Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Riepilogo

Presentiamo un sistema di esposizione in vitro robusto, trasferibile e predittivo per lo screening e il monitoraggio delle particelle trasportate dall'aria sulla loro citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI).

Abstract

Qui presentiamo un sistema modulare di esposizione modulare in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione omogenea delle cellule polmonari umane coltivate all'ALI a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta), fornendo così un realistico l'esposizione della superficie apicale della regione alveolare umana all'aria. A differenza dei modelli di esposizione sequenziale con guida aerosol lineare, la progettazione modulare del sistema a flusso radiale soddisfa tutti i requisiti per la generazione continua e il trasporto dell'atmosfera di prova alle cellule, una distribuzione omogenea e la deposizione di le particelle e la continua rimozione dell'atmosfera. Questo metodo di esposizione è progettato principalmente per l'esposizione delle cellule alle particelle trasportate dall'aria, ma può essere adattato all'esposizione di aerosol liquidi e gas altamente tossici e aggressivi a seconda del metodo di generazione degli aerosol e del materiale dei moduli di esposizione .

Nell'ambito di uno studio di convalida recentemente completato, questo sistema di esposizione si è dimostrato un metodo di screening trasferibile, riproducibile e predittivo per la valutazione qualitativa della citotossicità polmonare acuta delle particelle trasportate dall'aria, potenzialmente riducendo o sostituendo esperimenti sugli animali che normalmente fornirebbeno questa valutazione tossicologica.

Introduzione

L'inalazione di particelle atmosferiche tossiche è un problema di salute pubblica, che porta a una moltitudine di rischi per la salute in tutto il mondo e molti milioni di morti ogni anno^1,2. Il cambiamento climatico, lo sviluppo industriale in corso e la crescente domanda di energia, prodotti agricoli e di consumo hanno contribuito all'aumento delle malattie polmonari negli ultimi anni^3,4,5,6. La conoscenza e la valutazione delle sostanze inalabili per quanto riguarda la loro tossicità acuta per l'inalazione forniscono la base per la valutazione del rischio e la gestione del rischio, ma queste informazioni sono ancora carenti per un'ampia gamma di queste sostanze^7,8. Dal 2006, la legislazione chimica dell'UE REACH (Registrazione, Valutazione, Autorizzazione e Restrizione delle sostanze chimiche) richiede che i prodotti già esistenti e di nuova introduzione siano sottoposti a una caratterizzazione tossicologica, compresa la via di inalazione prima di essere immessi sul mercato. Pertanto, REACH si concentra su metodi alternativi e privi di animali, sull'attuazione del principio "3R" (sostituzione, perfezionamento e riduzione degli esperimenti sugli animali) e sull'uso di adeguati modelli in vitro⁹. Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli diversi e adeguati di test di tossicità per l'inalazione non animale (ad esempio, colture in vitro cellule, modelli polmonari su un chip, fette polmonari tagliate di precisione (PCLS)) al fine di valutare la tossicità acuta dell'inalazione delle particelle trasportate dall'aria^5,7,10,11. In termini di modelli di coltura cellulare in vitro, le cellule coltivate possono essere esposte in condizioni sommerse o all'ALI (Figura 1). Tuttavia, la validità degli studi sull'esposizione sommersa è limitata per quanto riguarda la valutazione della tossicità dei composti trasportati dall'aria, in particolare delle particelle. Le tecniche di esposizione sommerse non corrispondono alla situazione umana in vivo; il mezzo di coltura cellulare che copre le cellule può influenzare le proprietà fisico-chimiche e, quindi, le proprietà tossiche di una sostanza di prova^12,13. I modelli di inalazione alI in vitro consentono l'esposizione diretta delle cellule alle sostanze di prova senza interferenze del mezzo di coltura cellulare con particelle di prova, imitando così l'esposizione umana con una maggiore somiglianza fisiologica e biologica rispetto alle esposizioni sommerse^12,14.

Per i processi normativi come REACH, tuttavia, sono disponibili solo modelli animali nel campo della tossicologia acuta dell'inalazione, in quanto nessun metodo alternativo in vitro è stato sufficientemente convalidato e ufficialmente accettato finora¹⁴. A tale scopo, i modelli di prova devono essere convalidati in base ai requisiti del Laboratorio di riferimento dell'Unione europea per le alternative ai test sugli animali (EURL-ECVAM) sulla validità dei test¹⁵.

