Identificare gli inibitori dell'interazione HBx-DDB1 utilizzando un sistema di valutazione di Luciferase diviso

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo per lo screening degli agenti virali anti-epatite B che inibiscono l'interazione HBx-DDB1 utilizzando un sistema di analisi luciferasi divisa. Questo sistema consente una facile individuazione delle interazioni proteina-proteina ed è adatto per identificare gli inibitori di tali interazioni.

Abstract

C'è un urgente bisogno di nuovi agenti terapeutici per l'infezione da virus dell'epatite B (HBV). Sebbene gli analoghi nucleos(t)ide attualmente disponibili inibiscano potentemente la replicazione virale, non hanno alcun effetto diretto sull'espressione di proteine virali trascritte da un DNA circolare virale covalentmente chiuso (cccDNA). Poiché l'elevato carico di antigene virale può svolgere un ruolo in questa carcinogenesi cronica e correlata all'HBV, l'obiettivo del trattamento HBV è quello di sradicare le proteine virali. La proteina regolatoria HBV X (HBx) si lega alla proteina 1 (DDB1) che lega il danno al DNA ospite per degradare la manutenzione strutturale dei cromosomi 5/6 (Smc5/6), con conseguente attivazione della trascrizione virale da cccDNA. Qui, usando un sistema di analisi di completamento della luciferasi divisa, presentiamo un sistema completo di screening composto per identificare gli inibitori dell'interazione HBx-DDB1. Il nostro protocollo consente di rilevare facilmente le dinamiche di interazione in tempo reale all'interno delle cellule viventi. Questa tecnica può diventare un test chiave per scoprire nuovi agenti terapeutici per il trattamento dell'infezione da HBV.

Introduzione

L'infezione da virus dell'epatite B (HBV) è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica in tutto il mondo, con stime annuali di 240 milioni di persone cronicamente infettate da HBV e 90.000 decessi a causa di complicazioni dovute all'infezione, tra cui cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC)¹. Anche se gli attuali agenti terapeutici anti-HBV, gli analoghi nucleos(t)ide, inibiscono sufficientemente la trascrizione inversa virale, raramente raggiungono l'eliminazione delle proteine virali, che è l'obiettivo clinico a lungo termine. Il loro scarso effetto sull'eliminazione delle proteine virali è dovuto alla loro mancanza di effetto diretto sulla trascrizione virale da minicromosomi circolari con chiusura apicale (cccDNA) nel nucleo epatocite².

La trascrizione HBV è attivata dalla proteina X (HBx) regolatrice HBV³. Recenti studi hanno rivelato che HBx degrada la manutenzione strutturale dei cromosomi 5/6 (Smc5/6), un fattore di restrizione dell'ospite che blocca la trascrizione HBV dal cccDNA, dirottando un DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase complex^4,5,6. Pertanto, un passo cruciale nella promozione della trascrizione virale da cccDNA è pensato per essere l'interazione HBx-DDB1. Composti in grado di inibire l'associazione tra HBx e DDB1 possono bloccare la trascrizione virale, e infatti il nitazoxanide è stato identificato come un inibitore dell'interazione HBx-DDB1 attraverso un sistema di screening sviluppato nel nostro laboratorio⁷.

Qui, presentiamo il nostro comodo sistema di screening utilizzato per identificare gli inibitori dell'interazione HBx-DDB1, che utilizza una spaccatura luciferasi di qualità^7,8. Le sottounità luciferasi divise sono fuse in HBx e DDB1, e l'interazione HBx-DDB1 porta le sottounità in prossimità di formare un enzima funzionale che genera un segnale luminoso luminescente. Poiché l'interazione tra le sottounità è reversibile, questo sistema è in grado di rilevare proteine HBx-DDB1 rapidamente dissocianti (Figura 1). Utilizzando questo sistema, una grande libreria composta può essere facilmente esaminata, che può portare alla scoperta di nuovi composti in grado di inibire in modo efficiente l'interazione HBx-DDB1.

Protocollo

NOTA: Una rappresentazione schematica dell'analisi di suddivisione luciferate è illustrata nella Figura 1Ae il processo di analisi è descritto nella figura 1B. La dinamica di interazione può essere misurata in tempo reale senza lisi cellulare.

