Quantificazione delle cellule morte e proliferanti negli enteroidi

Riepilogo

Il protocollo presentato utilizza la citometria di flusso per quantificare il numero di cellule proliferatie e morte negli enteroidi dei topi coltivati. Questo metodo è utile per valutare gli effetti del trattamento farmacologico sulla proliferazione e la sopravvivenza degli organiidi.

Abstract

L'epitelio intestinale agisce come una barriera che impedisce al contenuto luminale, come il microbiota patogeno e le tossine, di entrare nel resto del corpo. La funzione di barriera epiteliale richiede l'integrità delle cellule epiteliali intestinali. Mentre la proliferazione delle cellule epiteliali mantiene uno strato continuo di cellule che forma una barriera, il danno epiteliale porta alla disfunzione della barriera. Di conseguenza, il contenuto luminale può attraversare la barriera intestinale attraverso un percorso illimitato. Disfunzione della barriera intestinale è stata associata a molte malattie intestinali, come la malattia infiammatoria intestinale. Le cripte intestinali isolate di topi possono essere coltivate e mantenute come strutture simili a cripte-villusi, che sono definite organoidi intestinali o "enteroidi". Gli enteroidi sono ideali per studiare la proliferazione e la morte cellulare delle cellule epiteliali intestinali in vitro. In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per quantificare il numero di cellule proliferative e morte negli enteroidi coltivati. 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) e iodio propidio vengono utilizzati per etichettare le cellule proliferanti e morte negli enteroidi, e la proporzione di proliferazione e cellule morte viene quindi analizzata dalla citometria di flusso. Questo è uno strumento utile per testare gli effetti del trattamento farmacologico sulla proliferazione delle cellule epiteliali intestinali e sulla sopravvivenza delle cellule.

Introduzione

Una funzione fondamentale delle cellule epiteliali intestinali è quella di proteggere l'ingresso del contenuto luminale come i batteri patogeni e le tossine^1,2. Per svolgere tale funzione, le cellule staminali intestinali proliferano continuamente e si differenziano in una varietà di cellule epiteliali, tra cui enterociti e cellule secretorie, che formano una barriera formando connessioni strette³. Il rapido rinnovamento delle cellule epiteliali intestinali richiede un rigoroso coordinamento della proliferazione cellulare, della differenziazione cellulare e della morte cellulare^4,5. La riduzione della proliferazione cellulare o l'eccessiva morte cellulare provocano danni epiteliali e la funzione di barriera compromessa^1,6. Disfunzione della barriera intestinale è stata associata a malattie infiammatorie intestinali^7,8.

In precedenza è stato sviluppato un metodo per la coltura delle cripte intestinali. Utilizzando questa tecnica, cripte di topo isolati crescono in organoidi intestinali (enteroidi), che hanno strutture cripto-villus come e contengono tutta la lignaggio delle cellule epiteliali intestinali^9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) è un analogo di timina che è in grado di sostituire la timina (T) nel DNA che è sottoposto a replicazione durante la proliferazione cellulare. Le cellule proliferative possono essere etichettate rapidamente e con precisione dalla colorazione EdU. Propidium iodide (PI) è un analogo di bromuro di etidio che rilascia fluorescenza rossa dopo l'inserimento nel DNA a doppio filamento. PI rileva specificamente le cellule morte, dal momento che passa solo attraverso la membrana cellulare danneggiata.

In questo protocollo, descriviamo prima come isolare le cripte dall'intestino piccolo murino poi colture come enteroidi in vitro. Descriviamo quindi come analizzare le cellule proliferative e morte in enteroidi da EdU e PI incorporando e flusso citometria.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dall'Animal Care and Use Committee del Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) dell'Università di Soochow.