Un ex studio di pre-convalida e uno studio di convalida recentemente completato hanno dimostrato con successo l'area di applicazione del sistema di esposizione CULTEX RFS e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilit๳. Questo sistema di esposizione è un sistema di esposizione in vitro basato sulle cellule che consente l'esposizione omogenea delle cellule a gas, particelle o atmosfere complesse (ad esempio, fumo di sigaretta) all'ALI a causa del suo concetto di distribuzione radiale degli aerosol e della conduzione dell'aerosol di prova in un flusso continuo sulle cellule¹⁶. Il modulo di base di questo sistema di flusso radiale è costituito dall'adattatore di ingresso, dal modulo di guida dell'aerosol con distribuzione radiale degli aerosol, dal modulo di campionamento e socket e da un modulo di bloccaggio con una ruota a mano (Figura 2). Le particelle generate raggiungono le cellule tramite l'adattatore di ingresso e il modulo di guida dell'aerosol e si depositano sugli inserti di coltura cellulare, che si trovano nelle tre camere di esposizione disposte radialmente del modulo di campionamento. Il modulo di guida dell'aerosol e il modulo di campionamento possono essere riscaldati collegandosi a un bagno d'acqua esterno¹⁷.

Nell'ambito di entrambi gli studi, le cellule A549 sono state utilizzate per tutti gli esperimenti di esposizione. La linea cellulare A549 è una linea cellulare epiteliale immortalata umana che è molto ben caratterizzata ed è stata utilizzata come modello in vitro per le cellule epiteliali alveolar di tipo II in numerosi studi tossicologici. Le cellule sono caratterizzate da corpi lamellari, la produzione di surfactant e una serie di fattori rilevanti per l'infiammazione¹⁸. Mostrano anche le proprietà delle cellule epiteliali bronchiali a causa della loro produzione di muco¹⁹. Inoltre, possono essere coltivati presso l'ALI. Anche se questa linea cellulare è carente nella costruzione di contatti cellulari, la coltivazione di queste cellule è molto più conveniente, meno costose e i risultati derivati da esse sono indipendenti dal donatore rispetto alle cellule primarie²⁰.

Le cellule A549 sono state seminate in inserti a coltura cellulare a 6 pozzetti (membrana PET, 4,67 cm², dimensione dei pori 0,4 mm) con una densità di 3,0 x 10⁵ celle per inserto e coltivate per 24 h in condizioni sommerse. Le cellule sono state poi esposte in tre laboratori indipendenti per pulire l'aria e tre diverse dosi di esposizione (25, 50 e 100 g/cm²) di 20 sostanze di prova all'ALI. La dose di esposizione è correlata al tempo di deposizione, con un tasso costante di particelle di 25 g/cm^2,50 g/cm² e 100 g/cm² sulle cellule dopo 15, 30 o 60 min, rispettivamente. Le particelle depositate, tuttavia, non sono state lavate via dopo la deposizione, ma sono rimaste sulle cellule per 24 ore. I tempi di deposizione delle particelle erano quindi 15, 30 e 60 min, ma l'esposizione delle cellule è durata per 24 h in totale. Il tasso di deposizione delle sostanze di prova è stato determinato negli esperimenti preliminari secondo i metodi precedenti¹⁷.

La vitalità cellulare come indicatore di tossicità è stata valutata 24 h dopo la deposizione di particelle utilizzando un saggio di fattibilità cellulare. Particolare attenzione è stata posta sulla qualità dei controlli dell'aria pulita, sull'ottimizzazione e perfezionamento del protocollo di esposizione, sulla riproducibilità intra e interlaboratorio e sulla creazione di un modello di previsione (PM). Sostanze che hanno portato a una diminuzione della vitalità cellulare al di sotto del 50% (PM 50%) o 75% (PM 75%) in una delle tre dosi di esposizione è stato considerato un rischio di inalazione acuta. I risultati sono stati poi confrontati con i dati in vivo esistenti (sulla base di almeno uno studio affidabile secondo le linee guida dei test dell'OCSE (TG) 403 o TG 436^21,22), che porta ad una concordanza complessiva dell'85%, con una specificità dell'83% e una sensibilità dell'88%²³.