1. Preparazione delle cellule

1. Mantenere le cellule HEK293T coltivate nel mezzo modificato di Dulbecco Eagle (DMEM) integrato con 10% v/v siero bovino fetale (FBS), 1x penicillina / streptomicina a 37 s nel 20% O₂ e 5% CO₂.
2. Seme 5 x 10⁶ cellule in un piatto da 100 mm con 10 mL di DMEM e incubare a 37 gradi durante la notte.
3. Trasfecti transitori a 1 g di HBx e DDB1 con luciferasi divise nelle cellule secondo il seguente metodo.
   NOTA: La quantità di DNA trascurato plasmide trascurato può dipendere dal reggente di trasfezione utilizzato. La posizione ottimale della lucidferala divisa fusa alla proteina bersaglio deve essere determinata in anticipo. In questo caso, HBx fuso a LgBit al C-terminus di HBx (HBx-LgBit) e DDB1 fuso a SmBit al N-terminus di DDB1 (SmBit-DDB1) ha fornito i migliori risultati (cioè, i segnali luciferase più luminosi). Questo processo è stato riportato in precedenza nel dettaglio⁷.
   1. Diluire 1 g di HBx-LgBit esprimendo plasmide di DNA e 1 g di SmBit-DDB1 esprimendo plasmide di DNA (Tabella dei materiali) nel buffer di condensazione del DNA ( Tabella deimateriali) a un volume totale di 300 L.
   2. Aggiungere 16 l di soluzione di potenziamento (Table of Materials) e mescolare vortice per 1 s.
   3. Incubare il campione a temperatura ambiente per 3 min.
   4. Aggiungete al campione 60 -L di reagente di trasfezione (Table of Materials) e mescolate vortice vortice per 10 s.
   5. Incubare il campione a temperatura ambiente per 8 min.
   6. Durante l'incubazione, aspirare il mezzo di coltura dal piatto (preparato al punto 1.2) e lavare le cellule con 5 mL di salina tampone fosfato (PBS). Rimuovere PBS per aspirazione e aggiungere 7 mL di DMEM.
   7. Aggiungere 3 mL di DMEM al tubo contenente i complessi di trasfezione. Mescolare con pipettaggio e aggiungere i complessi di trasfezione sulla cella nel piatto di 10 cm.
4. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'incubatrice sotto il 5% di CO₂ per 10 h.
5. Reseed le cellule in una piastra bianca 96 bene a 5 x 10⁴ celle / bene in 50 - L di medio/bene secondo il seguente metodo.
   1. Rimuovere il mezzo di coltura delle cellule esaurite e lavare le cellule con 5 mL di PBS.
   2. Rimuovere PBS per aspirazione, aggiungere 1 mL di 0,25% trypsin-EDTA, e incubare a 37 s per 5 min per staccare le cellule.
   3. Aggiungere 4 mL di DMEM e disperdere il mezzo pipeting sulla superficie dello strato cellulare più volte. Trasferire la sospensione della cella in un tubo.
   4. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   5. Scartare supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di PBS.
   6. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartare supernatante.
   7. Diluire il pellet cellulare con un mezzo di coltura cellulare memorizzato nel buffer (Tabella dei materiali) integrato con FBS del 10% a una densità di semina di 1,0 x 10⁶ celle/mL.
   8. Pipette 50 -L di sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di 96 pozzi e riportare le cellule all'incubatrice.
6. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi al di sotto del 5% di CO₂ per 10 h.

2. Screening composto

1. Durante l'incubazione, diluire i composti di screening (Tabella dei materiali)e il solvente (solisco dimetilo [DMSO]) a una concentrazione di 13,5x. Ad esempio, se lo stock è di 10 mM e la concentrazione di screening è di 10 m, aggiungere 1 - L di soluzione stock a 73,1 litri di media di coltura cellulare tampolatata.
2. Aggiungete 12,5 l di substrato luminescente (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo e incubate per 5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Come controlli negativi, i pozze ad entrambe le estremità della piastra (cioè le colonne 1 e 12) non devono contenere alcun substrato luminescente.
3. Misurare la luminescenza della linea di base utilizzando un luminometro (Tabella dei materiali).
4. Subito dopo la misurazione iniziale, aggiungere 5 oL di composti e controllare d'DMSO diluito nel passaggio 2.1 per ogni pozzo.
   NOTA: La concentrazione finale sarà di 10 M.
5. Misurare i valori di luminescenza ogni 30 min per 2 h.
   NOTA: La piastra deve essere incubata al buio a temperatura ambiente.
6. Calcolare gli effetti inibitori confrontati con il trattamento DMSO di controllo dopo la normalizzazione ai segnali di base.
   NOTA: Lo screening di ogni composto in duplicato o triplice può ridurre la variazione.

Risultati

I risultati rappresentativi dopo l'utilizzo di questo protocollo sono riportati nella figura 2A,B. Il rapporto segnale-sfondo era maggiore di 80 e il fattore⁹ (l'indice di qualità standard dell'oro per lo screening ad alta velocità) era maggiore di 0,5, indicando che questo sistema di analisi era accettabile per lo screening ad alto rendimento. Con la soglia impostata su >40% di inibizione rispetto al controllo (solo...

Discussione

Abbiamo sviluppato un comodo metodo di screening usando un saggio di luciferasi diviso per trovare inibitori di legame HBx-DDB1. Le dinamiche di interazione possono essere rilevate in tempo reale nelle cellule viventi senza la necessità di lisi cellulare. L'inibizione dell'interazione HBx-DDB1 porta al ripristino di Smc5/6, che si traduce nella soppressione della trascrizione virale, espressione proteica e produzione di cccDNA⁷. Questo nuovo meccanismo di azione antivirale può superare le inadeg...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM	Greiner-Bio-One GmbH	655098
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
DMSO	Tocris Bioscience	3176
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425	Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent
FBS	Nichirei	175012
GloMax 96 microplate luminometer	Promega	E6521
HBx–LgBit expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-11268
NanoBiT PPI starter systems	Promega	N2015	Includes Nano-Glo Live Cell Reagent
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript
PBS	Takara	T900
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P0781
Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0	Enzo Life Sciences	BML-2841	Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox
SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid	Our laboratory		Available upon request
Trypsin-EDTA	Sigma Aldrich	T4049