Rilevare l'istituzione dell'afflusso di sangue condiviso nei topi parabiotici da Caudal Vein Glucose Injection

Riepilogo

Qui descriviamo un nuovo metodo per rilevare la creazione di successo della circolazione condivisa del sangue di due parabionts attraverso un'iniezione di vena caudale di glucosio, che provoca danni minimi e non è fatale per i parabionts.

Abstract

La parabiosi è un metodo sperimentale per combinare chirurgicamente due animali paralleli lungo l'asse longitudinale del corpo. Vi presentiamo un protocollo per rilevare il successo del chimerismo del sangue nei parabionts da un'iniezione caudale di glucosio. Sono stati costruiti topi parabiotici. Il glucosio è stato iniettato nel topo donatore attraverso la vena della coda, e la fluttuazione del livello di glucosio nel sangue è stata misurata in entrambi i topi utilizzando un glucometer del sangue in diversi punti di tempo. I nostri risultati hanno mostrato che dopo l'iniezione di glucosio, il livello di glucosio nel sangue nei topi donatori è aumentato bruscamente dopo 1 min e è diminuito lentamente in seguito. Nel frattempo, il livello di glucosio nel sangue dei topi ricittori ha raggiunto il picco di 15 min dopo l'iniezione. Risultati simili sono stati ottenuti con Evans blu, utilizzato come un controllo positivo per il glucosio. La fluttuazione sincrona dei livelli di glucosio nel sangue indica che il flusso sanguigno tra i due topi è stato stabilito con successo.

Introduzione

La parabiosi è un metodo di modellazione in cui due organismi viventi vengono uniti chirurgicamente e si sviluppano come un unico sistema fisiologico con un sistema circolatorio condiviso¹. Tali modelli sono stati ampiamente utilizzati per studiare la fisiologia a causa del vantaggio che le sostanze prodotte da un singolo individuo possono agire su entrambi gli animali contemporaneamente attraverso il sistema circolatorio condiviso. Dalla metà del 1800, quando gli esperimenti parabiotici sono stati introdotti da Paul Bert^2,i metodi per la costruzione di modelli parabiotici sono diventati standardizzati. Tuttavia, manca un metodo semplice e conveniente per verificare il successo dell'instaurazione del chimerismo del sangue. È stato riferito che la circolazione incrociata può essere valutata con successo iniettando intraperitonealmente 0,5% di colorante blu Eevans in uno dei parabioni seguito dalla misurazione dell'assorbimento di Evans blu nel sangue di entrambi i parabiont con un lettore di micropilla³. Un altro metodo richiede una razza ditopo specifica che contiene CD45.1 - e CD45.2^-monociti etichettati in ogni parabiont. La citometria cellulare viene quindi utilizzata per determinare il chimerismo del sangue misurando la frequenza dei due marcatori nei monociti dalla milza o dal sangue⁴. Tuttavia, questi metodi sono spesso letali o ingombranti per gli animali, e un metodo semplice e sicuro per una verifica rapida e affidabile dei modelli parabiotici è altamente auspicabile. In questo studio, abbiamo stabilito un nuovo metodo per questo scopo, che è stato convalidato in un modello murino di parabiosi. La concentrazione di glucosio in campioni di sangue prelevati da una vena della coda viene misurata utilizzando un glucometer, e il modello dei cambiamenti del livello di glucosio nei topi donatori e riceventi è considerato un'indicazione del chimerismo della circolazione. Abbiamo chiamato questo metodo il "metodo di fluttuazione del glucosio". L'applicazione di questo metodo di convalida non è limitata ai topi, ma potrebbe essere estesa a diversi modelli patologici ad eccezione di quelli con grave disregolazione del metabolismo del glucosio. La procedura è semplice, salvaile il tempo e sicura.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali e la loro cura sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Harbin Medical.

NOTA: gli strumenti e le attrezzature necessari per il metodo sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione di materiali e animali

1. Ordinare c57BL/6 topi maschi con peso compreso tra 20 g-25 g da un fornitore di animali da laboratorio standard.
2. Ospita i topi in un ciclo di luce di 12 h: 12 h di buio a 24,26 gradi centigradi con accesso ad alto libitum all'acqua e al cibo.

2. Parabiosi

1. Anestesizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 20 g/L 2,2,2-tribromoetanolo ad una concentrazione di 0,1 mL/10 g. Confermare l'anestesizzazione corretta come indicato dal rilassamento muscolare, dalla respirazione lenta e costante, dalla perdita di riflesso della stimolazione cutanea e dalla scomparsa del riflesso corneale.
2. Applicare unguento oftalmico con una punta Q per evitare gli occhi asciutti.
3. Eseguire la procedura di parabiosi come descritto in precedenza⁵.
   1. Posizionare i topi in posizione supina. Radere accuratamente il lato sinistro di un topo e il lato destro dell'altro mouse a partire da circa 1 cm sopra il gomito a 1 cm sotto il ginocchio con un rasoio elettrico. Utilizzare crema depilatoria per eliminare completamente la pelliccia sulla pelle rasata.
   2. Pulire le aree rasate con iodophor. Posizionare i topi su un cuscinetto riscaldato coperto da un cuscinetto sterile.
   3. Creare incisioni longitudinali della pelle partendo da 0,5 cm sopra il gomito a 0,5 cm sotto l'articolazione del ginocchio utilizzando un paio di forbici affilate sul lato rasato di ogni animale.
   4. Staccare la pelle dalla fascia sottocutanea delicatamente dopo l'incisione.
   5. Collegare l'olecranon e il ginocchio del parabiont con una sutura 3-0.
   6. Suturare la pelle rasata con una sutura continua 5-0.
4. Iniettare 0,5 mL di 0,9% NaCl sottocutaneamente a ciascun topo per prevenire la disidratazione.
5. Iniettare tramadolo (10 mg/25 g/giorno) intramuscolare a ogni topo per alleviare il dolore.

