Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

Riepilogo

Questo protocollo descrive un processo sperimentale per produrre particelle pseudotimi virali infettive ad alto tipo (pp) con glicoproteine da due ceppi influenzali A e come determinarne l'infettività. Questo protocollo è altamente adattabile per sviluppare pps di qualsiasi altro tipo di virus avvolto con diversi glicoproteine busta.

Abstract

La trasmissione diretta occasionale dell'influenza aviaria altamente patogena Un virus H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 agli esseri umani e la loro letalità sono gravi problemi di salute pubblica e suggeriscono la possibilità di un'epidemia. Tuttavia, la nostra comprensione molecolare del virus è rudimentale ed è necessario studiare le proprietà biologiche delle sue proteine dell'involucro come bersagli terapeutici e sviluppare strategie per controllare l'infezione. Abbiamo sviluppato una solida piattaforma di particelle pseudotimi virali (pp) per studiare il virus dell'influenza aviaria, compresa l'analisi funzionale delle sue emagglutininina (HA) e delle leglicoproteine della neuraminidasi (NA), le caratteristiche di riassortimento degli HA e delle AN, recettori, tropismi, anticorpi neutralizzanti, diagnosi, infettività, ai fini dello sviluppo di farmaci e della progettazione di vaccini. Qui, descriviamo una procedura sperimentale per stabilire pps con le legiole di busta (HA, NA) da due ceppi influenzali A (HAPI H5N1 e 2013 avian H7N9). La loro generazione si basa sulla capacità di alcuni virus, come il virus della leucemia murina (MLV), di incorporare le glicoproteine della busta in un pp. Inoltre, abbiamo anche dettagliato come questi pp sono quantificati con RT-qPCR, e il rilevamento di infettività di virus nativi e non corrispondenti pps a seconda dell'origine delle hA e delle AN. Questo sistema è altamente flessibile e adattabile e può essere utilizzato per stabilire pp virali con legioproteine di busta che possono essere incorporati in qualsiasi altro tipo di virus avvolto. Pertanto, questa piattaforma di particelle virali può essere utilizzata per studiare i virus selvatici in molte indagini di ricerca.

Introduzione

La missione di una particella virale è quella di trasportare il suo genoma da una cellula ospite infetta a una cellula ospite non infetta e di consegnarlo nel citoplasma o nel nucleo in una forma di replica-competente¹. Questo processo è inizialmente innescato dal legame ai recettori cellulari ospiti, seguito dalla fusione di membrane virion e cellulari. Per i virus avvolti, come i virus dell'influenza, le glicoproteine a spillo sono responsabili del legame del recettore e della fusione^1,2. Le letalici virali (ad esempio, pirogeni, antigeni), sono coinvolte in molte importanti proprietà ed eventi, come l'inizio del ciclo di vita dei virus (legatura e fusione), la patogenesi virale, l'immunogenicità, l'apoptosi delle cellule ospiti e il tropismo cellulare, la via endocitica cellulare, così come la trasmissione e il riassortimento delle interspecie^1,3,4,5,6,7. La ricerca sulle glicoproteine della busta virale ci aiuterà a capire molti aspetti del processo di infezione virale. Le particelle virali pseudotipate (pp), anche definite pseudovirioni o pseudoparticelle, possono essere generate attraverso una tecnica di pseudotipizzazione^8,9,10. Questa tecnologia è stata utilizzata per sviluppare particelle pseudotimi di molti virus, tra cui l'epatite C^11,12, l'epatite B¹³, il virus della stomatite vescicolare (VSV)^14,15e il virus dell'influenza^16,17,18,19. Questa tecnologia si basa sulla proteina Gag-Pol dei lentivirus o di altri retrovirus.