Oltre alla misurazione della vitalità cellulare, altri endpoint come il rilascio di citochine, l'esame dell'integrità del lisato cellulare o della membrana tramite l'analisi LDH possono essere valutati, ma non sono stati richiesti per lo studio di convalida. Pertanto, il sistema di esposizione (ad esempio, CULTEX RFS) si è dimostrato un sistema di screening predittivo per la valutazione qualitativa della tossicità acuta dell'inalazione delle particelle airotrasportate testate, rappresentando un promettente metodo alternativo alla sperimentazione animale. Il seguente protocollo è raccomandato per gli esperimenti di esposizione alle particelle trasportate dall'aria utilizzando questo sistema di esposizione.

Protocollo

NOTA: il protocollo di un esperimento di esposizione copre un periodo di tre giorni.

Giorno 1

1. Preparati generali e coltivazione di cellule

NOTA: La linea cellulare epiteliale polmonare umana A549 è stata utilizzata per esperimenti di esposizione. Le cellule devono essere maneggiate in condizioni sterili. Possono essere utilizzate altre linee cellulari adatte per la coltivazione all'ALI.

1. Preparare il mezzo di crescita (Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e 5 g/mL di gentilcina) e il mezzo di esposizione (DMEM, integrato con 5 g/mL di genticina e una concentrazione finale di HEPES di 100 mM).
2. Coltura A549 cellule in mezzo di crescita a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata contenente 5% CO₂.
3. Coltivare cellule in coltura cellulare fiaschetta di 75 cm² (T-75) in 14 mL di mezzo di crescita fino a una confluenza di 80-90% prima di dividersi (ogni 2-3 giorni) e un passaggio di 35.
4. Calcolare il volume delle sospensioni e il numero richiesto di inserti di coltura cellulare (tre inserti di coltura cellulare come controlli dell'incubatrice e inserti di coltura cellulare per l'esposizione all'aria pulita e delle particelle) e piastre di coltura cellulare.
5. Prima della provadizzazione e semina delle cellule, aggiungere 2,5 mL di mezzo di crescita temperato a ogni pozzo di una piastra di 6 pozzetti. Posizionare gli inserti di coltura cellulare senza celle con attenzione all'interno dei pozzi e aggiungere 1 mL mezzo di crescita per ogni inserto di coltura cellulare. Incubare le lastre di 6 pozze per almeno 30 min nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO_2).

2. Propsinizzazione delle cellule

1. Temper fosfato buffered salina (PBS) e mezzo di crescita a 37 gradi centigradi e la trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) soluzione a temperatura ambiente.
2. Aspirare il mezzo di coltura cellulare dal flacone di coltura cellulare e lavare le cellule con attenzione con 8 mL di PBS preriscaldato.
3. Rimuovere il PBS, aggiungere 2 mL del trypsin/EDTA (0,05%/ 0.02%) soluzione alle cellule e incubare per il massimo 6 min. nell'incubatrice a 37 gradi centigradi. Controllare il processo di distacco al microscopio.
4. Neutralizzare l'attività della prova aggiungendo un mezzo di crescita preriscaldato da 8 mL, staccare le cellule toccando delicatamente lateralmente sul flacone e risospendere le cellule ripetendo la pipiposizione su e giù.
5. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL. Determinare il numero di cellulare per ulteriori procedure (ad esempio, seeding delle cellule, passaggio di cellule).

3. Determinazione del numero di cellulare

NOTA: la concentrazione cellulare è stata determinata utilizzando un contatore cellulare o camere di conteggio.

1. Diluire 100 l delle sospensioni di coltura cellulare in una tazza riempita con 10 mL di soluzione isotonica. Inclinare lentamente la coppa senza agitare.
2. Determinare il numero di cellule/mL vitali e la vitalità cellulare in base ai parametri di misurazione specifici delle cellule A549.

4. Seeding delle cellule su membrane micropororose negli inserti di coltura cellulare

NOTA: Il sistema di esposizione è dotato di adattatori speciali per consentire l'uso di inserti commerciali di diversi fornitori e di diverse dimensioni. Per questi esperimenti di esposizione, sono state utilizzate piastre a 6 pozze e gli inserti di coltura cellulare corrispondenti. Tutte le fasi di lavoro devono essere fatte in condizioni sterili.

