Produzione di una piattaforma di distribuzione di vaccini sensibile al vicino all'infrarosso e Core-Shell

Riepilogo

In questo articolo vengono descritti i protocolli utilizzati per produrre una nuova piattaforma di distribuzione di vaccini, "polybubbles", per consentire il rilascio ritardato di burst. Poliesters tra cui politolico-acido co-glicolico) e policaprolactone sono stati utilizzati per formare i polibubbles e piccole molecole e antigene sono stati utilizzati come carico.

Abstract

Le strategie di erogazione dei vaccini che possono limitare l'esposizione del carico al solvente organico, consentendo al contempo nuovi profili di rilascio, sono cruciali per migliorare la copertura delle vaccinazioni in tutto il mondo. Qui, viene introdotta una nuova piattaforma di rilascio di fumpoli iniettabile, curabile e ritardata, chiamata polibolle. Il carico è stato iniettato in polibolo a base di poliestere che si sono formati in una soluzione aques basata sul 10% di carboxymethycellulose. Questo documento include protocolli per mantenere la forma sferica dei polibololi e ottimizzare il posizionamento e la ritenzione del carico per massimizzare la quantità di carico all'interno dei polibololi. Per garantire la sicurezza, il contenuto di solventi clorurato all'interno dei polibolcchi è stato analizzato utilizzando l'analisi dell'attivazione dei neutroni. Studi di rilascio sono stati condotti con piccole molecole come carico all'interno del polibolo per confermare il rilascio di scoppio ritardato. Per mostrare ulteriormente il potenziale di consegna on-demand del carico, i nanorod d'oro sono stati mescolati all'interno del guscio polimero per consentire l'attivazione laser nel vicino infrarosso.

Introduzione

La copertura immunitaria limitata comporta la morte di 3 milioni di persone specificamente causate da malattie prevenibili con^{vaccino 1}. Condizioni di stoccaggio e trasporto inadeguate portano allo stoccaggio dei vaccini funzionali e contribuiscono così a ridurre l'immunizzazione globale. Inoltre, la vaccinazione incompleta dovuta al non aderire ai programmi vaccinale richiesti provoca anche una copertura vaccinale limitata, in particolare nei paesi in via di^{sviluppo 2}. Sono necessarie visite multiple al personale medico entro il periodo raccomandato per ricevere colpi di richiamo, limitando così la percentuale di popolazione con vaccinazione completa. Pertanto, è necessario sviluppare nuove strategie per la fornitura controllata di vaccini per aggirare queste sfide.

Gli attuali sforzi per sviluppare tecnologie di consegna dei vaccini includono sistemi polimerici basati sull'emulsione^3,4. Tuttavia, il carico è spesso esposto a una maggiore quantità di solvente organico che può potenzialmente causare aggregazione e denaturazione, in particolare nel contesto del carico a base di^{proteine 5,6}. Abbiamo sviluppato una nuova piattaforma di consegna di vaccini, "polibolle", che può potenzialmente ospitare più vano di carico riducendo al minimo il volume di carico che è esposto al solvente⁷. Ad esempio, nella nostra piattaforma di polibolletta core-shell, una tasca di carico di diametro 0,38 mm (SEM) viene iniettata al centro di un polibubble da 1 mm. In questo caso, la superficie del carico esposta al solvente organico sarebbe di circa 0,453 mm². Dopo aver considerato la densità di imballaggio delle sfere (microparticelle) all'interno di una sfera (deposito di carico), il volume effettivo di microparticelle (10 m di diametro) che potrebbero essere contenute nel deposito è di 0,17 mm³. Il volume di una microparticella è 5,24x10^-8 mm³ e quindi il numero di particelle microparticelle che possono adattarsi al deposito è di 3,2x10^particelle. Se ogni microparticella ha 20 sacche di carico (a seguito di doppia emulsione) di diametro di 0,25 m, la superficie del carico esposta al solvente organico è di 1274 mm². Il deposito di merci all'interno della polibolletta avrebbe quindi una superficie di 2800 volte inferiore esposta al solvente organico rispetto a quella del carico organico esposto a solventi in microparticelle. La nostra piattaforma a base di poliestere può quindi ridurre potenzialmente la quantità di carico esposta al solvente organico che altrimenti può causare l'aggregazione e l'instabilità del carico.