Le particelle virali pseudotipate possono essere ottenute utilizzando un sistema a tre plasmidi cotraducendo un plasmide di espressione glicoproteina virale, un plasmide di imballaggio retrovirale che manca il gene dell'involucro e un plasmide reporter separato nelle cellule produttrici di pp. Il retrovirus è assemblato dalla sua proteina Gag, e germoglia da una membrana cellulare infetta che esprime la proteina busta virus¹. Pertanto, è possibile ottenere pps di influenza ad alto titer utilizzando la proteina Gag retrovirus per produrre gemme su una membrana cellulare che esprime influenza HA e NA. Nei nostri studi precedenti, gli HA/NA in tutte le combinazioni erano funzionali e in grado di svolgere le funzioni corrispondenti nel ciclo di vita virale^16,17,18^,20,21. Questi pp sono usati per studiare le caratteristiche biologiche dell'influenza, tra cui l'eagoglutinazione, l'attività neuraminidese, il tropismo legante del recettore HA e l'infettività. Poiché HA e NA sono entrambe importanti proteine funzionali della superficie nel ciclo di vita virale, gli HA e le AN non corrispondenti derivati da diversi ceppi di influenza possono in parte dimostrare il riassortimento tra di loro. Qui, generiamo otto tipi di pp sottinfluenzali combinando due HA e due NA (derivati dal ceppo HPAI H5N1 e la macchia H7N9), utilizzando un sistema di pseudotipida a tre plasmi. Questi otto tipi di pp includono due pp nativi, H5N1pp, H7N9pp; due pps non corrispondenti, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; e quattro pp che ospitano una sola glicoproteina (HA o NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Gli studi sul virus dell'influenza, come H5N1 e H7N9, sono limitati dai requisiti di biosicurezza. Tutti gli studi sui ceppi del virus dell'influenza selvatica devono essere eseguiti in un laboratorio di livello di biosicurezza 3 (BSL-3). La tecnologia delle particelle virali pseudotipata può essere utilizzata per confezionare un virione artificiale in un ambiente di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Pertanto, i pp rappresentano uno strumento più sicuro e utile per studiare i processi del virus dell'influenza a seconda dei suoi due principali glicoproteine: l'emagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA).

Questo protocollo descrive la generazione di questi pps con una strategia di cotransfezione a tre plasmide (panoramica nella Figura 1), come quantificare pps e il rilevamento dell'infettività. La produzione pp coinvolge tre tipi di plasmidi (Figura 1). Il gene gag-pol, che codifica la proteina Gag-Pol retrovirus, è stato clonato da un kit di confezionamento retrovirus e inserito nel plasmide di pcDNA 3.1 e chiamato pcDNA-Gag-Pol. Il gene delle proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP), che codifica la Proteina Fluorescente Verde, è stato clonato dal vettore pTRE-EGFP, inserito nel plasmide di pcDNA 3.1 e chiamato pcDNA-GFP. Durante la clonazione, è stata aggiunta una sequenza di segnale di imballaggio (sezione ) tramite un primer. I geni HA e NA sono stati clonati in un plasmide pVRC, chiamato pVRC-HA e pVRC-NA, rispettivamente. L'ultimo plasmide codifica la proteina di fusione e può essere sostituito con qualsiasi altra proteina di fusione di interesse. La nostra piattaforma di pseudotipigrafia include due plasmidi di espressione glicoproteina: pVRC-HA e pVRC-NA. Questo può semplificare la ricerca sul riassortimento tra diversi ceppi di virus in un ambiente BSL-2.

Protocollo

1. Giorno 1: Coltura cellulare e semina

1. Coltivare il rene embrionale umano (HEK) 293T/17 cellule in piatti da 60 mm con il mezzo essenziale modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 U/mL penicillina-streptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) in un incubatore di biossido di carbonio (CO₂₎a 37 gradi, 5% fino a circa l'80% di confluente.
   NOTA: si consigliano le cellule di passaggio basso HEK 293T/17.
2. Lavare con cura le cellule con 5 mL di fosfato tamponato salina (PBS) 1x.
   NOTA: la movimentazione manuale delle celle HEK 293T/17 deve essere molto delicata, perché si staccano facilmente.
3. Rimuovere PBS e dissociare le cellule con 1 mL di 0,25% soluzione di acido tetraceotico di etilene -etilene (EDTA). Collocare il piatto in un'incubatrice di CO₂ di 37 gradi centigradi per non più di 5 min fino a quando le cellule non vengono dissociate.
4. Disattivare trypsin aggiungendo 5 mL di DCM. Disperdere le cellule in una sospensione a cella singola pipeting su e giù più volte.
5. Trasferire le sospensioni cellulari in un tubo di centrifuga prechilled da 15 mL. Raccogliere le cellule con centrifugazione a 250 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
6. Decant il più possibile il super-natante. Risospendere il pellet cellulare con 6 mL di media DCM e contare le celle. Diluire le celle a 1 x 10⁶ celle / mL con supporto DCM.
7. Semina le cellule in una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di sospensione cellulare per pozzo. Accarezzare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Incubare la piastra durante la notte (14-16 h) in un incubatore di CO₂ a 37 gradi centigradi.

