Sequenziamento di piccoli RNA non codificanti da tessuti fissati in formalina ed esosomi derivati dal siero da pazienti affetti da cancro alla prostata resistenti alla castrazione

Riepilogo

La resistenza alla terapia si sviluppa spesso in pazienti con carcinoma della prostata avanzato e, in alcuni casi, il cancro progredisce verso un sottotipo letale chiamato cancro alla prostata neuroendocrino. Valutare i piccoli cambiamenti molecolari mediati dall'RNA non codificanti che facilitano questa transizione consentirebbe una migliore stratificazione della malattia e l'identificazione di meccanismi causali che portano allo sviluppo del cancro alla prostata neuroendocrino.

Abstract

L'ablazione del recettore degli androgeni (AR) mediante privazione di androgeni è l'obiettivo della prima linea di terapia per il cancro alla prostata che inizialmente si traduce nella regressione del cancro. Tuttavia, in un numero significativo di casi, la malattia progredisce verso il cancro alla prostata avanzato e resistente alla castrazione (CRPC), che ha opzioni terapeutiche limitate ed è spesso aggressivo. La metastasi distante è osservata per lo più in questa fase della malattia aggressiva. CRPC è trattato da una seconda generazione di inibitori della via AR che migliorano la sopravvivenza inizialmente, seguita dall'emergere della resistenza alla terapia. Il cancro alla prostata neuroendocrina (NEPC) è una rara variante del cancro alla prostata (PCa) che spesso si sviluppa a seguito della resistenza terapeutica attraverso un processo di transdifferenziazione noto come differenziazione neuroendocrina (NED), in cui le cellule PCa subiscono un interruttore di lignaggio da adenocarcinomi e mostrano una maggiore espressione dei marcatori di lignaggio neuroendocrina (NE). Oltre alle alterazioni genomiche che guidano la progressione e la transdifferenziazione al NEPC, i fattori epigenetici e i segnali microambientali sono considerati attori essenziali nel guidare la progressione della malattia. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per identificare i driver epigenetici (cioè piccoli RNA non codificanti) associati alla PCa avanzata. Utilizzando microRNA purificati provenienti da tessuti metastatici incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) e vescicle extracellulari (EV) derivate dal siero, il protocollo descrive come preparare le librerie con un adeguato controllo di qualità per il sequenziamento microRNA da queste fonti campione. Isolare l'RNA sia da FFPE che da EV è spesso difficile perché la maggior parte di esso è degradato o è limitato in quantità. Questo protocollo elaborerà diversi metodi per ottimizzare gli input di RNA e le librerie cDNA per produrre la maggior parte delle letture specifiche e dei dati di alta qualità al momento del sequenziamento.

Introduzione

Il cancro alla prostata è guidato da androgeni che agiscono tramite segnalazione AR. Pertanto, il targeting del percorso AR è il trattamento di soggiorno principale per la malattia¹. Tuttavia, la resistenza spesso deriva come risultato di terapie mirate e la malattia progredisce a un Avanzato Metastatico CRPC². CRPC è trattato da seconda generazione di terapia AR che include enzalutamide e abiraterone^2,3 che migliora la sopravvivenza inizialmente. Tuttavia, varianti letali come NEPC spesso emergono nel 25-30% dei casi di CRPC trattati che hanno opzioni di trattamento limitate, portando ad un aumento della mortalità³. NEPC nasce attraverso un processo di transdifferenziazione reversibile noto come NED, in cui le cellule PCa subiscono un interruttore di lignaggio da adenocarcinomi e mostrano una diminuzione dell'espressione di AR e una maggiore espressione di marcatori di lignaggio NE tra cui enolasi 2 (ENO2), cromogranina A (CHGA) e sinaptophysina (SYP)⁴. Dato che queste varianti di resistenza sorgono come risultato di interventi terapeutici, è essenziale decifrare percorsi che portano alla generazione di questa forma mortale e difficile da trattare di PCa.