1. Fornire un mezzo di crescita preriscaldato in condizioni sterili di coltura cellulare (flusso laminare).
2. Preparare un volume sufficientemente elevato della sospensione cellulare con una concentrazione cellulare di 3,0 x 10⁵ cellule/mL.
3. Dopo aver temperato le piastre per 30 min, aspirare il mezzo all'interno della coltura cellulare inserisce e semi1 mL di cellule A549 con una densità di 3,0 x 10⁵ celle / mL in ogni inserto di coltura cellulare. Distribuire la sospensione cellulare a dondolo delicato.
4. Incubare gli inserti di coltura cellulare con la sospensione cellulare per 24 h (37 e 5% di CO₂).

5. Pressatura delle sostanze di prova

NOTA: le sostanze di prova sono state pressate in torte in polvere utilizzando una pressa idraulica completamente controllabile. Il pacchetto di stampa può applicare una forza massima di 18 kN, che viene visualizzata come la pressione corrente dell'olio (in barra) del pacchetto di stampa. Le condizioni di stampa (pressione prolungata, tempo di pressatura) di sostanze di prova sconosciute devono essere stabilite e caratterizzate nei test preliminari. A seconda delle proprietà di stampa di una sostanza, è possibile utilizzare diversi parametri di pressatura e tipi di stantuffo di pressione.

AVVISO: Indossare dispositivi di protezione quando si pressano sostanze tossiche o pericolose.

1. Impostare il tempo di pressione tramite il controllo del tempo sul lato anteriore della pressa.
2. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa alla valvola ad aria compressa. Impostare la pressione dell'aria compressa a circa 2 barre (indicata da un misuratore di pressione sul lato anteriore) utilizzando il regolatore di pressione sul lato anteriore della pressa o sulla valvola ad aria compressa dell'alimentazione dell'aria compressa. Estrarre il cassetto, premere il pulsante Press e leggere la pressione sul commutatore di pressione digitale.
   1. Leggere solo la pressione al regolatore di pressione se la pressione è troppo alta o troppo bassa.
3. Assemblare il contenitore di sostanze e assicurarsi che il cilindro di vetro sia centrato correttamente (Figura supplementare 1). Riempire il contenitore di sostanze con una piccola quantità della sostanza di prova. Inserire lo stantuffo nel contenitore della sostanza e girarlo leggermente avanti e indietro per distribuire uniformemente la polvere nel contenitore.
4. Posizionare il contenitore della sostanza con lo stantuffo nel cassetto e premere il pulsante Press. Il pistone idraulico della pressa si sposta sullo stantuffo ed esercita una pressione sulla sostanza di prova per il tempo di pressatura impostato. Aprire il cassetto e rimuovere lo stantuffo.
5. Ripetere i passaggi 5.3 e 5.4 fino a quando il contenitore della sostanza è pieno almeno a metà.
6. Dopo aver completato il lavoro di pressatura, rimuovere il contenitore di sostanze dal cassetto e capovolgerlo per rimuovere le particelle sciolte e depositate.
7. Se il contenitore della sostanza non è necessario nello stesso giorno, chiudere il contenitore della sostanza con parafilm per evitare che la sostanza di prova si secchi o assorba l'umidità.

Giorno 2

6. Assemblaggio del sistema di esposizione e collegamento delle apparecchiature periferiche

NOTA: una visualizzazione più dettagliata è disponibile nella figura 3, Figura supplementare 2 e Figura supplementare 3. Assemblare entrambi i moduli e il generatore di aerosol secondo le istruzioni del produttore.

1. Posizionare il sistema di esposizione su una superficie solida e uniforme, con l'approvvigionamento idrico rivolto in avanti. Collegare i controller di flusso di massa con il generatore di aerosol e una bottiglia a tre collo collegata al modulo per l'esposizione all'aria pulita.
2. Collegare il regolatore di flusso e la pompa a vuoto. Collegare i tubi dai controller di flusso con il connettore a tubo sugli accessori del modulo di guida aerosol. Collegare i tubi sull'altro lato dei controller di flusso con la pompa a vuoto. Assicurarsi che il flusso stia passando dal modulo attraverso i controller di flusso alla pompa a vuoto.
3. Collegare il bagno d'acqua con l'approvvigionamento di acqua di riscaldamento. L'approvvigionamento idrico va dal bagno d'acqua all'ingresso dell'acqua sul modulo di guida dell'aerosol. Collegare la presa d'acqua del modulo di guida dell'aerosol con l'ingresso dell'acqua del modulo di campionamento. Chiudere il cerchio con una connessione dalla presa d'acqua del modulo di campionamento al bagno d'acqua.
4. Posizionare il generatore di aerosol, compreso l'elutriator vicino al modulo di esposizione, e collegare le linee in eccesso dell'elutriatore e del modulo di esposizione e aria pulita con grandi micro filtri, e l'aspirazione delle camere di esposizione con piccoli micro filtri (ad esempio, filtri usa e getta). L'elutriator funge da serbatoio per l'atmosfera di particolato generata e conserva particelle più grandi di circa 7 m, mentre le particelle più piccole vengono trasportate nel modulo di esposizione.
5. Collegare il computer utilizzato per controllare la generazione di aerosol alla porta USB del piano generatore aerosol tramite un cavo USB e l'alimentazione alla porta di alimentazione. Collegare la presa di alimentazione CA dell'unità di alimentazione a una presa (220-240 V).
6. Collegare i tubi per l'alimentazione media e la rimozione con due pompe. Invece di utilizzare una pompa per l'alimentazione media, il mezzo può anche essere riempito manualmente.

7. Preparazione per l'esposizione di aria pulita e particelle

1. Accendere la pompa a vuoto, i controllori di flusso e il bagno d'acqua (37 gradi centigradi) per un periodo di riscaldamento di almeno 30 min.
2. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa. Impostare i controller di flusso di massa a 8 L/min per la linea di alimentazione al generatore di aerosol e a 3 L/min per la linea di alimentazione alla bottiglia a tre colli. Chiudere le schede dei controller di flusso di massa.
   NOTA: Questi valori possono variare a seconda delle caratteristiche della sostanza di prova.
3. Regolare i regolatori di flusso tramite il computer per regolare il flusso del modulo (1,5 L/min) e l'aspirazione della camera (30 mL/min).

8. Test di perdita del sistema di flusso radiale

NOTA: il controllo delle perdite deve essere eseguito sotto vuoto e per entrambi i moduli (modulo di esposizione e aria pulita) per garantire che il modulo sia stato riassemblato correttamente.

1. Rimuovere l'adattatore di ingresso e il riflettore a condensa dal modulo di guida aerosol. Chiudere i tre fori di alimentazione dell'aerosol nel modulo di guida dell'aerosol con spine e le connessioni medie di alimentazione al modulo di campionamento con lembi fittizi.
2. Collegare le linee a vuoto senza il filtro con il connettore a tubo del modulo di guida aerosol. Chiudere il modulo utilizzando la rotellina della mano e misurare il valore dei controller di flusso. I valori dovrebbero diminuire alcuni minuti dopo la chiusura al di sotto di 5 mL/min.
3. Dopo il controllo di impermeabilità, rimuovere tutte le spine e le mbli fittizi, inserire l'adattatore di ingresso e il riflettore a condensa nel modulo di guida dell'aerosol e collegare i tubi per l'alimentazione media e la rimozione.

9. Generazione di aerosol

1. Avviare il computer e il software (Supplementary Figura 4). Avviare il software generatore di aerosol facendo doppio clic sul pulsante di avvio del generatore di aerosol sul desktop del computer. Viene visualizzata una finestra di messaggio in cui viene chiesto se le impostazioni devono essere ripristinate o meno. Fare clic su Sì se il software viene avviato per la prima volta quel giorno. Impostare i valori per Posizione diapositiva e Posizione raccoglitore sui valori predefiniti. Fare clic su No per mantenere i valori per Posizione diapositiva e Posizione raccoglitore oppure la diapositiva non si trova nella posizione iniziale.
2. Avvitare un raschietto di sostanze nel tubo, che si trova nell'apertura centrale del piano generatore di aerosol.
   NOTA: a seconda delle caratteristiche della pressa, è possibile utilizzare tipi distinti di raschiatore di sostanze.
3. Utilizzare il pulsante Homing Mode se il raschietto di sostanza non si trova nella posizione più bassa.
4. Posizionare il contenitore di sostanze con il materiale di prova premuto a testa in giù sopra il raschietto della sostanza. Assicurarsi che il vetro del contenitore di sostanze sia rivolto verso la parte anteriore. Assicurarsi che i due fori nel contenitore della sostanza si adattino ai due perni del piano del generatore di aerosol. Posizionare la piastra di bloccaggio nello slot sopra il contenitore della sostanza e stringere la vite nera.
5. Modificare i valori per Avanzamento (da 0,24 a 20 mm/h) e Rotazione (da 1 a 800 giri/h) con le impostazioni desiderate. La concentrazione di particelle può essere modificata aumentando o diminuendo il valore di alimentazione o la velocità di flusso del gas del vettore.
6. Utilizzare le frecce verso il basso per spingere verso il basso il vetrino con il contenitore di sostanza fino a quando il raschietto di sostanza è vicino alla sostanza premuta.
7. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa al generatore di aerosol con un tocco del controller di flusso di massa e avviare la generazione di aerosol facendo clic sul pulsante Start. Impostare la velocità di avanzamento su 15-20 mm/h per evitare lunghi tempi di attesa.
8. Controllare la corretta generazione di particelle osservando la nube di polvere fine con una piccola torcia elettrica (posizionata dal basso dietro il tubo di vetro dell'Elutriator). Modificare il valore di Feed back alle impostazioni desiderate quando il primo vapore aerosol raggiunge continuamente l'Elutriator e fare clic sul pulsante Stop.

10. Esperimenti di esposizione

1. Avviare l'alimentazione media con un supporto di esposizione preriscaldato e riempire i moduli di campionamento fino a quando i downpipes sono coperti mentre il modulo è aperto. Utilizzare la pompa media o riempire il mezzo manualmente (25 mL per singola camera di esposizione).
2. Inserire inserti di coltura di celle cieche (inserisce senza celle) nel modulo di esposizione. Pompare il mezzo di esposizione verso il basso fino a quando i decanari sono coperti di mezzo e il lato inferiore degli inserti sono a contatto con il mezzo.
3. Avviare il generatore di aerosol, chiudere il modulo di esposizione e collegare il modulo di esposizione alla presa del modulo di esposizione del generatore di aerosol. Dare al generatore di aerosol un tempo di piombo di almeno 20-30 min prima dell'inizio delle esposizioni al fine di consentire una generazione stabile di particelle.
4. Preparare le piastre post-incubazione per i controlli dell'incubatrice e gli inserti della coltura cellulare esposta durante il lead time. Aggiungere 1,5 mL di mezzo di crescita per pozzo e incubare le piastre nell'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO₂).
5. Dopo il lead time, sigillare la presa del modulo di esposizione dell'Elutriator con un tappo di gomma e rimuovere gli inserti ciechi. Riempire il mezzo di esposizione (utilizzando la pompa o manualmente) fino a quando i decanatra sono coperti di mezzo. Ora, aprire anche l'alimentazione di aria compressa al modulo di aria pulita con il rubinetto del regolatore di flusso di massa (3 L/min)
6. Rimuovere gli inserti di coltura cellulare dalle piastre 6-well con l'aiuto di una pinzetta. Versare il mezzo di crescita con attenzione dagli inserti di coltura cellulare rovesciando gli inserti e aspirare e scartare il liquido residuo utilizzando una pipetta. Posizionare gli inserti nelle camere di esposizione di entrambi i moduli, il modulo di esposizione e aria pulita.
7. Chiudere i moduli e avviare contemporaneamente gli esperimenti di esposizione collegando il modulo di esposizione all'uscita del modulo di esposizione del generatore di aerosol e del modulo aria pulita alla rete di gas del vettore.
   NOTA:La concentrazione di particelle può essere modificata aumentando/diminuendo il valore di alimentazione, la portata del gas del vettore o il tempo di esposizione.
8. Scollegare l'esposizione e i moduli d'aria pulita dopo il completamento dell'esperimento e sigillare la presa del modulo di esposizione.
9. Arrestare l'alimentazione dell'aria compressa e il generatore di aerosol facendo clic sul pulsante Stop.
10. Aprire il modulo di esposizione e aria pulita e trasferire gli inserti di coltura cellulare alle piastre post-incubazione preparate utilizzando una pinzetta. Incubare le lastre di 6 pozze per 24 h (37 gradi centigradi, 5% CO₂₎all'ALI.
    NOTA: ripetere i passaggi 10.5 -10.10 se sono previsti ulteriori esperimenti di esposizione.
11. Sollevare gli inserti di coltura cellulare, che vengono utilizzati come controlli dell'incubatrice all'ALI nelle stesse condizioni degli inserti della coltura cellulare esposta e incubarli per 24 h (37 oC, 5% CO₂) all'ALI.
12. Utilizzare il pulsante Homing Mode per rimuovere il contenitore di sostanze. Chiudere il software generatore di aerosol facendo clic sulla X nell'angolo in alto a destra e spegnere il computer.
13. Dopo il completamento di tutti gli esperimenti di esposizione, pulire il generatore di aerosol ed entrambi i moduli di esposizione. Chiudere il contenitore di sostanze con parafilm se la sostanza di prova verrà ulteriormente utilizzata nei prossimi giorni.

Giorno 3

11. Vitalità cellulare

NOTA: La fattibilità cellulare è stata determinata 24 h dopo la deposizione delle particelle misurando l'attività mitocondriale utilizzando il saggio WST-1. Il saggio è stato eseguito secondo il protocollo del produttore. La vitalità cellulare può essere determinata anche utilizzando altri test di fattibilità cellulare (ad esempio, XTT).

1. Mezzo di crescita temperare a 37 gradi centigradi e scongelare la soluzione WST-1 protetta dalla luce. Preparare un numero adeguato di nuove piastre a 6 pozzetti con un mezzo di crescita di 2,5 ml per pozzo e incubare le piastre nell'incubatrice.
2. Preparare la diluizione wsT-1 diluindo una quantità sufficiente di WST-1 1:7 nel mezzo di crescita
3. Inserire gli inserti di coltura cellulare 24 h dopo l'esposizione nelle nuove piastre a 6 pozze preparate. Aggiungere 1 mL della soluzione WST-1 appena preparata a ogni inserto di coltura cellulare. Rocciare le piastre con attenzione al fine di distribuire la soluzione in modo omogeneo sulle cellule. Incubare le lastre a 6 pozze con la coltura cellulare inserti per 1 h (37 gradi centigradi, 5% CO₂).
4. Trasferire 100 l del supernatante in triplicati da ogni 6-po a una piastra di 96 pozze. Misurare l'assorbimento a 450 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 650 nm utilizzando un lettore di microplacino.

12. Statistiche

1. Normalizzare la vitalità cellulare dei singoli controlli dell'incubatrice al 100%.
2. Esprimere la vitalità delle cellule esposte in relazione ai controlli individuali dell'incubatrice. La citotossicità delle sostanze di prova è stata confrontata con i rispettivi controlli dell'incubatrice e utilizzata come indicatore di tossicità.

Risultati

Il CULTEX RFS è un sistema modulare di esposizione in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione diretta e omogenea delle cellule all'ALI. Nell'ambito di un precedente studio di pre-convalida, l'applicabilità generale di questo sistema di esposizione e la sua trasferibilità, stabilità e riproducibilità sono state dimostrate con successo. In un recente progetto di ricerca finanziato dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca, il sistema di esposizion...

Discussione

Negli ultimi anni sono stati sviluppati molti modelli di test di tossicità per l'inalazione non animale al fine di ottenere informazioni sul rischio di inalazione acuta delle particelle inalabili e per ridurre e sostituire gli esperimenti sugli animali secondo il principio 3R²⁵.

In termini di modelli di coltura cellulare, l'esposizione delle cellule può essere effettuata in condizioni sommerse o all'ALI. Esporre le cellule in condizioni sommerse può influenzare le pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
A549	ATCC	CCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEM	Biochrom, Berlin, Germany	FG 0415	used as growth medium
DMEM	Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany	22320	used as exposure medium
FBS superior	Biochrom, Berlin, Germany	S 0615
Gentamycin (10mg/mL)	Biochrom, Berlin, Germany	A 2710
HEPES 1M	Th. Geyer, Renningen, Germany	L 0180
PBS	Biochrom, Berlin, Germany	L 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)	Biochrom, Berlin, Germany	L 2143
Cell culture material
CASY Cups	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651794
Cell culture plates	Corning, Wiesbaden, Germany	3516	6­-well plates
Corning Transwell cell culture inserts	Corning, Wiesbaden, Germany	3450	24mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYton	Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany	REF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)	Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany	2290152
WST-1	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab155902
Instruments + equipment
CASY Cell Counter	Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostat	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic Press	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeve	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)	Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)	Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)	Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany	LP-050	Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)	Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany	9933-05-DQ	Balston disposable filter
Medium pump	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany	Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser	digital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 Pro	Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pump	KNF, Freiburg, Germany	N86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min	TrigasFI GmbH	Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water Bath	LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany	Ecoline Staredition RE 104