2. Giorno 2: Cotrasfezione a quattro plasmidi mediata dalla Lipofezione

1. Controllare la morfologia cellulare e la densità al microscopio luminoso invertito. Idealmente, le cellule dovrebbero essere circa 85% confluenti alla trasfezione. Sostituire il mezzo con 1 mL di supporto DMEM senza siero per pozzo, quindi rimettere la piastra nell'incubatrice.
   NOTA: la movimentazione manuale delle celle HEK 293T/17 deve essere molto delicata, perché si staccano facilmente.
2. Per ogni pozzo di cellule coltivate da trasfetare, diluire 8 L del reagente di trasfezione ad un volume di 150 l con ridotto siero medio (tubo 1). Mescolare delicatamente e incubare per 5 min a temperatura ambiente (RT, circa 20 gradi centigradi).
   NOTA: Per ogni campione di trasfezione, preparare due tubi di microcentrifuga da 1,5 mL, numerati 1 e 2.
3. Nel tubo 2, diluire 2,5 g di DNA plasmico in 150 l di Ridotto Serum Medium.
   NOTA: nel tubo 2, diluire ogni DNA plasmide come mostrato nella Tabella 1. Un plasmide codifica virus stomatite vestante (VSV) G glicoproteina (pLP-VSVG plasmide) è stato utilizzato come un controllo positivo, perché VSV è in grado di infettare una vasta gamma di cellule. Le particelle di controllo negative che non hanno le glicoproteine dell'involucro influenzale (zenv pps) sono state generate utilizzando pLAsmidi pcDNA-Gag-Pol e pcDNA-GFP.
4. Dopo un'incubazione di 5 min, unire il DNA diluito con la reagente di trasfezione diluita. Mescolare delicatamente e incubare per altri 15 min a RT.
5. Aggiungere il complesso DNA-lipidico al pozzo corrispondente contenente le cellule e il mezzo senza siero. Mescolare delicatamente dondolando la piastra avanti e indietro.
6. Dopo l'incubazione per 4-6 h in un incubatore di 37 gradi centigradi, il 5% di CO_2, rimuovere il mezzo e sostituire con 2 mL di DMEM. Incubare per altri 36-48 h in un incubatore di 37 gradi centigradi, 5% di CO_2.
   NOTA: Sostituire con DMEM senza siero e anticorpi. In questo protocollo, due UD e due DI ad possono essere utilizzate per generare otto tipi di pp (illustrati nella tabella 1).

3. Giorno 3: Semina di cellule suscettibili

1. Per il saggio di infettività, semina ogni tipo di cellule sensibili a 1 x 10⁴ cellule per pozzo in una piastra di 96 pozzetti.
   NOTA: Utilizzare due tipi di cellule bersaglio per eseguire il saggio di infettività in questo articolo: una linea cellulare umana derivata dall'alveolar (cellule A549) e le cellule del rene canino Madin-Darby (MDCK). Le cellule MDCK sono ampiamente utilizzate nella ricerca sull'influenza e possono essere un buon controllo. Questo passaggio è flessibile. Qualsiasi altra linea cellulare bersaglio può essere utilizzata in base ai requisiti di ricerca.
2. Incubare la piastra durante la notte (14-16 h) in un incubatore di CO₂ a 37 gradi centigradi.