La genomica di NEPC è stata recentemente decifrata in uno studio esaustivo condotto da Beltran e t al. per cui sono state analizzate alterazioni del numero di copie, mutazioni, polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e metilazione del DNA da tessuti metastatici derivati dal paziente^{5 .} Nonostante un significativo progresso nella comprensione della genomica di questa forma aggressiva di PCa, si sa poco sui fattori epigenetici, compresi i piccoli RNA non codificanti (microRNA) che sono coinvolti nella transizione di CRPC-adenocarcinoma a NEPC. I microRNA (miRNA) sono rna lunghi 22 bp e a doppio filamento che agiscono principalmente sopprimendo l'espressione genica post-transcriing mediante interazioni specifiche della sequenza con le regioni 3'-untranslated (UTR) di bersagli mRNA cognati⁶. Sono stati ora identificati diversi oncomiR e soppressori tumorali, e il loro ruolo nella regolazione dell'insorgenza e della metastasi della malattia è stato ben studiato in diversi tipi di cancro^6,7. Questi piccoli RNA non codificanti spesso servono come obiettivi molto importanti nel controllo della mortalità per malattia^6,8,9. Ricerche più recenti si sono concentrate sulla comprensione degli effetti paracrini dei miRNA nella metastasi tumorale attraverso il loro trasporto in veicoli elettrici, come gli esosomi, che fluiscono nel flusso sanguigno e consentono alle cellule tumorali di inviare questi messaggeri secondari in luoghi metastatici in un ambiente privo di nuclesi^10,11,12. Gli EV trasportano miRNA dalle cellule tumorali per trasferire gli effetti di trasformazione dalle cellule ospiti¹². L'identificazione dei veicoli elettrici come messaggeri secondari delle cellule tumorali può quindi essere utile per il rilevamento non invasivo della gravità della malattia.

Il miR-1246 è altamente regolato nei veicoli elettrici da PCa aggressiva, e indica la gravità della malattia¹³. Questi miRNA associati agli EV non solo servono come biomarcatori non invasivi della malattia, ma svolgono anche un ruolo funzionalmente importante nel guidare la tumorigenesi. Pertanto, è essenziale comprendere il significato del repertorio miRNA associato a forme resistenti di PCa per consentire una migliore identificazione dei biomarcatori non invasivi e il loro significato funzionale.

L'avvento del sequenziamento di nuova generazione ha offerto la piattaforma più completa per studiare i dettagli del paesaggio tumorale che coinvolgono alterazioni del genoma come mutazioni, trasferimenti cromosomici, cromotrasi e metilazione, che contribuiscono in modo significativo alla forma e alla natura del cancro^14,15,16. Allo stesso modo, è anche uno strumento essenziale per comprendere i vasti cambiamenti epigenomici che si verificano in una cellula tumorale e che sono spesso attori importanti nella gravità della malattia¹⁷. Con l'obiettivo di comprendere il repertorio miRNA associato alla generazione di NEPC, è stato eseguito un piccolo sequenziamento dell'RNA sui tessuti CRPC metastatici FFPE e sui corrispondenti EV derivati dal siero. L'RNA derivato da una di queste due fonti di campioni è (1) basso rendimento e (2) di cattiva qualità a causa della degradazione che spesso si verifica a causa della fissazione formalina e dell'isolamento degli EV. Inoltre, la generazione di librerie cDNA è un passaggio critico, ma ingombrante, di un'esecuzione di sequenziamento. Pertanto, i metodi per isolare questi RNA e utilizzarli per generare librerie per piccoli sequenzidi di RNA richiedono l'ottimizzazione per generare dati accurati e affidabili.

Ci sono diversi metodi per profilare l'espressione del miRNA in diversi campioni, tra cui RT-PCR, microarray e ibridazione in situ (ISH). Un protocollo che utilizza l'RNA derivato dal tessuto FFPE per valutare l'espressione di miRNA da RT-PCR e ISH è stato recentemente pubblicato¹⁸. Tecnologie più recenti offrono piattaforme più esaustive e complete per la profilazione dell'espressione miRNA in un campione. NanoString nCounter offre una piattaforma sensibile di rilevamento miRNA¹⁹, ma il rilevamento è spesso limitato dal numero di miRNA disponibili nell'array (2.000 dollari). In uno scenario di questo tipo, una piattaforma più sensibile ed esaustiva come il sequenziamento di nuova generazione offre una profondità molto più ampia di identificazione del miRNA e la profilazione simultanea in diversi campioni²⁰. Il metodo è stato utilizzato per determinare le firme di miRNA nelle urine o nel plasma da pazienti PCa^21,22,23. Nell'articolo attuale, viene presentato un protocollo per utilizzare una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione per studiare i profili di miRNA associati a CRPC aggressivi utilizzando tessuti FFPE e RNA EV derivati dal siero.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida etiche della Regola Comune degli Stati Uniti ed è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Ricerca Umana.

