Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

Riepilogo

Presentato qui è un metodo per la biostampa 3D di gelatina methacryloyl.

Abstract

La gelatina methacryloyl (GelMA) è diventata un biomateriale popolare nel campo della biostampa. La derivazione di questo materiale è la gelatina, che è idrolizzata dal collagene mammifero. Così, le sequenze di acido arginina-glicina-aspartico (RGD) e i motivi bersaglio della matrice metalloproteinasi (MMP) rimangono sulle catene molecolari, che aiutano a raggiungere l'attaccamento e la degradazione delle cellule. Inoltre, le proprietà di formazione di GelMA sono versatili. I gruppi di methacrilmide permettono a un materiale di diventare rapidamente incrociato sotto irradiazione leggera in presenza di un fotoinitiatore. Pertanto, ha molto senso stabilire metodi adatti per sintetizzare strutture tridimensionali (3D) con questo materiale promettente. Tuttavia, la sua bassa viscosità limita la stampabilità di GelMA. Qui sono presentati metodi per realizzare la biostampa 3D di idrogel GelMA, vale a dire la fabbricazione di microsfere Di GelMA, fibre GelMA, strutture complesse GelMA e chip microfluidici basati su GelMA. Vengono discusse le strutture risultanti e la biocompatibilità dei materiali e dei metodi di stampa. Si ritiene che questo protocollo possa fungere da ponte tra i biomateriali applicati in precedenza e GelMA, oltre a contribuire alla creazione di architetture 3D basate su GelMA per applicazioni biomediche.

Introduzione

Si ritiene che gli idrogel siano un materiale adatto nel campo della biofabbricazione^1,2,3,4. Tra questi, la gelatina methacryloyl (GelMA) è diventata uno dei biomateriali più versatili, inizialmente proposto nel 2000 da Van Den Bulcke et al.⁵. GelMA è sintetizzata dalla reazione diretta della gelatina con anidrato methacril (MA). La gelatina, idrolizzata dal collagene mammifero, è composta da motivi bersaglio della matrice metalloproteinasi (MMP). Così, i modelli di tessuto tridimensionale in vitro (3D) stabiliti da GelMA possono idealmente imitare le interazioni tra le cellule e la matrice extracellulare (ECM) in vivo. Inoltre, le sequenze di acido arginina-glicina-aspartico (RGD), che sono assenti in alcuni altri idrogel come gli alginati, rimangono sulle catene molecolari di GelMA. Questo permette di realizzare l'attaccamento di cellule incapsulate all'interno delle reti idrogel⁶. Inoltre, la capacità di formazione di GelMA è promettente. I gruppi di methacrilmide sulle catene molecolari di GelMA reagiscono con il fotoinitiatore in condizioni di reazione mite e formano legami covalenti dopo l'esposizione all'irradiazione leggera. Pertanto, le strutture stampate possono essere rapidamente incrociate per mantenere le forme progettate in modo semplice.

Sulla base di queste proprietà, una serie di campi utilizzano GelMA per eseguire varie applicazioni, come l'ingegneria tissutale, l'analisi citologia di base, lo screening farmacologico e il biosensing. Di conseguenza, sono state dimostrate anche varie strategie di fabbricazione^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Tuttavia, è ancora difficile effettuare la biostampa 3D basata su GelMA, che è dovuta alle sue proprietà fondamentali. GelMA è un materiale sensibile alla temperatura. Durante il processo di stampa, la temperatura dell'atmosfera di stampa deve essere rigorosamente controllata per mantenere lo stato fisico del bioinchiostro. Inoltre, la viscosità di GelMA è generalmente inferiore rispetto ad altri idrogel comuni (ad esempio, alginato, chitosano, acido ialuronico, ecc.). Tuttavia, altri ostacoli si trovano ad affrontare quando si costruisce architetture 3D con questo materiale¹⁵.

