quello contenente lentivirus.
   NOTA: Il mezzo lentivirale può essere mantenuto a 4 gradi centigradi per diversi giorni prima della trasduzione o immagazzinato a -80 gradi centigradi per mesi.
4. Incubare le cellule con lentivirus tra 24 h a 72 h in un'incubatrice standard (37 , 5% CO₂), quindi cambiare il mezzo per uno standard fresco. Se possibile, controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio fluorescente invertito per valutare l'efficienza della trasduzione: percentuale di cellule che esprimono e relativo livello di espressione per cellula. Se non viene rilevata alcuna fluorescenza, attendere altri 2-3 giorni poiché l'espressione può richiedere più tempo a seconda del tipo di cellule da tradursi.
5. Se il controllo GFP è positivo, far crescere tutte le cellule fino ad avere un controllo di espressione di 6HF-Ubl da immunofluorescenza e macchie occidentali utilizzando anticorpi anti-Bandiera.

2. Doppia purificazione delle proteine modificate

NOTA: Buffer 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Buffer 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glycerol, pH 8.0.
Buffer 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. Lisi cellulare: Una volta pronti, lavare i piatti di coltura almeno una volta con la salina tampone di fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) e procedere al lisi cellulare o, in alternativa, il congelamento del flash nel liquido N₂ e conservare a -80 gradi centigradi. Per il lisi, aggiungere 2 mL di Buffer 1 per un piatto di 15 cm a RT. Utilizzare un raschietto cellulare per recuperare tutti i lismi in tubi di centrifugazione conicale da 50 mL (volume finale di circa 20 mL).
2. Sonicare i lisati tre volte per 30 s separati da una pausa di 1 min.
3. Centrifugare i lisati sonicati a 15.000 x g per 15 min.
4. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo utilizzando un colino cellulare (40 m).
5. Determinare la concentrazione dei campioni e regolare, se necessario, per ottenere la stessa quantità di proteine e lo stesso volume. Utilizzare una quantità totale di proteine tra 50 e 100 mg (10 piatti con 15 cm di diametro per le cellule MiaPaCa-2).
6. Aggiungere le perline Ni^2o-NTA, usando 2 gradi di perline per 1 mg di proteine.
7. Ruotare a 30 giri/min durante 2,5 h a RT.
8. Pellet le perline a 500 x g per 5 min.
9. Lavare le perline con 1 mL di Buffer 1, trasferendo i campioni in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml, quindi trasferire i tubi sul ghiaccio. Eseguire tutti i passaggi successivi sul ghiaccio o a 4 gradi centigradi.
10. Lavare due volte con 1 mL di buffer 2 ghiacciato contenente 10 mM di imidazolo.
11. Per eluire le proteine legate, aggiungere 600 l of Buffer 2 contenente 250 mM di imidazolo e ruotare per 2 h a 4 gradi centigradi.
12. Portare le perline mediante centrifugazione a 500 x g per 1 min. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi pre-raffreddati, da 1,5 mL e aggiungere 50 ll di perline coniugate anti-Bandiera M2.
13. Ruotare a 30 giri/ per 2,5 h a 4 gradi centigradi, quindi lavare 2 volte con 500 l of Buffer 2, quindi 2 volte con 500 gradi L di Buffer 3.
14. Per l'eluizione finale, aggiungere 100 l di Buffer 3 contenente un peptide Flag a 0,1 g/l e ruotare a 4 gradi centigradi per 1,5 h.
15. Centrifuga a 500 x g per 1 min e trasferire i supernatanti a nuovi tubi pre-raffreddati.
16. Prendere il 10% (10 l) per caricare su SDS-PAGE ed eseguire una colorazione d'argento del gel per controllare la qualità di purificazione. Se la purificazione sembra buona, analizzare il 90% lasciato da LC-MS/MS.