1. Microdissezione

NOT: Tessuti CRPC metastatici FFPE con caratteristiche adenocarcinoma (CRPC-Adeno) o differenziazione NE (CRPC-NE) sono stati ottenuti dal Prostate Cancer Biorepository Network (PCBN). Sono state preparate dieci sezioni PCa su vetrini di vetro per la microdissezione manuale, come discusso in precedenza¹⁸. Per riassumere brevemente:

1. Deparaffinizzare le sezioni di tessuto immergendo i vetrini in xilene (2x, 10 min ciascuno). Quindi reidratare le sezioni incubando i vetrini per 5 min ciascuno in etanolo graduato (100%, 95%, 90%, 80% e 70%), seguito da un lavaggio dell'acqua distillato e colorazione con ematossino (30 ammollo).
2. Dopo la colorazione dell'ematossitale, lavare le sezioni del tessuto con acqua. Quindi disidratare le sezioni tissutali mettendole in etanolo graduato (70%, 80% 90%, 95%, 100%) (5 min ciascuno) seguito da xilene (5 min).
3. Analizzare i corrispondenti vetrini di ematossia lina ed eosina (H&E) per identificare le aree tumorali (ad esempio, adenocarcinomi o NED) e contrassegnare queste aree tumorali e le normali aree adiacenti con l'assistenza di un patologo certificato dalla scheda. Utilizzando questi diapositive H&E come roadmap, segnare i tessuti macchiati di ematossina ottenuti nel passaggio precedente per distinguere tra il tumore e le aree normali.
4. Dissezionare il tessuto marcato con attenzione sotto il microscopio utilizzando una lama del bisturi.
5. Raccogliere il tessuto sezionato da aree normali e cancerose in tubi separati utilizzando punte pipette di carico gel caricate elettrostaticamente. La punta carica attira il tessuto sezionato e consente il massimo recupero del tessuto dopo la dissezione. Una volta che il tessuto si attacca alla punta carica, tagliare la punta in un tubo di raccolta vuoto 2 mL.

2. Isolamento dei veicoli elettrici derivati dal siero

NOT: I campioni di siero del paziente congelati raccolti da pazienti con CRPC metastatico con adenocarcinoma caratteristiche (CRPC-adeno) o differenziazione NE (CRPC-NE) sono stati acquistati da PCBN utilizzando un protocollo IRB approvato e memorizzati a -80 gradi centigradi prima del loro utilizzo. I campioni di siero sono stati raccolti dallo stesso gruppo di pazienti utilizzati per i tessuti microdisseci per consentire il confronto tra i tessuti corrispondenti e gli EV derivati dal siero. Per raccogliere i veicoli elettrici è stato utilizzato un reagente di isolamento EV del siero disponibile in commercio.

1. Scongelare i campioni di siero del paziente congelati a 4 gradi centigradi.
2. Utilizzare 110 lofan di campione di siero scongelato e ruotare a 2.000 x g per 30 min.
3. Raccogliere il supernatante per il successivo isolamento EV/exosome e scartare il pellet detriti. Aggiungere 30 l di reagente di isolamento esosoma del siero al supernatante e incubare a 4 gradi centigradi per 30 min.
4. Girare a 10.000 x g per 10 min. Raccogliere con cura il siero impoverito EV senza disturbare il pellet in un tubo separato da 1,5 mL e conservarlo a -80 gradi centigradi per analisi future, se necessario.
5. Risospendere il pellet EV in 70 gradi l di fosfato tamponato salina (PBS) preparato in acqua priva di nucleato. Mantenere un'aliquota per il sistema di analisi di tracciamento delle particelle per valutare la qualità e il numero di particelle. Conservare il resto del campione a -80 gradi centigradi fino a ulteriori analisi.