Questo articolo riassume diversi approcci per la biostampa 3D di GelMA proposta dal nostro laboratorio e descrive i campioni stampati (ad esempio, la sintesi di microsfere Di GelMA, fibre GelMA, strutture complesse GelMA e chip microfluidici basati su GelMA). Ogni metodo ha funzioni specializzate e può essere adottato in diverse situazioni con requisiti diversi. Le microsfere GelMA sono generate da un modulo elettroassistito, che forma una forza elettrica esterna aggiuntiva per ridurre la dimensione delle goccioline. In termini di fibre di GelMA, sono estruso da un ugello biostampa coassiale con l'aiuto di alginato di sodio viscoso. Inoltre, la creazione di strutture 3D complesse si ottiene con un biostampa digitale di elaborazione della luce (DLP). Infine, viene proposta una strategia di collegamento due volte per costruire chip microfluidici basati su GelMA, combinando idrogel GelMA e chip microfluidici tradizionali. Si ritiene che questo protocollo sia una sintesi significativa delle strategie di biostampa Di GelMA utilizzate nel nostro laboratorio e possa ispirare altri ricercatori in campi relativi.

Protocollo

1. Coltura cellulare

1. Preparare il mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina / streptomicina, utilizzato per la coltura di cellule tumorali umane (MDA-MB-231) linee e linee di cellule endoteliali ombalimpibili umane (HUVEC).
2. Preparare Il DMEM con L-glutamine (DMEM/F-12), integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina, utilizzati per colture di linee di cellule staminali mesenchymale midollo osseo (BMSC).
3. Impostare l'ambiente di coltura come 37 e 5% CO₂. Cultura MDA-MB-231, HUVEC e BMSC, e passare le cellule in un rapporto 1:2 quando viene raggiunto il 90% di confluenza.

2. Fabbricazione di microsfere Di GelMA

1. Stampare l'apparecchio come Figura 1A con acido polilattico (PLA) su una stampante FDM (Modello di deposizione fusa). Posizionare due elettrodi ad anello metallico nell'apparecchio.
2. Collegare i due elettrodi ad anello metallico rispettivamente con pali a terra e positivi. Posizionare la piastra metallica collegata con l'alta tensione sotto l'elettrodo dell'anello e posizionare una piastra Petri con olio di silicio sulla piastra metallica come ricevitore di gocciolina.
3. Sciogliere GelMA liofilizzato (5% w/v) e fenile al litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP, 0,5% w/v) nella saliina con fosfato di Dulbecco (DPBS) come bioink (10 mL). Filtrare il bioinchiostro con un filtro da 0,22 m per la sterilità e riscaldarlo in un bagno d'acqua a 37 gradi per 15 minuti.
4. Staccare le celle MDA-MB-231 con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 gradi centigradi. Centrifugare le cellule in un tubo centrifuminale da 15 mL a 100 x g per 5 min per ottenere un pellet cellulare.
5. Togliete il super-acletterante. Mescolare il pellet cellulare con 1 mL di bioinchiostro preparato pipettandolo lentamente per prevenire la produzione di bolle.
6. Mettere 1 mL di bioinchiostro (MDA-MB-231) in una siringa sterile da 3 mL. Alimentare il bioinchiostro con la forza dell'aria compressa (0,5 kPa). Mettere la siringa sull'apparecchio.
   NOTA: L'ambiente di stampa deve essere rigorosamente controllato ad una temperatura di 30 gradi centigradi e un'umidità del 50%.
7. Accendere l'alimentazione ad alta tensione e impostare la tensione su 0-4 kV. Contemporaneamente, accendere la luce a lunghezza d'onda da 405 nm per incrociare le goccioline GelMA in 5 mL di olio di silicio.
8. Versare la maggior parte dell'olio di silicio decantando la parabola Petri. Trasferire l'olio di silicio rimasto e le microsfere Di GelMA in un tubo centrifugo da 15 mL utilizzando un cucchiaio.
9. Aggiungere 5 mL di DPBS e agitare uniformemente la miscela. Centrifugare il tubo a 100 x g per 5 min e rimuovere il liquido supernatante.
10. Ripetere il passaggio 2.9 3x.
11. Estrarre le microsfere di GelMA con un cucchiaio e colture in DMEM in un piatto di Petri a 37 gradi centigradi e 5% CO₂ per 3 giorni.
12. Eliminare il mezzo e lavare le microsfere con DPBS. Fissare con 2 mL di 4% paraformaldeide (PFA) per 30 min a temperatura ambiente (RT).
13. Eliminare il PFA e lavare le microsfere con DPBS. Permeabilizzare con 2 mL dello 0,5% di surfactant nonionico (cioè Triton X-100) per 5 min a RT.
14. Eliminare il surfactant nonionico e lavare le microsfere con DPBS. Macchiarli con 2 mL di tetramethylrhodamine (TRITC) phalloidin per 30 min nel buio a RT.
15. Eliminare il TRITC e lavare le microsfere con DPBS. Colorali con 2 mL di 4-,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) per 10 min al buio a RT.
16. Eliminare il DAPI e lavare le microsfere con DPBS. Cattura la morfologia con un microscopio a fluorescenza confocale.

3. Fabbricazione di fibre GelMA

1. Preparare un ugello coassiale come illustrato nella Figura 2A. Fissare un ugello interno (25 G, OD - 510 m, ID - 250 m) e un ugello esterno (18 G, OD , 1200 m, ID - 900 m) con saldatura. Collegare un tubo di vetro (lunghezza 50 mm, diametro interno 1,2 mm) all'estremità dell'ugello coassiale.
2. Sciogliere la polvere di alginato di sodio (Na-Alg) che viene sterilizzata sotto la luce ultravioletta (UV) per 30 min in acqua deionizzata al 2% (w/v).
3. Preparare una soluzione sterile di bioinchiostro dopo il passaggio 2.3. Riscaldare il bioink GelMA e la soluzione Na-Alg in un bagno d'acqua a 37 gradi per 15 minuti.
4. Staccare le celle BMSCs con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 gradi centigradi. Centrifugare le cellule in un tubo centrifuminale da 15 mL a 100 x g per 5 min per ottenere un pellet cellulare.
5. Rimuovere il liquido supernatante. Mescolare il pellet cellulare con 2 mL di bioinchiostro GelMA preparato pipettandolo lentamente per prevenire la produzione di bolle.
6. Mettere 2 mL di bioinchiostro (BMSC) in una siringa da 10 mL. Mettere 2 mL di soluzione Na-Alg in un'altra siringa (10 mL). Alimentarli con due pompe di siringhe, rispettivamente (qui, bioink a 50 m/min e Na-Alg soluzione a 350 m/min).
   NOTA: L'ambiente di stampa deve essere rigorosamente controllato ad una temperatura di 30 gradi centigradi e un'umidità del 50%.
7. Accendere la luce di lunghezza d'onda da 405 nm per irradiare il tubo trasparente per incrociare le fibre GelMA. Utilizzare un piatto Petri con DPBS per ricevere le fibre.
8. Estrarre le fibre gelMA con un cucchiaio da DPBS e colture per 3 giorni nel preparato DMEM / F-12 in 37 C e 5% CO₂.
9. Seguite i passi da 2,12 a 2,16 per preparare le fibre gelMA per l'osservazione morfologica con un microscopio a fluorescenza confocale.

4. Fabbricazione di complesse strutture 3D GelMA

NOTA: La figura 3A mostra lo schizzo di fabbricazione delle complesse strutture 3D GelMA.

1. Pulire il biotipo DLP (Figura 3E) con il 75% di alcol ed esporlo all'irradiazione UV per 30 min per la sterilità.
2. Sciogliere gelMA liofilizzato (10% w/v) e LAP (0,5% w/v) in DPBS. Aggiungere pigmento magenta commestibile nella soluzione (3% v/v) per migliorare la precisione di stampa.
3. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 m per la sterilità e riscaldarla in un bagno d'acqua a 37 gradi per 15 minuti.
4. Costruisci i modelli 3D con un software CAD (Computer-Aided Design). Importare i documenti del modello nel software superiore (EFL) del biostampante DLP applicato.
5. Aggiungere 10 mL di bioinchiostro preparato nella depressione del biostampante DLP.
6. Impostare i parametri di stampa nel software superiore come segue: intensità della luce: 12 mW/cm², durata dell'irradiazione e 30 s, e altezza della fetta è pari a 100 m. Avviare la stampa.
7. Togliere la struttura stampata dal biotipografo e immergerla in DPBS in un piatto Petri.
8. Scollegare le celle MDA-MB-231s con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 . Centrifuga cellule a 100 x g per 5 min in un tubo da 15 mL per ottenere un pellet cellulare.
9. Rimuovere il liquido supernatante e mescolare il pellet cellulare con 2 mL di DMEM.
10. Aggiungere 100 l di sospensione cellulare sulle strutture stampate. Coltivanoli per 3 giorni nel DMEM preparato a 37 gradi centigradi e al 5% di CO₂.
11. Seguite i passi 2.12-2.16 per preparare le complesse strutture 3D per l'osservazione morfologica con un microscopio a fluorescenza confocale.

5. Fabbricazione di chip microfluidici basati su GelMA

NOTA: La figura 4A mostra lo schizzo di fabbricazione del chip microfluidico basato su GelMA.

1. Sciogliere gelata 10% (w/v) e LAP (0,5% w/v) in DPBS. Filtrare la soluzione GelMA con un filtro da 0,22 m per ottenere sterilità.
2. Sterilizzare la polvere di gelatina sotto la luce UV per 30 min e aggiungerla alla soluzione GelMA-LAP preparata al punto 5.1 ad una concentrazione finale di gelatina del 5% (w/v). Riscaldare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 15 minuti.
3. Progettare un gruppo di stampi (Figura 4B,C) con il software CAD e fabbricarli con resina fotopolimerica su una stampante DLP.
4. Riempire completamente gli stampi con il bioink preparato.
5. Mettete gli stampi in un frigorifero a 4 gradi per incrociare la gelatina per 30 min.
6. Rimuovere gli stampi e deformare con una lama i fogli idrogel parzialmente (fisicamente) incrociati dagli stampi.
7. Combinare i due fogli di idrogel demolded e legarli con l'aiuto di GelMA irradiando a 405 nm per 1 min.
8. Staccare le celle HUVEC con 3 mL di 0,25% soluzione trypsin-0.02% EDTA per 3 min a 37 gradi centigradi. Centrifuga cellule in un tubo centrifuminale da 15 mL per ottenere un pellet cellulare a 100 x g per 5 min.
9. Rimuovere il liquido supernatante e mescolare il pellet cellulare con 2 mL di DMEM.
10. Riempire completamente il microcanale iniettando la sospensione cellulare con un ugello e una siringa.
11. Capovolgere il chip a testa in giù ogni 15 minuti durante i prossimi 3 h per ottenere una semina uniforme e completa delle cellule. Cultura le patatine nel piatto Petri per 3 giorni nel DMEM preparato a 37 gradi centigradi e 5% di CO₂.
12. Seguite i passi da 2,12 a 2,16 per preparare i chip microfluidici per l'osservazione morfologica con un microscopio a fluorescenza confocale.

Risultati

Durante la fabbricazione delle microsfere GelMA, le goccioline GelMA sono state separate dalla forza di campo elettrico esterna. Quando le goccioline sono cadute nell'olio di silicio ricevente, sono rimaste a forma standard di sferoide senza code. Questo perché le goccioline GelMA erano in una fase acquosa, mentre l'olio di silicio era in una fase di olio. La tensione superficiale che si è formata tra le due fasi ha causato le goccioline GelMA mantenere una forma standard sferoide. In termini di microsfere cariche di c...

Discussione

Questo articolo descrive diverse strategie per fabbricare strutture 3D GelMA, vale a dire microsfere Di GelMA, fibre GelMA, strutture complesse GelMA e chip microfluidici basati su GelMA. GelMA ha promettenti capacità di biocompatibilità e formazione ed è ampiamente utilizzato nel campo della biofabbricazione. Le strutture della microsfera sono adatte per il rilascio controllato di farmaci, la coltura dei tessuti e l'iniezione negli organismi per un'ulteriore terapia^21,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter membrane	Millipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength light	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzle	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscope	OLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printer	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL Software	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatin	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage power	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehyde	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycin	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg)	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidin	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100	Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China