I polibololi si formano in base al principio di separazione di fase in cui il poliestere in fase organica viene iniettato in una soluzione aques con conseguente bolla sferica. Il carico nella fase aques può quindi essere iniettato al centro della polibolletta. Un altro vano di carico può potenzialmente essere raggiunto all'interno del polibubble mescolando un carico diverso con il guscio polimero. La polibolletta in questa fase sarà malleabile e sarà quindi curata per tradurvi in una struttura in polibolletta solida con carico nel mezzo. I polibololi sferici sono stati scelti su altre forme geometriche per aumentare la capacità di carico all'interno del polibolo, riducendo al minimo le dimensioni complessive del polibolo. Polibololi con carico al centro sono stati scelti per dimostrare il rilascio ritardato burst. I polibololi sono stati incorporati anche con un agente sensibile all'infrarosso (NIR), cioè il nanorod d'oro (AuNR), per causare un aumento della temperatura dei polibololi. Questo effetto potrebbe potenzialmente facilitare una degradazione più rapida e potrebbe essere utilizzato per controllare la cinetica nelle applicazioni future. In questo articolo, descriviamo il nostro approccio per formare e caratterizzare i polibolcchi, per ottenere il rilascio ritardato di scoppio dai polibolcchi e per incorporare AuNR all'interno dei polibolo per causare l'attivazione del NIR.

Protocollo

1. Sintesi del triacrilato policaprolacyone (PCLTA)

1. Asciugare 3,2 mL di 400 da policaprolacyone (PCL) triol durante la notte a 50 gradi centigradi in un flacone di fondo rotondo aperto di 200 mL e K₂CO₃ in una fiala di vetro a 90 gradi centigradi.
2. Mescolare il tris con 6,4 mL di diclorometano (DCM) e 4,246 g di carbonato di potassio (K₂CO₃) sotto argon.
3. Mescolare 2,72 mL di cloruro di acriloile in 27,2 mL di DCM e aggiungere dropwise alla miscela di reazione nel pallone oltre 5 min.
4. Coprire la miscela di reazione con un foglio di alluminio e lasciarlo indisturbato a temperatura ambiente per 24 h sotto argon.
5. Dopo 24 h, filtrare la miscela di reazione utilizzando una carta da filtro su un imbuto Buchner sotto vuoto per scartare i reagenti in eccesso.
6. Precipitare filtrato dal punto 1.5 che contiene il polimero finito nell'etere dietile in un 1:3 (vol/vol) e rotovape a 30 gradi centigradi per rimuovere l'etere dietile.

2. Formazione del polibolo

NOTA: L'iniezione di polimero nell'acqua deionizzata (DI) causerebbe la migrazione dei polibollli verso il fondo della fiala con conseguente appiattimento del fondo. Utilizzare 10% (wt/vol) carboxymethyl cellulosa (CMC) riempire la fiala di vetro invece per evitare l'appiattimento polibubble.

1. Preparare la soluzione CMC 10% (wt/vol) in acqua DI.
2. Riempire una fiala di vetro da 0,92 mL con 0,8 mL del 10% CMC utilizzando un tubo di trasferimento da 1 mL.
3. Mescolare 1000 mg/mL di 14 kDa PCL in DCM e sintetizzare PCLTA in un 1:3 (vol/vol) per un volume totale di 200 L o preparare 200 L di 1000 mg/mL di 5 kDa poli (acido lattico-coglico) diacrilato (AGGA) in cloroformio.
4. Mescolare il 2-idrossi-4-(2-idrossiethoxy)-2-metilpropiophenone (fotoiniziatore) con la miscela polimero (PLGADA o PCL/PCLTA) in 0.005:1 (vol/vol).
5. Caricare 200 L di miscela polimerica in una siringa di vetro da 1 mL montata su una pompa di siringa collegata a un tubo in acciaio inossidabile di erogazione con diametro interno di 0,016 pollici.
6. Utilizzare un micromotore per controllare il movimento in avanti e all'indietro del tubo polimero per iniettare il polimero nel 10% CMC nella fiala di vetro per formare il polibolo.
7. Curare i polibololi sotto ultravioletti (UV) a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm².
8. Il flash congela i polibololi in azoto liquido e liofilizzare durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
9. Separare i polibololi dalla CMC essiccata utilizzando le fopchine e lavare i polibololi con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo. Si noti che altri polimeri possono essere utilizzati probabilmente con modifiche per alterare la cinetica di rilascio.