3. Isolamento dell'RNA dai tessuti prostatici e dai veicoli elettrici microdissected

NOT: L'RNA totale è stato isolato dai tessuti microdissected e dai veicoli elettrici purificati utilizzando un kit disponibile in commercio (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore con alcune modifiche. Le sezioni seguenti descrivono brevemente queste procedure con particolare attenzione ai passaggi importanti:

1. Isolare l'RNA dai tessuti microscidi.
   1. Risospendere il tessuto FFPE microdissected in 150 . Mescolare vorticee e pipetta fuori il tessuto residuo dalla punta. Girare a 11.000 x g per 1 min.
   2. Aggiungete 10 l di proteine assiK al pellet. Attendere 2 min fino a quando il pellet diventa bianco. Pipette su e giù un paio di volte.
   3. Incubare a 56 gradi centigradi per 16 min. Vortex ogni 3 min.
   4. Rimuovere i campioni e lasciare che il blocco di calore raggiunga gli 80 gradi centigradi. Incubare i campioni sul blocco per 16 min. Vortex ogni 3 min.
   5. Incubare sul ghiaccio per 3 min.
   6. Girare a 20.000 x g per 15 min. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 2 mL.
   7. Aggiungere 16 luna di tampone booster DNase seguito da 10 L di DNase I. Mix invertendo delicatamente il tubo e incubando a temperatura ambiente (RT) per 15 min.
   8. Aggiungere 320 l di lassimento del globulo rosso (RBC). Mescolare invertendo il tubo e quindi aggiungere 1.120 -L di 100% di etanolo. Trasferire immediatamente su colonne di spin memorizzate a 4 gradi centigradi. Girare a 8.000 x g per 30 s.
   9. Lavare le colonne 2x con buffer di lavaggio e ruotare le colonne a 20.000 x g per 5 min per rimuovere il buffer di lavaggio residuo.
   10. Lasciare asciugare la colonna di spin per 2/3 min, quindi elutare con 19 -L di acqua senza RNase. Quantificate l'RNA purificato su uno spettrofotometro e normalizzare il campione a 40 ng/L.
2. Isolamento dell'RNA dagli EV derivati dal siero.
   1. Isolare l'RNA esosomico utilizzando un kit. Aggiungete 75 lofde di ilteralisi A e 9,3 luna di iltera di lisi B a 50 l della sospensione EV purificata.
      NOT: Continuare a mescolare il campione invertendo il tubo per circa 10 minuti per consentire la lisi completa dei VEICOLi elettrici.
   2. Aggiungere 130 L del 100% di etanolo e mescolare immediatamente invertendo il campione. Trasferire su una colonna di spin e poi girare a 3.300 x g per 1 min.
   3. Lavare la colonna 2x con il tampone di lavaggio. Girare la colonna a 1.300 x g per 3 min per rimuovere completamente il buffer di lavaggio.
   4. Lasciare asciugare la colonna all'aria per 2 min.
   5. Ripetere il passaggio 3.2.4 con il buffer eluito incluso nel kit per aumentare la resa dell'RNA dal campione.
   6. Quantificare il campione su uno spettrofotometro e normalizzarlo a 40 ng/L.

4. Preparazione della libreria per il sequenziamento di RNA piccolo

NOT: Un piccolo kit di preparazione della libreria di RNA (Tabella dei materiali) è stato utilizzato per generare librerie cDNA dai campioni di RNA isolati. I passaggi per generare librerie, eliminarle e controllarle di qualità prima di eseguire un sequencer sono fondamentali per qualsiasi protocollo di sequenziamento in quanto determinano alla fine la qualità dei dati di output da un'esecuzione. Pertanto, procedere con attenzione ad ogni passaggio. Le linee guida del produttore suggeriscono di utilizzare un minimo di 50 ng di RNA. Data la scarsa qualità e le basse quantità di RNA totale di solito ottenute da queste due fonti di campioni, questo protocollo è ottimizzato per concentrazioni di RNA a partire da 100 ng. Il protocollo seguente è per un esempio di una libreria.

1. Generare cDNA con connessione adapter.
   1. Utilizzare 5 L di un campione di RNA normalizzato (40 ng/LL). Aggiungere 1 - L di 3' di adattatore. Preriscaldare il ciclore termico a 70 gradi centigradi prima di incubare i campioni. Incubare per 2 min. Trasferire immediatamente i campioni sul ghiaccio prima di passare alla fase successiva.
   2. In un tubo separato, mescolare 2 l- di tampone di legatura, 1 L l di inibitore di RNase e 1 L di T4 RNA Ligase 2, un mutante depugnazio. Mescolare pipettando su e giù e aggiungere 4 -L di questo mix al tubo con l'adattatore RNA/3'.
   3. Trasferire al ciclore termico che è stato preriscaldato a 28 gradi centigradi e incubare per 1 h.
   4. Aggiungere 1 l di soluzione di arresto mantenendo i campioni sul blocco termico. Incubare a 28 gradi centigradi per altri 15 min.
   5. Rimuovere i tubi e tenere il ghiaccio subito dopo questo passaggio.
   6. In un tubo separato, aggiungere 1 - L di 5' adattatore.
   7. Trasferire a un ciclista termico che è stato preriscaldato a 70 gradi centigradi e incubare per 2 min.
   8. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio per evitare la ri-annessione degli adattatori.
   9. Aggiungere 1 o L di 10 mM ATP al tubo dell'adattatore denaturato da 5'. Mescolare con la pipatura e aggiungere 1 -L di T4 RNA ligase al mix. Mescolare con la pipettatura e aggiungere 3 -L di questo mix al tubo contenente l'RNA 3' adadattatore-ligated. Trasferire sul ciclore termico che è stato preriscaldato a 28 gradi centigradi e incubare per 1 h.
   10. Trasferire immediatamente sul ghiaccio e procedere ulteriormente con i campioni o conservarli a -20 gradi centigradi per un uso futuro.
   11. Per eseguire RT-PCR, utilizzare 6 l'l di ogni RNA con adattatore e aggiungervi 1 L di RNA RT primer. Trasferire al ciclore termico che è stato preriscaldato a 70 gradi centigradi. Incubare per 2 min.
   12. In un tubo separato, mescolare 2 luna di 5 x cuscinetto di filamento, 0,5 ll di 12,5 mM dNTP, 1 L da 100 mM DTT, 1 l di inibitore di RNase e 1 l l di trascrizione inversa. Aggiungere 5,5 l di questa miscela all'RNA isolato dall'adattatore e trasferirlo al ciclore termico che è stato preriscaldato a 50oC. Incubare per 1 h.
   13. Trasferire immediatamente il cDNA con collegamento dell'adattatore nel ghiaccio.
   14. In un tubo separato, mescolare 25 l di mix PCR, 2 l of RNA PCR primer, 2 l dell'indice RNA PCR primer e 8,5 l di acqua senza RNase. Aggiungere 37,5 ll di questo mix a 12,5 litri di cDNA con collegamento di adattatori. Trasferire al ciclore termico che è stato preriscaldato a 98 gradi centigradi. Programmare il ciclonte termico come suggerito nel protocollo del produttore con il numero di ciclo modificato a 15 invece di 11.
       NOT: Le sequenze di tutti i primer utilizzati sono elencate in Tabella dei materiali.
   15. Conservare i campioni a 4 gradi centigradi dopo il completamento. Procedere con loro o conservare a -80 gradi centigradi per un uso futuro.
2. Purificare ed eseguire il controllo di qualità per il cDNA legato.
   NOT: Il cDNA amplificato è stato purificato in gel seguendo il protocollo del produttore, fatta eccezione per alcune modifiche per migliorare la qualità e la resa dei campioni di cDNA purificati, come spiegato di seguito.
   1. Utilizzare 6% gel di poliacrilammide TBE per purificare il cDNA amplificato. Diluire la scala ad alta risoluzione (HRL) e la scala RNA personalizzata (CRL) con volumi uguali di colorante per il carico di DNA.
   2. Aggiungere 10 l di dna loading dine ad ogni campione di cDNA. Eseguire 30 l di ogni campione in due corsie separate adiacenti l'una all'altra con CRL e HRL nello spazio intermedio tra i due campioni diversi.
   3. Eseguire il gel in 1x tampone TBE a 145 V per circa 30-40 min.
      NOT: Tenere traccia della parte anteriore blu inferiore del colorno di carico. Fermare l'elettroforesi quando si avvicina al fondo del gel.
   4. Trasferire il gel nel buffer TBE 1x con Ethidium Bromide (EtBr) a 0,5 g EtBr/1mL 1x TBE.
      ATTENZIONE: EtBr è un cancerogeno noto e ogni passo da qui fino a quando l'escissione dal gel deve essere eseguita con estrema cautela.
   5. Visualizzare il gel in un transilluminatore e tagliare il gel con precisione tra il marcatore 145 bp e 160 bp.
      NOT: I dimeri dell'adattatore sono molto vicini al marcatore 145 bp. Pertanto, tagliare il gel leggermente sopra il marcatore 145 bp per evitare la contaminazione con il dimero dell'adattatore.
   6. Trasferire il gel nei tubi di rottura del DNA conservati in tubi di raccolta da 2 mL. Girare a 20.000 x g per 2 min.
   7. Per eseguire la precipitazione del DNA, il giorno successivo trasferire il contenuto del tubo a tubi filtranti 5 m. Girare a 600 x g per 10 s.
      NOT: Non lasciare che i tubi girino più a lungo di 10 s mentre il gel passa attraverso il filtro.
   8. Aggiungete 2 luna di glicogeno, 30 luna di 3 M NaOAc, 2-L di 0,1x di vernice a pellet e 975 luna di 100% di etanolo al DNA eluito. Girare a 17.000 x g a 4 oC per 20 min.
   9. Scartare il supernatante e aggiungere il 75% di etanolo per lavare il pellet. Girare a 17.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Scartare il supernatante e incubare i tubi a 37 gradi centigradi per far evaporare completamente l'etanolo.
   10. Risospendere il pellet con 12 mL di 10 mM Tris-HCl pH 8.5.
   11. Eseguire un controllo di qualità della libreria diluindo il cDNA purificato di 10 x (1:10) e utilizzando 1 : L di cDNA diluito per l'esecuzione su un bio-analizzatore.
   12. Assicurarsi che la dimensione del prodotto cDNA corrisponda alla gamma di rna piccolo (136-160 bp) nell'elettroferogramma. Calcolare la molarità totale per ogni campione. Normalizzare ogni campione a 2 nM utilizzando Tris-HCl pH 8.5.
3. Denaturare e sequenziare il cDNA purificato.
   1. Raggruppare le librerie mescolando volumi uguali di ogni campione da 2 nM in un unico tubo PCR da 200 luna. Aggiungete 10 l di 0,2 N NaOH appena preparati a 10-L di libreria in pool.
   2. Mescolare immediatamente vorticendo e girare a 280 x g per 1 min. Incubare a RT per 5 min.
   3. Aggiungete 10-L di 200 mM Tris-HCl pH da 7 a 20 gradi della libreria denaturata. Mescolare vortice e girare a 280 x g per 1 min.
   4. Aggiungere 970 l di buffer di ibridazione prechilled alla libreria e mescolare bene mediante vortice. La biblioteca è a una concentrazione di 20 pM. Mantenere sul ghiaccio fino a quando non è finalmente diluito.
      NOT: La diluizione finale viene eseguita subito prima di essere eseguita su sequencer.
   5. Aggiungere 117 l l della libreria denaturata a 1.183 l di buffer di ibridazione prechilled. Mescolare invertendo la centrifuga del tubo e dell'impulso. La concentrazione finale della biblioteca è ora 1,8 pM.
   6. Aggiungere 1,3 l di PhiX alla libreria finale di 1,3 mL. Per avviare un'esecuzione su un sequencer, seguire i passaggi sullo schermo sull'interfaccia software, esaminare i parametri di esecuzione, incluso il tipo di lettura (lettura singola), la lunghezza di lettura (numero di cicli per ogni lettura), l'ID della libreria e selezionare Avvia.

5. Analisi dei dati

1. Al termine dell'esecuzione del sequencer, ottenere i dati di sequenziamento risultanti come file fastQ. Utilizzare il software appropriato per analizzare i dati di sequenziamento risultanti.
2. Aprire l'applicazione fastQ toolkit e premere il pulsante Launch.
3. Selezionare i file dall'elenco dei campioni nel software e selezionare dove verranno salvati i dati.
4. Aggiungere un nome di stringa che si applica a ogni sequenza tagliata. Mantenere la severità a 0,9. Immettere la sequenza dell'adattatore da tagliare come "TGGAATTCTCGGGCGCCAAGG" dalla fine 3' di ogni campione sequenziato. Espandere la scheda Filtro di lettura e selezionare una lunghezza di lettura minima di "5". Selezionare la casella Conferma e premere il pulsante Continua per avviare il taglio. I file tagliati verranno salvati nella cartella del progetto alla fine dell'analisi.
5. Aprire la piccola applicazione RNA v.1.0 sul software e premere il pulsante Launch.
6. Selezionare il progetto in cui verranno salvati e inviati i file dopo l'analisi.
7. Selezionare la funzione Novel miRs e Differential miRs nell'applicazione. Separare i gruppi come "Control" e "Test" per l'analisi differenziale e aggiungere i file tagliati da analizzare nei rispettivi gruppi.
8. Selezionare il pulsante Avvia per avviare l'analisi. Dopo le analisi, scaricare i file risultanti.

Risultati

La libreria è stata preparata dopo l'isolamento dell'RNA ed è stato eseguito un controllo di qualità. La purificazione del gel per la libreria amplificata di cDNA preparata da RNA isolata da tessuti microdisseci e EV derivati dal siero è illustrata nella Figura 1 e nella Figura 2. La dimensione del prodotto per i miRNA adadattatore corrispondeva a circa 136-160 bp per ogni campione. Figura 1A-B sono contrassegna...

Discussione

In questo articolo, descriviamo un protocollo per isolare l'RNA dai tessuti FFPE e dagli EV derivati dal siero utilizzando kit ottimizzati per aumentare la resa e la qualità degli RNA isolati. Inoltre, gli RNA purificati sono stati utilizzati per generare librerie di cDNA per piccoli sequenziadi di RNA. Entrambi i passaggi elencati sono essenziali per determinare la qualità e la profondità delle letture di sequenziamento che sono il risultato finale della corsa²⁴. Pertanto, l'ottimizzazione di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 M NaOAc pH 5.5	USB Corp.	75897 100 mL
5 µm filter tubes	IST Engineering Inc.	5388-50
6% TBE polyacrylamide gels	Novex	EC6265BOX
BaseSpace	Illumina		Analysis software
Bio-analyzer	Agilent
DNA loading dye	Novex	LC6678
Eppendorf Thermostat plus	Eppendorf 1.5 mL
EtBr	Pierce	17898
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco	111000200
Exosomal RNA isolation kit	Norgen	58000
Gel breaking tubes	IST Engineering Inc.	3388-100
Glycogen molecular biology grade	Thermo Scientifc	R0561
Hematoxylin Select	Stat lab	SL401
Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676	accuSpin Micro 17R
miRNeasy FFPE kit	Qiagen	217504
Nanodrop	Thermo Scientifc	Nano Drop 1000
Nanosight NTA	Malvern	LM14
NextSeq 500 Sequencer	Illumina
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)	Illumina	FC-404-2001
Pellet paint	Millipore	70748-3
Superscript II Reverse Transcriptase	Invitogen	18064014
T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant	Lucigen	LR2D11310K
TBE Running buffer (5x)	Novex	LC6675
Thermal cycler	MJ Research	PTC100
Total exosome isolation reagent (from serum)	Invitrogen	4478360
TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)	Illumina	RS-200-0012
Xylene	Fisher Scientific	X3P- 1GAL
RNA 3' Primer			GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
RNA 5' Primer			TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
Stop Oligo			GAAUUCCACCACGUUCCCGUGG
RNA RT Primer			GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
RNA PCR Primer			AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
RNA PCR Index Primer			CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 bases]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
-	-	-	6 bases in adapter
RNA PCR Index Primer 1			CGTGAT
RNA PCR Index Primer 2			ACATCG
RNA PCR Index Primer 3			GCCTAA
RNA PCR Index Primer 4			TGGTCA
RNA PCR Index Primer 5			CACTGT
RNA PCR Index Primer 6			ATTGGC
RNA PCR Index Primer 7			GATCTG
RNA PCR Index Primer 8			TCAAGT
RNA PCR Index Primer 9			CTGATC
RNA PCR Index Primer 10			AAGCTA
RNA PCR Index Primer 11			GTAGCC
RNA PCR Index Primer 12			TACAAG