1. Isolamento e cultura degli organiidi intestinali

1. Isolamento di cripte intestinali e coltura enteroide
   1. Eutanasia un topo di tipo selvaggio di 8 settimane con inalazione di CO_2. Utilizzare pinze tissutali e forbici dall'iride fine per sezionare circa 8 cm di ileo.
   2. Svuotare con un ago di alimentazione gavage con circa 40 mL di salina color fosfato (DPBS) ghiacciata, quindi tagliare longitudinalmente con le forbici e aprire l'ileo.
   3. Tagliare l'ileo a pezzi di 0,5,1,0 cm. Mettere i pezzi in 5 mL di sterile DPBS ghiacciato in un tubo conico da 15 ml, quindi abolire per 5 min sul ghiaccio.
   4. Utilizzare un controller pipetta per aspirare il DPBS e sostituirlo con 10 mL di cold buffer 1 (2 mM EDTA in DPBS). Roccia per 30 min sul ghiaccio.
   5. Utilizzare il controller pipetta per aspirare il buffer 1 e sostituire con 10 mL di cold buffer 2 (54,9 mM D-sorbitol, 43,4 mm di saccarosio in DPBS). Agitare per 2/3 min a mano (80 frullati/min).
   6. Prendete una goccia di 20 l di contenuto buffer 2 dopo agitazione e ispezionare al microscopio.
   7. Filtrare il contenuto del buffer 2 con un colino a cellule sterili da 70 m, quindi raccogliere il buffer filtrato con un tubo conico da 50 mL.
   8. Pipette 20 - L di filtrazione sullo scivolo per contare le cripte. Trasferire un volume sufficiente di buffer 2 dal passaggio 1.1.7 per assicurarsi che ci siano 500 cripte/pozzo.
   9. Girare verso il basso a 150 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Una volta che la filatura è terminata, aspirare con attenzione il super-natante.
   10. Sospendere le cripte in 50 gradi di matrice di membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel) per 500 cripte, pipette su e giù (facendo attenzione a evitare le bolle), quindi posizionare una goccia da 50 l di matrice/cripta della membrana seminterrato al centro di un pozzo in un pozzo 24. Incubare per 30 min a 37 gradi centigradi per polimerizzare la matrice della membrana del seminterrato.
   11. Dopo 30 minim di polimerizzazione, aggiungere con cura 600 l of minigut media (media Eagle modificata di Dulbecco avanzata [DMEM]/F12, 2 mM L-alanina-Glutamina, penna/strep [100 unità/mL], 10 mM Hepes, Supplemento N2 [1:100], Supplemento B27 [1:50] con fattore di crescita epidermico [EGF; 50 ng/mL], Noggin [100 ng/mL], R-spondin [500 ng/mL] e Y27632 [10 m]) ad ogni pozzo, quindi riportare la piastra all'incubatore 37 c. Osservare al microscopio ogni giorno, e cambiare i media ogni 2 /3 giorni.
2. Enteroid passaging
   NOTA: per le colture lunghe, gli enteroidi devono essere suddivisi approssimativamente ogni settimana.
   1. Per passare gli enteroidi, posizionare la piastra di coltura dei tessuti sul ghiaccio. Aspirati il supporto e aggiungete 1 mL di DPBS freddo ad ogni pozzo. Utilizzare una punta P1000 per pipetta reperire su e giù fino a quando non rimangono pezzi di matrice di membrana seminterrato solido.
   2. Passare su e giù una volta attraverso una siringa di insulina da 1 mL (27 G) e in un tubo conico da 15 mL. Girare verso il basso per 5 min a 150 x g a 4 gradi centigradi.
   3. Utilizzare pipette per rimuovere DPBS. Risospendere in 50 - L di matrice di membrana seminterrato/pozzo.
   4. Collocare la piastra in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per 30 min per consentire alla matrice della membrana del seminterrato di polimerizzare. Sovrapponete ogni po' di ogni po' con una maggiore zza (media enrgut, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 500 ng/mL R-spondin), quindi riportate la piastra all'incubatrice.

2. Analisi citometria di flusso delle cellule EdU-positive in enteroidi

NOTA: figura 1 mostra il flusso di lavoro per l'analisi della citometria del flusso delle celle EdU-positive negli enteroidi.

1. Incubazione di enteroidi con EdU
   1. Crescere enteroidi dal passo 1.2.4 per 5-7 giorni. Passaggio enteroide in una nuova piastra 24 pozzo in un rapporto di divisione di 1:2. Aggiungete 600 gradi di mezzo ENR ad ogni pozzo. Incubare enteroidi per 4/5 giorni in un'incubatrice di 37 gradi centigradi.
   2. Impostare il gruppo di controllo (enteroidi non trattati) e il gruppo sperimentale (enteroidi trattati con 5 interleuchino 22 ng/mL [IL-22]). Preparare almeno tre repliche per ogni gruppo.
   3. Aggiungere EdU al mezzo ENR per preparare il mezzo EdU con una concentrazione di 50 M. Aggiungete al pozzo 600 l di mezzo e incubate per 2 h in un'incubatrice a 37 gradi centigradi. Impostare un pozzo di enteroidi senza trattamento EdU come un controllo negativo per la sottrazione in background.
2. Raccolta di enteroidi dalla matrice della membrana del seminterrato
   1. Utilizzare un controller pipetta per aspirare il mezzo EdU e lavare 1x con DPBS. Aggiungere 1 mL di DPBS.
   2. Utilizzare la punta della pipetta P1000 e la pipetta su e giù fino a quando non rimangono blocchi di matrice della membrana del seminterrato. Trasferire in un tubo da 15 mL e girare verso il basso a 300 x g per 5 min. Scartare il supernatante.
   3. Aggiungere 500 l di enzimi di dissociazione cellulare (Tabella dei materiali) e incubare per 15 min a 37 gradi centigradi. Utilizzare la punta della pipetta P200 e la pipetta su e giù per suddividere gli enteroidi in singole celle.
   4. Aggiungere 3 mL di mezzo DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e ripetutamente pipetta con una punta di pipetta P1000.
   5. Girare verso il basso a 300 x g per 5 min e aspirare il mezzo supernatante. Risospendere le celle con 1 mL di DPBS.
3. Fissazione e permeabilizzazione delle cellule
   1. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 mL, girare verso il basso a 300 x g per 5 min e scartare il sovrinnante.
   2. Risospendere le cellule con 1 mL del 4% di paraformaldeide (PFA), fissare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT), e girare giù a 300 x g per 5 minuti. Aspirate il supernatante con una punta di pipetta, lavare 1x con DPBS, e girare verso il basso per rimuovere il supernatante.
   3. Risospendere le cellule con 1 mL dello 0,5% di sovrapprezzo nonionico. Incubare per 10 min a RT.
   4. Girare verso il basso a 300 x g per 5 min e aspirare il supernatante. Lavare 1x con DPBS e girare verso il basso per rimuovere il supernatante.
4. Rilevamento di EdU
   1. Preparare in anticipo le soluzioni stock per ogni componente: 1) soluzione funzionante dell'azide Alexa Fluor, 2) soluzione funzionante del buffer di reazione 1x EdU e soluzione stock 10x dell'additivo buffer EdU.
   2. Preparare 1x additivo buffer EdU diluindo la soluzione 10x 1:10 in acqua deionizzata. Preparare questa soluzione fresco.
   3. Preparare cocktail di reazione secondo la tabella 1.
      NOTA: Aggiungere gli ingredienti nell'ordine indicato nella tabella. Utilizzare il cocktail di reazione entro 15 min dalla preparazione.
   4. Aggiungere 100 l di cocktail di reazione ad ogni tubo da 1,5 mL. Risospendere le cellule, proteggere dalla luce, incubare per 30 min a RT.
   5. Centrifuga a 300 x g per 5 min e aspirare delicatamente la soluzione di reazione con la punta della pipetta.
   6. Aggiungere lo 0,5% penetrante soprannaturale nonionico a ogni tubo per lavare 1x a RT. Centrifuge a 300 x g per 5 min, aspirare il super-natante con la punta pipetta delicatamente, e risospendere le cellule in 1 mL di DPBS.
5. Analisi delle cellule per citometria di flusso
   1. Filtrare le celle risospese con un colino da 40 m, quindi raccogliere le celle filtrate con un tubo conico da 15 mL. Eseguire il rilevamento macchina FACS il prima possibile.
      NOTA: Se le condizioni sono limitate, i campioni macchiati di cellule devono essere conservati al buio a 4 gradi centigradi e sottoposti a test di flusso entro 3 giorni.
   2. Selezionare il canale appropriato (a seconda del tipo di azide di Alexa Fluor nel kit EdU; qui, canale rosso) e tensione (qui, 150-350 V) per l'analisi della citometria a flusso.
   3. Strategia di Gating
      1. Disegnare un grafico pseudocolore FSC-A (asse x) e SSC-A (asse y) e distribuire la maggior parte delle celle all'intervallo visibile della mappa puntino regolando la tensione. Selezionare la popolazione di cellule (R1) ed escludere i detriti cellulari nell'angolo in basso a sinistra.
      2. Dalla popolazione di celle R1, stabilire un FSC-A (asse x) vs. Il grafico pseudocolore FSC-H (asse y) e impostare il cancello per selezionare singole celle (R2) per escludere i gruppi di celle.
      3. Dalla popolazione di cellule R2, stabilire l'intensità della fluorescenza (asse x) vs. numero di cella (asse y) e utilizzare il controllo negativo per impostare il cancello. La regione del segnale fluorescente è una regione cellulare positiva (R3). Confrontare il rapporto tra le celle EdU-positive (R3) tra i gruppi sperimentali e di controllo.

3. Analisi della citometria di flusso delle cellule PI-positive negli enteroidi

NOTA: figura 2 mostra il flusso di lavoro per l'analisi della citometria di flusso delle celle PI-positive negli enteroidi.

1. Incubazione di cellule enteroidi con PI
   1. Crescere enteroidi dal passo 1.2.4 per 5-7 giorni. Passaggio enteroide in una nuova piastra 24 pozzo in un rapporto di divisione di 1:2. Aggiungete 600 gradi di mezzo ENR ad ogni pozzo. Incubare enteroidi per 4/5 giorni in un'incubatrice di 37 gradi centigradi.
   2. Impostare il gruppo di controllo (non trattato) e il gruppo sperimentale (TRATTATO IL 22), utilizzando almeno tre repliche per ogni gruppo.
   3. Aggiungere PI al mezzo ENR per preparare il mezzo PI con una concentrazione di 3 M.
   4. Aggiungete al pozzo 600 l di misura e incubate per 30 min in un'incubatrice a 37 gradi centigradi. Impostare un pozzo di enteroidi senza trattamento PI come un controllo negativo per la sottrazione dello sfondo.
2. Raccogli gli enteroidi dalla matrice della membrana del seminterrato seguendo i passi 2.2.1.2.5.
3. Analisi delle cellule per citometria di flusso
   1. Filtrare le celle risospese con un colino da 40 m e raccogliere le celle filtrate con un tubo conico da 15 mL.
   2. Eseguire il rilevamento macchina FACS il prima possibile.
      NOTA: Se le condizioni sono limitate, i campioni macchiati di cellule devono essere conservati al buio a 4 gradi centigradi e sottoposti a test di flusso entro 3 giorni.
   3. Selezionare il canale appropriato (qui, canale rosso) e la tensione (qui, 150-350 V) per l'analisi della citometria del flusso.
   4. Utilizzare la stessa strategia di gating descritta nella sezione 2.5.3.

Risultati

Piccole cripte intestinali sono state isolate e coltivate come enteroidi nella matrice della membrana seminterrato. Gli enteroidi hanno iniziato a formare gemme 2 giorni dopo l'isolamento. Il giorno 6, gli enteroidi avevano molte gemme con un sacco di detriti (cellule morte) nel lume. Gli enteroidi erano pronti per essere passaggiati in questa fase (Figura 3).

Numerosi studi hanno dimostrato che le citochine infiammatorie sono essenziali per il mantenimento dell'o...

Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio i passi necessari per la coltura degli enteroidi in vitro e la quantificazione delle cellule EdU e PI-positive negli enteroidi per citometria di flusso. Questa strategia presenta diversi vantaggi. In primo luogo, l'etichettatura EdU viene utilizzata per rilevare le cellule proliferanti negli enteroidi. Rispetto al tradizionale saggio BrdU, il metodo di etichettatura EdU è più veloce, più sensibile e più preciso. EdU è molto simile alla timina (T), che sostituisce la timina nel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml centrifuge tube	Corning	430791
22 G gavage needle	VWR	20068-608
24-well plate	Nunc	142475
40 mm sterile cell strainer	BD	352340
50 ml centrifuge tube	Corning	430829
70 mm sterile cell strainer	BD	352350
Advanced DMEM/F-12	GIBCO	12634010
Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer	Invitrogen	A24863
B-27 Supplement	GIBCO	17504044
Buffer 1			2 mM EDTA in DPBS
Buffer 2			54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS
C57/B6 mice	Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University
Cell-dissociation enzymes (TrypLE)	Life technologies	12605-010
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Life technologies	C10639
CO2 incubator	Panasonic	MCO-18AC
DPBS	GIBCO	14190144
D-sorbitol	BBI	SB0491
EDTA	BBI	EB0185
ENR media			Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
Fine Iris Scissors	Tansoole	2037454
Fluorescence microscope	Olympus	FV1000
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061
Goat Serum	Life technologies	16210-064
HDMEM	Hyclone	SH30243.01B
HEPES	Sigma	H4034
Matrigel	Corning	356231
Minigut media			Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)
N2 supplement	R&D	AR009
Nonionic surfactant (Triton X)	BBI	TB0198-500ML
Operating Scissor (12.5 cm)	Tansoole	2025785
Paraformaldehyde (PFA)	sigma	158127-500g
Penn/Strep	Invitrogen	15140-148
Phase contrast microscope	Nikon	TS1000
Propidium iodide	Sigma	P4170-25MG
Recombinant EGF	PeproTech	315-09
Recombinant Mouse Noggin	PeproTech	250-38
Recombinant Mouse R-Spondin 1	R&D	3474-RS-050
Recombinant Murine IL-22	PeproTech	210-22-10
Sucrose	BBI	SB0498
Tissue Forceps	Tansoole	2026704
Y-27632 2HC1	Selleck	S1049