3. Modulazione del diametro della polibolletta

1. Riempire una fiala di vetro da 0,92 mL con 10% CMC utilizzando un pipetto di trasferimento da 1 mL.
2. Mescolare PCL/PCLTA in un 1:3 (vol/vol) con 1000mg/mL 14kDa PCL e sintetizzare PCLTA. Mescolare il fotoiniziatore con la miscela polimera in un 0.005:1 (vol/vol).
3. Caricare la miscela polimerica in una siringa di vetro da 1 mL montata su una pompa di siringa collegata a un tubo in acciaio inossidabile di erogazione con un diametro interno di 0,016 pollici.
4. Utilizzare un micromotore per controllare il movimento in avanti e all'indietro del tubo polimero per iniettare il polimero nel 10% CMC nella fiala di vetro per formare il polibolo.
5. Per ottenere polibolle con vari diametri, variare la velocità di erogazione da 0,0005 a 1 L/s.
6. Scatta immagini della fiala con i polibolcchi di diametro variabile.
7. Utilizzare ImageJ per quantificare il diametro dei polibolcchi e utilizzare le dimensioni della fiala come scala.

4. Centrare il carico all'interno di polibolle

1. Modulazione della viscosità PCL/PCLTA utilizzando K₂CO₃:
   NOTA: La viscosità di PLGADA non deve essere modificata utilizzando K₂CO₃ perché la viscosità di 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/mL è sufficiente per centrare il carico.
   1. Aggiungere K₂CO₃ (che è stato isolato dopo la reazione PCLTA) al PCLTA a concentrazioni variabili tra cui 0 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL e 60 mg/mL.
   2. Misurare le viscosità dinamiche delle soluzioni modificando la velocità di taglio da 0 a 1000 1/s utilizzando la rieometria.
   3. Iniettare manualmente il carico al centro (fare riferimento al punto 4.2 per preparare la miscela di carico) dei polibololi che si sono formati utilizzando le soluzioni PCL/PCLTA con diverse concentrazioni di K₂CO₃ (punto 4.1.1). Determinare la concentrazione ottimale di K₂CO₃ osservando quale soluzione del punto 4.1.1 può provocare il mantenimento del carico nel mezzo.
2. Centramento del carico (già dimostrato fattibilità con piccole molecole) con CMC
   1. Mescolare il carico con 5% (wt/vol) CMC in un rotatore durante la notte per aumentare la viscosità del carico.
   2. Iniettare manualmente 2 L della miscela di carico nel polibubble e procedere con la poligozza UV a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm².
   3. Il flash congela i polibololi in azoto liquido per 30 s e liophilize durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
   4. Separare i polibololi dalla CMC essiccata utilizzando le finzioni e lavare con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo.
   5. Tagliare la polibolletta a metà e le metà utilizzando la microscopia confocale per garantire che il carico sia centrato (fare riferimento al punto 6 per le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione utilizzate).

5. Formulazione del carico

NOTA: La formulazione di polibolle può ospitare vari tipi di carico, tra cui piccole molecole, proteine e acidi nucleici.

1. Sulla base di studi precedenti, nel caso del carico proteico, utilizzare escipienti tra cui polietilene glicole (PEG)⁶, polivinylpyrrolidone (PVP) e glicopolimeri⁶ per migliorare la stabilità delle proteine durante la formulazione polibubble.
2. Formare polibollli in base al protocollo nel passaggio 2.
3. Preparare la soluzione antigene aggiungendo 17,11 g di trehalose a 625 l di antigene HIV gp120/41.
4. Iniettare manualmente 1 L di soluzione antigene al centro del polibolo.
5. Aprire le polibolle nei giorni 0, 7, 14 e 21 e registrare la fluorescenza dell'antigene con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente 497 nm e 520 nm.
6. Determinare la funzionalità dell'antigene utilizzando l'analisi immunosorsient collegata agli enzimi (ELISA) e utilizzare il 5% di latte non grasso come tampone di blocco.

6. Rilascio del carico

NOTA: Piccole molecole o antigeni possono essere utilizzati come tipo di carico

1. Piccola molecola
   1. Polibololi incubati con acriflavine centrato in 400 L di salina tampone di fosfato (PBS) a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi per i polibubble PLGADA e a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi, 70 gradi centigradi per i polibubble PCL/PCLTA.
      NOTA: Il motivo per cui si consiglia di testare al di sopra delle temperature del corpo è a) simulare la temperatura (50 gradi centigradi) alla quale il polibubble raggiunge mentre si laser per i nanorod d'oro (AuNRs) all'interno di PCL e PLGA; e b) accelerare il processo di degradazione della PCL (50 gradi centigradi, 70 gradi centigradi).
   2. In ogni momento, raccogliere i supernatanti e sostituirli con 400 L di PBS fresco.
   3. Utilizzare un lettore di la tavoletta per quantificare le intensità di fluorescenza nei supernatanti raccolti.
      NOTA: utilizzare ex/em di 416 nm/514 nm per acriflavine.
2. Antigene
   1. Polibololi incubati con siero di albumina bovina centrato (BSA)-488 in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi, 50 gradi per i polibubble PLGADA e a 37 gradi centigradi, 50 gradi centigradi per i polibollli PCL/PCLTA.
   2. In ogni momento, raccogliere i supernatanti e sostituirli con 400 PBS freschi.
   3. Utilizzare un lettore di la tavoletta per quantificare le intensità di fluorescenza nei supernatanti raccolti. Utilizzare ex/em di 497 nm/520 nm per BSA-488.
      NOTA: lo studio del rilascio a 70 gradi centigradi per i polibolcchi PCL/PCLTA non deve essere condotto per evitare di esporre l'antigene a temperature estreme.

7. Tossicità

1. Quantificare il contenuto di cloro nei polibololi utilizzando l'analisi di attivazione neutroni (NAA)
   1. Utilizzare polibololi che sono stati liofilizzati per 2, 4, 6, 20 e 24 h per questo studio a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
   2. Misurare 5-9 mg di polibolcchi e posizionarli su fiale di irradiazione LDPE.
   3. Preparare 1000 g/mL di soluzione di taratura del cloro dall'Istituto nazionale di standard e tecnologia (NIST) soluzione di calibrazione tracciabile.
   4. Utilizzare il reattore Triga da 1 megawatt per effettuare irradiazioni di neutroni su ciascun campione a una velocità di fluenza neutrone di 9,1 ×^{10 12} /cm²per 600 s.
   5. Trasferire le polibolle in fiale non errate.
   6. Utilizzare il rilevatore HPGe per ottenere spettri a raggi gamma per 500 s dopo intervalli di decadimento di 360 s.
   7. Utilizzare il software NAA di canberra Industries per analizzare i dati.
2. Quantificare il contenuto di cloro rilasciato dai poliboloni utilizzando NAA
   1. Polibololi incubati che sono stati lyophilized durante la notte (a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi) in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi.
   2. Raccogliere i supernatanti nelle settimane 1, 2 e 3 dopo l'incubazione.
   3. Analizzare i supernatanti per il contenuto di cloro utilizzando NAA utilizzando lo stesso metodo descritto in precedenza nel passaggio 7.1.

8. Sintesi AuNR di Kittler, S., et al.⁸

1. Preparare la soluzione di semina AuNR mescolando 250 L di acido cloroaurico da 10 mM (HAuCl₄), 7,5 mL di bromuro di cetrimonium da 100 mM (CTAB) e 600 l di 10 mM di boroidride di sodio freddo freddo (NaBH₄).
2. Preparare la soluzione di crescita mescolando 40 mL di CTAB 100 mM, 1,7 mL di 10 mM HAuCl₄, 250 l di nitrato d'argento (AgNO₃) e 270 l di acido ascorbico da 17,6 mg/mL in un tubo.
3. Mescolare vigorosamente 420 L di soluzione di seme con la soluzione di crescita a 1200 rpm per 1 min. Quindi lasciare la miscela indisturbata per reagire per 16 h.
4. Togliere i reagenti in eccesso dalla miscela centrifugando a 8000 × g per 10 min e scartare il supernante.

9. Idrofobicizzazione degli AuNRs di Soliman, M.G., et^al.

1. Regolare il pH di 1,5 mL degli AuNR sintetizzati stabilizzati CTAB a 10 utilizzando 1 mM di idrossido di sodio (NaOH).
2. Mescolare la soluzione con 0,1 mL di 0,3 mM di tioloto metilato (mPEG) a 400 giri/min durante la notte.
3. Mescolare gli AuNR PEGylated con 0,4 M dodecylamine (DDA) in cloroformio a 500 giri/min per 4 giorni.
4. Pipettare lo strato organico superiore contenente AuNR idrofobicizzati e conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso futuro.

10. Attivazione NIR di polibolle

1. Mescolare la soluzione polimerica (PLGADA o PCL/PCLTA) con AuNR idrofobicizzati in un 1:9 (vol/vol).
2. Aggiungere il fotoiniziatore alla miscela polimero-AuNR in un 0.005:1 (vol/vol).
3. Formare polibololi iniettando la miscela polimero-AuNR in una fiala di vetro da 0,92 mL con 10% CMC (wt/vol) (fare riferimento al punto 2).
4. Curare i polibololi a 254 nm di lunghezza d'onda per 60 s a 2 W/cm².
5. Congelamento del flash in azoto liquido per 30 s e liofilizzazione durante la notte a 0,010 mBar vuoto e a -85 gradi centigradi.
6. Separare le polibolecche secche utilizzando le fopchine e lavare con acqua DI per rimuovere qualsiasi CMC residuo.
7. Incubare le polibolelle in 400 L di PBS a 37 gradi centigradi.
8. Attivare i polibololi utilizzando il laser NIR a 801 nm a 8A per 5 min ogni lunedì, mercoledì e venerdì.
9. Scatta immagini a infrarossi (FLIR) lungimirative del polibolo prima e dopo l'attivazione del laser per ottenere i valori di temperatura.
10. Calcolare le differenze di temperatura tra l'attivazione prima e dopo l'attivazione laser in base ai valori di temperatura delle immagini FLIR.

Risultati

I polibololi sono stati ampiamente caratterizzati utilizzando SEM e NAA. Cargo è stato centrato con successo per provocare un rilascio burst ritardato. I polibololi sono stati attivati con successo anche al laser a causa della presenza di AuNR all'interno dei polibololi.

Caratterizzazione polybubble
Polibololi iniettati in una soluzione aques senza CMC hanno provocato una polibolletta appiattita a causa del ...

Discussione

Tecnologie e sfide attuali
Micro- e nanoparticelle a base di emulsione sono stati comunemente utilizzati come portatori di consegna di farmaci. Anche se la cinetica del rilascio del carico da questi dispositivi è stata ampiamente studiata, il controllo della cinetica del rilascio a raffica è stata una grande sfida¹¹. La versatilità e la funzionalità del carico sono limitate anche nei sistemi basati sull'emulsione a causa dell'esposizione del carico ai solventi aques e organ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution	Thermo scientific	34028
2-Hydroxy-2-methylpropiophenone	TCI AMERICA	H0991
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab17152
Acryloyl chloride	Sigma Aldrich	A24109-100G
Acriflavine	Chem-Impex International	22916
Anhydrous ethyl ether	Fisher Chemical	E138-500
Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP)
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher BioReagents	BP9700100
BSA-CF488 dye conjugates	Invitrogen	A13100
Bromosalicylic acid	Acros Organics	AC162142500
Carboxymethylcellulose (CMC)	Millipore Sigma	80502-040
Centrimonium bromide (CTAB)	MP Biomedicals	ICN19400480
Chloroform	Fisher Chemical	C2984
Coating buffer	Abcam	ab210899
Dichloromethane (DCM)	Sigma Aldrich	270997-1L
Diethyl ether	Fisher Chemical	E1384
Dodeacyl Amine	Acros Organics	AC117665000
Doxorubicin hydrochloride	Fisher BioReagents	BP251610
L-ascorbic acid	Acros Organics	A61 100
Legato 100 Syringe Pump	KD Scientific	14 831 212
mPEG thiol	Laysan Bio	NC0702454
Nonfat dry milk	Andwin Scientific	NC9022655
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Phosphate saline buffer	Fisher BioReagents	BP3991
(Poly(caprolactone)	Sigma Aldrich	440744-250G
(Poly(caprolactone) triol	Acros Organics	AC190730250
Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate	CMTec	280050
Potassium carbonate	Acros Organics	AC424081000
Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein	Abcam	ab49054
Silver nitrate	Acros Organics	S181 25
Sodium borohydride	Fisher Chemical	S678 10
Tetrachloroauric acid	Fisher Chemical	G54 1
Trehalose	Acros Organics	NC9022655
Triethyl amine	Acros Organics	AC157910010