3. Elaborazione di dati di spettrometria di massa per generare profili di PTM Ub/Ubls e per identificare differenze significative tra di esse

NOTA: I risultati dell'analisi della SM contengono molte informazioni, tra cui il numero totale di peptidi e i valori di area di picco (media dell'area del peptide TOP 3¹⁰) per ogni proteina identificata in ogni campione. Questi dati possono essere elaborati utilizzando i numeri di conteggio peptide o i valori di area di picco, o entrambi. Per il calcolo con le aree di picco, poiché questi valori sono in genere compresi nell'intervallo di 10⁶, è necessario dividerli per questo ordine prima di applicare le stesse formule di seguito. I risultati ottenuti con entrambe le metodologie di conteggio dovrebbero mostrare una forte correlazione come di solito. Per ogni proteina identificata, utilizzare le seguenti formule in cui:
valori di peptidi v1 nel campione di ubiquitina non trattato (ad esempio, Ub - droga)
valori di peptidi v2 nel campione di ubiquitina trattato di Gemcitabine (ad es., Ub - droga)
k1 valori di peptidi nel campione GFP di controllo non trattato (ad esempio, GFP - droga)
k2 valori di peptidi nel campione GFP trattato di Gemcitabine (ad es., GFP e droga).

1. Normalizzazione: normalizzare i valori tra le cellule trattate con farmaci e le cellule non trattate per Ubiquitina e GFP utilizzando le seguenti formule. Normalizzato v - V e normalizzato k .
   V1-v1. ('''v1') . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . V2-v2. (Sezione v1 e n. v2) / (2.
   K1k1. (e , k1 , k2 ) / (2. k1) ; K2-k2. (EP1 x k2) / (2.
2. Rimozione dello sfondo: utilizzando le seguenti formule, sottrarre i valori nel campione di controllo (GFP) dai valori nel campione di ubiquitina per ottenere valori specifici (V'1 e V'2) per ogni proteina identificata in entrambe le condizioni.
   V'1-V1-K1 se V1-K1 V'1/0 se V1-K1<0
   V'2-V2-K2 se V2-K2'0 ; V'2 x 0 se V2-K2<0
3. Variazione (Var) dell'ubiquitazione. Per ottenere un punteggio (tra -100 e 100) per variazioni positive e negative delle PTM indotte da un farmaco, utilizzare la seguente formula in cui la differenza tra valori specifici di campioni trattati e campioni non trattati è divisa per la somma di tutti i valori, compresi quelli in (per penalizzare le proteine identificate anche nella GFP di controllo) e moltiplicare per 100.
   Var (V'2-V'1)/(V1,K1,V2,K2) , 100 ; -100Variazioni inferiori a -50 (repressione del PTM) o superiori a 50 (induzione di PTM) sono generalmente considerate significative.
4. Fiducia (Conf). Utilizzare la formula seguente per ottenere un valore di confidenza compreso tra 0 e 100%:
   Conf ((V1/V2)²/(1/V1/V1/K1/K2) 2 )²) - 100 - 100/(1'V'1'V'2) ; 0 se <0
   I valori superiori a 50 sono generalmente considerati sicuri.
5. Per ottenere una distribuzione più piacevole dei valori di induzione/repressione e considerare entrambi i parametri di variazione e confidenza, moltiplicare i valori Var e Conf utilizzando la seguente formula in cui V Var e C Conf
   (V2>0;(((V2))2)/((10'6);-((V2'C2)'2)/(10'6))
   NOTA: Poiché i valori delle aree di picco sono solitamente più accurati del conteggio dei peptidi, è possibile utilizzare software specifico dedicato all'interpretazione di questo tipo di dati come Perseo (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), raccomandazioni d'uso.

Risultati

Trasduzione delle cellule di mammiferi di coltura per creare cellule espressi GFP e 6HF-Ub
Per produrre lentivirus che saranno successivamente utilizzati per trasdurre le cellule MiaPaCa-2, le cellule HEK-293T confluenti 70% sono co-trascate con una quantità uguale dei tre vettori, pCCL-6HF-Ubiquitin o GFP/Delta-Helper/pvSvG. Dopo 24 ore di produzione, il mezzo contenente particelle lentivirali viene recuperato e filtrato. A questo punto è possibile controllare l'eff...

Discussione

Abbiamo sviluppato una metodologia robusta e affidabile per generare profili di proteine modificate dai principali membri della famiglia ubiquitina. Infatti, abbiamo applicato con successo questo protocollo per generare profili di PTM da ubiquitina, e anche da SUMO e Nedd8, e per rilevare alterazioni associate a un trattamento⁷, in risposta alla sopra espressione o knockdown di un certo gene (dati non cellule che hanno acquisito un fenotipo resistente a diversi farmaci chemioterapici.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag