Sviluppo di un modello sperimentale non invasivo e assistito dal laser della perdita di cellule endoteliali corneale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per staccare le cellule endoteliali corneali (CEC) dalla membrana di Descemet (DM) utilizzando un laser neodymium:YAG (Nd:YAG) come modello di malattia ex vivo per la cherata toropatia (BK).

Abstract

I laser Nd:YAG sono stati utilizzati per eseguire interventi chirurgici intraoculari non invasivi, come la capsulotomia da diversi decenni. L'effetto incisivo si basa sulla rottura ottica al fuoco laser. Vengono generate onde d'urto acustiche e bolle di cavitazione, causando la rottura del tessuto. Le dimensioni delle bolle e le ampiezza di pressione variano a seconda dell'energia dell'impulso e della posizione del punto focale. In questo studio, gli occhi di porcina enucleati sono stati posizionati di fronte a un laser Nd:YAG disponibile in commercio. Sono state testate le energie di impulso variabili e le diverse posizioni dei punti focali posteriori alla cornea. Le lesioni risultanti sono state valutate dalla microscopia a due fotoni e dall'istologia per determinare i migliori parametri per un distacco esclusivo delle cellule endoteliali corneali (CEC) con un danno collaterale minimo. I vantaggi di questo metodo sono l'ablazione precisa della CEC, la riduzione dei danni collaterali e, soprattutto, il trattamento senza contatto.

Introduzione

La trasparenza della cornea è essenziale per la trasmissione della luce alla retina e ai suoi fotorecettori¹. A questo proposito, uno stato relativo di disidratazione è fondamentale per mantenere le fibre di collagene all'interno dello stroma corneale correttamente allineate. Questa omeostasi è mantenuta da cellule endoteliali corneali (CEC) situate sulla membrana del Descemet (DM)². L'endotelio è lo strato corneale più interno. Ha un'importante barriera e funzione di pompaggio, che è fondamentale per la trasparenza corneale³. A differenza dell'epitelio, l'endotelio non è in grado di auto-rinnovarsi⁴. Pertanto, qualsiasi danno cellulare causato da malattie o traumi stimola le cellule endoteliali rimanenti ad ingrandire e migrare, a coprire i difetti risultanti e a mantenere la funzionalità corneale⁵. Tuttavia, se la densità CEC scende al di sotto di una soglia critica, lo scompenso dell'endotelio porta ad un edema, con conseguente visione e disagio offuscati o anche dolore grave⁴. Nonostante la disponibilità di farmaci per alleviare i sintomi, attualmente l'unico trattamento definitivo in questi casi è il trapianto di cornea, che può essere eseguito sotto forma di un trapianto endoteliale a tutto spessore o un trapianto endoteliale lamellare. Quest'ultima procedura è disponibile come keratoplastica endoteliale a membrana (DMEK) di Descemet e come keratoplastica endoteliale di Descemet (DSAEK)⁶. Tuttavia, la protezione della CEC rimanente e il miglioramento della loro sopravvivenza potrebbe essere un obiettivo alternativo, che necessita di un modello di malattia adeguato per testare potenziali farmaci terapeutici.

Gli attuali modelli di malattia da perdita CEC si concentrano sulla distruzione dell'endotelio attraverso l'iniezione di agenti tossici (ad esempio, il cloruro di benzalkonium) nella camera anteriore o per abrasione meccanica delle cellule utilizzando una tecnica di descemetorhexis invasiva^7,8. Mentre questi modelli sono ben consolidati, esistono svantaggi come la risposta infiammatoria generale e danni collaterali imprecisi. Pertanto, questi modelli hanno maggiori probabilità di rappresentare le fasi finali della malattia, quando le opzioni chirurgiche di cui sopra sono inevitabili.

Con i progressi nelle strategie di trattamento cellulare come le cellule staminali e la terapia genica, l'applicazione di queste terapie cellulari potrebbe essere utile nelle prime fasi della perdita di CEC⁹. Successivamente, abbiamo bisogno di un modello che rappresenti queste fasi precedenti della malattia in modo più adeguato. A questo proposito, i modelli di coltura cellulare sono migliorati nell'ultimo decennio, ma sono ancora limitati nella loro validità, in quanto le cellule in vitro non possono avvicinarsi alla replica delle complesse interazioni che si verificano tra i diversi tipi di cellule all'interno della cornea¹⁰. Pertanto, i modelli ex vivo e in vivo sono ancora molto richiesti e migliorare quelli esistenti è del massimo interesse.

Chirurgia intraoculare non invasiva da fotodisruption utilizzando un neodymium:YAG (Nd:YAG) laser è diventato una procedura di routine per oftalmologi in tutto il mondo dalla sua introduzione alla fine del 11 anni¹¹. La fotodisruption si basa sull'assorbimento della luce non lineare che porta alla formazione di plasma, alla generazione di onde acustiche d'urto e alla creazione di bolle di cavitazione, ogni volta che il sito di applicazione si trova in un ambiente liquido¹². In generale, questi processi contribuiscono all'effetto previsto di un taglio preciso dei tessuti. Tuttavia, possono anche essere la fonte di danni collaterali non necessari che limitano il confinamento locale della chirurgia laser¹³.

La previsione degli effetti meccanici risultanti è notevolmente migliorata attraverso la caratterizzazione del corso di propagazione e cavitazione dell'onda d'urto. Il nostro obiettivo è quello di indirizzare la CEC con il minor danno possibile al tessuto circostante per fornire un modello di malattia sperimentale non invasivo assistito dal laser per le prime fasi della perdita di CEC. A questo scopo, è necessario determinare le energie di impulso ottimali e le posizioni dei punti focali del laser.

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Protocollo

Tutte le procedure relative al tessuto animale seguono le linee guida del Comitato locale per la cura e l'etica degli animali.

1. Preparazione della coltura degli organi e del trattamento laser

1. Ottenere occhi di porcina appena enucleated dal mattatoio locale. Mantenerli freschi (4 gradi centigradi) nel mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, integrato con L-glutamina, pyruvate di sodio, penicillina/streptomicina (1%), e siero di porcina (10%), d'ora in poi indicato in questo articolo come mezzo pieno.
2. Rimuovere i tessuti extracellulari con le forbici e immergere gli occhi in 5% povidone-iodio-iodio soluzione oftalmica per 5 min prima di metterli in salina sterilizzata fosfato buffer (PBS) fino all'uso.
3. Occhi dello schermo per le principali patologie del segmento anteriore, come cicatrici corneali, edema e altre opacità con un dispositivo di tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (Tabella dei materiali).
4. Posizionare gli occhi davanti a un'unità a lampada a taglio dotata di un laser Nd:YAG (Table of Materials), con una lunghezza d'onda di 1.064 nm e un diametro del punto focale di 10 m in aria.
   NOTA: Per un posizionamento ottimale viene utilizzato un apparecchio di tenuta stampato in 3D, progettato per tenere l'occhio fermo, senza mettere troppa pressione su di esso (Figura 1).
5. Utilizzare un ingrandimento di 12x e deviare l'illuminazione per visualizzare i singoli strati corneali.
6. Impostare l'energia dell'impulso (ad esempio, 1,6 mJ) e il punto di messa a fuoco (ad esempio, 0,16 mm) per l'ablazione selettiva delle cellule endoteliali.
7. Posizionare una paracentesi di cornea chiara vicino al limbo e iniettare la viscoelastica (Tabella dei materiali) per stabilizzare la camera anteriore.
8. Accisa la cornea centrale trattata al laser utilizzando una trephine da 8 mm.
9. Collocare la cornea eccitata in un pozzo di una piastra di 12 pozze con il sito endoteliale rivolto verso l'alto e incubare il campione in 3 mL di mezzo pieno a 37 gradi centigradi per un massimo di 3 giorni.
   NOTA: i potenziali agenti citoprotettivi possono essere aggiunti al mezzo durante questo passaggio.

2. Preparazione all'istologia

1. Preparare il buffer di Sorensen con un pH di 7,4 contenente 19,6 mL di 133 mM KH₂PO₄ e 80,4 mL di 133 mM Na₂HPO₄.
2. Rimuovere il mezzo dal pozzo contenente cornea e fissare il tessuto per 20 min a temperatura ambiente (RT) utilizzando paraformaldeide senza metanolo (4%) nel buffer di Sorensen.
3. Mettere il tessuto nel 20% di saccarosio in PBS fino a quando i lavandini tissutali (1 h) e poi nel 30% di saccarosio in PBS durante la notte a RT. Fare attenzione a evitare il contatto con le bolle e l'interfaccia della superficie dell'aria. Incorporare il tessuto nel composto ottimale della temperatura di taglio (OCT) e conservarlo a -80 gradi centigradi.
4. Tagliare le sezioni spesse 10 m con un criostato a -27 gradi centigradi.
   NOTA: Una spazzola per capelli cammello è utile per guidare la sezione emergente sopra la lama del coltello.
5. Trasferire la sezione in un vetrino al microscopio toccando il vetrino al tessuto entro 1 min dal taglio per evitare il congelamento del tessuto. Conservare i vetrini a -80 gradi centigradi.

3. Colorazione ematossia e eosina (H&E)

1. Sezioni asciutte all'aria per alcuni minuti per rimuovere l'umidità.
2. Macchie con filtrato 0.1% Mayers ematossialina per 10 min in un tubo da 50 mL.
3. In un barattolo Coplin, risciacquare in fresco in esecuzione ddH₂O per 5 min e immergere in 0.5% eosin 10x.
4. Immergere in ddH₂O fino a quando l'eosinsa smette di striature e poi tuffo in 50% (10x) così come 70% (10x) EtOH.
5. Equilibrate in 95% EtOH (30 s) e 100% EtOH (60 s) prima di immergersi in xilene più volte.
6. Infine montare e coverslip il campione prima di prendere le immagini utilizzando un microscopio luminoso.

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Risultati

Usando la procedura qui presentata, abbiamo trattato gli occhi con un laser Nd:YAG, valutando diverse energie di impulso (1,0,6 mJ) e posizioni dei punti focali (distanza dalla superficie posteriore della cornea: 0,0,2 mm) per trovare i parametri ottimali. Sono state valutate repliche multiple (n n e 3) per ogni costellazione dei parametri laser (12 x 21).

Oltre al protocollo di cui sopra, l'esemplare è stato analizzato con un microscopio a due fotoni prima della fissazione e della colorazion...

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Discussione

I risultati di questo studio pilota indicano che un laser Nd:YAG può essere utilizzato per ablamare selettivamente le cellule endoteliali corneali quando vengono scelti i parametri appropriati per la dose di energia e la posizione del punto di messa a fuoco.

Poiché la funzione endoteliale è importante per la trasparenza corneale e la salvaguardia della cornea dall'edema stromale, i modelli di disfunzione endoteliale svolgono un ruolo importante nello sviluppo di farmaci anti-edematosi o pro...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BARRON VACUUM TREPHINE	Katena	K20-2058
Cryostat	Leica	CM 3050S
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose	PAA	E-15009
Eye holder	Self	N/A
Inverted Microscope	Leica	DMI 6000 B
KH2PO4	Merck	529568
Na2HPO4	Merck	1065860500
Nd:YAG laser	Zeiss Meditec	visuLAS YAG II plus
OCT Tissue Tek	Sakura Finetechnical	4583
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010056
Porcine serum	Sigma-Aldrich	12736C
Spectral-domain optical coherence tomograph	Heidelberg Engineering	Spectralis
Tissue culture plate 12-well	Sarstedt	833921
Two-Photon Microscope	JenLab	DermaInspect
Viscoelastic	OmniVision	Methocel