3. Convalida del chimerismo di circolazione

1. Metodo di fluttuazione del glucosio
   NOTA: Verificare la riuscita costruzione del chimerismo di circolazione tra parabiont utilizzando il metodo di fluttuazione del glucosio (nessun digiuno) il decimo giorno dopo l'intervento chirurgico di parabiosi.
   1. Anestesizzare i parabionts mediante iniezione intraperitoneale di 20 g/L 2,2-tribromoetanolo a ciascun topo ad una concentrazione di 0,1 mL/10 g.
   2. Fissare i topi donatori in un fissatore di coda venoso topo visivo.
   3. Strofinare le vene caudali sul fianco di una coda del parabiont con un batuffolo di cotone imbevuto di 70-75% di alcol per pulire la coda e dilatarlare i vasi sanguigni.
   4. Tenere una siringa da 1,0 mL contenente glucosio nella mano destra e mantenere l'ago parallelo alla vena (meno di 15 gradi).
   5. Inserire l'ago in una posizione di circa 2-4 cm dalla punta della coda.
   6. Inietta1 100 l di glucosio (1,2 g/kg) nel donatore entro 10 s.
      NOTA: Il termine donatore si riferisce al parabiont che riceve l'iniezione di glucosio attraverso la vena della coda. Il destinatario è l'altro parabiont, che non riceve direttamente il glucosio.
   7. Pulire le alture con iodophor. Tagliare le alture del donatore e dei topi ricitati con una forbice e raccogliere una goccia di sangue in diversi punti temporali dopo l'iniezione di glucosio (1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min e 60 min). Rimuovere il coagulo di sangue ad ogni punto di raccolta per evitare ulteriori danni.
      NOTA: Il volume di sangue raccolto è stato di 10-25 ul per un test e 90-225 ul in totale.
   8. Gocciolare il sangue nel centro delle strisce di prova glucometer per il rilevamento del livello di glucosio.
2. Utilizzare Counterstain blu di Evan come controllo positivo³.
   1. Iniettare nel topo donatore 200 L dello 0,5% blu di Evan Counterstain.
   2. 2 h più tardi, eutanasia i parabionts mediante iniezione intraperitoneale di 20 g/L 2,2,2-tribromoetanolo per ogni topo ad una concentrazione di 0,2 mL/10 g, e raccogliere il sangue da entrambi i parabioni per puntura cardiaca.
   3. Centrifugare i campioni di sangue a 916 x g per 15 min.
   4. Raccogliere il siero dal supernatante.
   5. Diluire il siero con lo 0,9% NaCl all'1:50.
   6. Misurare l'assorbimento dei campioni di siero diluito a 620 nm con uno spettrometro.

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Risultati

In sei topi donatori, i livelli di glucosio nel sangue sono nettamente aumentati a 26,5 mall/L (aumento del 173%) ad una media di 1 min dopo l'iniezione di 100 l di glucosio (1,2 g/kg) attraverso la vena della coda e poi sono gradualmente diminuiti a 13,3 smol a 60 min. Nei topi ricintori, la glicemia è aumentata lentamente dopo l'iniezione e ha raggiunto il primo livello di picco a 15 min (aumento del 47%, 12,2 zol/L). Sulla base dei risultati di cui sopra, lo standard per il chimerismo...

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Discussione

La parabiosi si riferisce alla tecnica chirurgica di collegamento di due animali viventi per stabilire un sistema vascolare comune con mezzi^{sperimentali 6,7,8}. Il vantaggio di questo modello è che le sostanze prodotte da un singolo individuo possono agire su entrambi gli animali contemporaneamente. Così, il modello di parabiosi può essere utilizzato per esplorare il ruolo di una sostanza o fattore in una malattia correlata, p...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
curved forceps	JZ surgical Instruments, China	J31340
fine scissors	JZ surgical Instruments, China	WA1030
needle forcep	JZ surgical Instruments, China	60017961
2.5 mL syringes	Agilent, USA	5182-9642
Tribromoethano	Sigma-Aldrich, USA	T48402-5G
penicillin	Solarbio, China	IP0150
tramadol	Yijishiye, China	YJT712520
glucometer	Roche Diabetes Care, Indiana	Accu-Chek Active test strips
Evan's blue Counterstain	Solarbio, China	G1810
depilatory cream	Nair, USA	LL9161
Warming Blanket (Heating pad)	Kent Scientific Corp, USA	TP-22G
Electrical shaver	Codos, China	CP-5000
3-0,5-0 surgical suture	Shanghai Medical Suture Needle Factory, China	SYZ 3-0#, SYZ 5-0#