4. Giorno 4: Raccolta di particelle virali pseudotipate, quantificazione e test di infezione

1. Raccolta di particelle virali pseudotipate
   1. Controllare il colore del supporto. Idealmente, dovrebbe essere rosa chiaro o leggermente arancione. Esaminare le cellule con un microscopio biologico fluorescente invertito ai sensi di 440-460 nm.
   2. A 36-48 h dopo la trasfezione, raccogliete i pp scorrendo attraverso un filtro a membrana di fluoruro polivinylidene (PVDF) da 0,45 m per eliminare i detriti cellulari.
   3. Dividere gli pps in piccoli volumi.
   4. Conservare gli pps a -80 gradi centigradi.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Tuttavia, questo non è incoraggiato, perché l'infettività degli pps diminuirà bruscamente dopo il congelamento e lo scongelamento.
2. Quantificazione delle particelle virali pseudotipata
   1. Trasferire 20 - L di pp purificati in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml senza microcentrisi.
   2. Aggiungete 1 L di 0,24 U/mL di nucleasi benzonase. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 h per eliminare qualsiasi contaminazione da DNA e RNA.
      NOTA: l'RNA bersaglio, comunemente abbassato di citomegalovirus (CMV)-GFP, è confezionato nel pps e può evitare di essere degradato dalla nucleasi benzonase.
   3. Congelare il campione a -70 gradi centigradi per disattivare la nucleale benzonase.
   4. Aggiungete 2 -L di proteinasi K. Incubare a 50 gradi centigradi per 30 min per digerire le proteine dell'involucro e rilasciare l'RNA CMV-GFP. Inattivare la proteinasi K a 100 gradi centigradi per 3 minuti.
   5. Quantificare i pps in tempo reale in senso in tempo reale con un kit RT-qPCR universale probe One-Step, utilizzando l'anticipo 5'-AACAAAAGCTGGACTCTCTCTGTTTAA-3', il primer inverso 5'-GGCTCTCTTGAGTTGACTAC-3', e la sonda 5'-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCGA-TAM-3', su un termociclista PCR in tempo reale. Normalizzare i pps per il numero di copia dell'RNA prima dell'infettività.
3. Assay di infettività
   1. Diluire ogni tipo di pps in termini di dati qRT-PCR a 4 x 10⁵ copie/mL (normalizzazione pp).
   2. Aggiungere Tosyl-Phenylalalnine Chloromethyl-Ketone (TPCK)-trypsin ad una concentrazione finale di 40 g/mL in pps che ospitano H7N9 HA. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 h per formare le sue sottounità funzionali HA1 e HA2.
      NOTA: Non c'è bisogno di trattare gli pps che ospitano H5 con TPCK-trypsin, perché hanno più residui di arginina e lisina presso il sito di scissione HA1-HA2. Questo sito di scissione multi-basic può essere scisso da ubiquitose proteasi cellulari.
   3. Mescolare pp normalizzati con un supporto DMEM (senza siero) con un rapporto 1:1 (volume/volume).
   4. Portare la piastra contenente cellule sensibili all'armadio di biosicurezza.
   5. Aspirare il supernatante e lavare le cellule una volta con 0,1 mL di PBS preriscaldato.
   6. Aggiungere 0,1 mL di miscela pps-DMEM a un pozzo. Triplicare i test di infettività di ogni tipo di pps a una linea cellulare suscettibile (panoramica nella Figura 2).
   7. Incubare il pozzo 96 per 4-6 h in un incubatore di 37 gradi, 5% di CO_2.
   8. Aspirare il supernatante e sostituire con 0,1 mL di DCM.
   9. Incubare il pozzo 96 per altri 24-36 h in un incubatore di 37 gradi centigradi, con CO_2.

5. Giorno 5 o 6: Rilevamento di infettività

1. Portare la piastra 96 pozzo all'armadio biosicurezza.
2. Aspirare il supernatante e lavare le cellule 1x con 0,2 mL di PBS preriscaldato.
3. Rimuovere PBS e dissociare le celle con 0,1 mL di 0,25% soluzione trypsin-EDTA.
4. Collocare il piatto in un'incubatrice di CO₂ a 37 gradi centigradi per 3 min fino a quando le cellule non vengono dissociate.
   NOTA: Evitare di incubare per più di 5 min, perché questo porterà all'agglomerazione delle cellule.
5. Disattivare trypsin aggiungendo 0,4 mL di DCM.
6. Disperdere le cellule in sospensione a cella singola pipeting su e giù più volte.
7. Trasferire le sospensioni cellulari in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL refrigerato.
8. Determinare le celle gFP reporter-positivo con Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).
   NOTA: per determinare il rapporto tra le celle bersaglio positive del reporter GFP, impostare i cancelli del citometro di flusso utilizzando i campioni di controllo (celle A549 non trattate o celle MDCK) e quindi contare le celle gFP reporter-positivi di 10.000 celle per campione.

Risultati

A seconda della procedura generale descritta in precedenza, abbiamo generato 10 tipi di pp che combinano due HA di gruppo o glicoproteine VSV-G o lecoproteine senza busta (mostrate nella tabella 1). Sette di loro sono contagiosi. Gli pp s che non contengono glicoproteine senza involucro o solo il porto NA non hanno mostrato alcuna infettività qui. La procedura di produzione dell'influenza pp è descritta nella Figura 1. Le micrografie elettroniche di trasmissione di pppp (a...

Discussione

In questo protocollo, descriviamo un metodo per produrre particelle pseudotimi del virus dell'influenza (pp) in un ambiente BSL-2. Il reporter plasmid pcDNA-GFP è incorporato nei pps e può essere utilizzato per quantificare pps da FACS in un assaggio di infettività. Abbiamo scelto due tipi di linee cellulari sensibili perché sono ampiamente utilizzate nella ricerca sull'influenza. Le cellule MDCK fornirebbero un buon controllo alle cellule umane immortalate variabili utilizzate in questi studi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benzonase Nuclease	Millipore	70664	Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well)	Corning	3599	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells)	Costar	3516	Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM)	Gibco	11965092	A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum	Excell	FND500	fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)	Beckman coulter	cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells	ATCC	CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells	ATCC	CRL-11268	A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope	Olympus	BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope	Olympus	CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019	Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit	NEB	E3006L	Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Axygen	MCT-150-C	33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF	Millipore	SLHV033RS	an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	11058021	The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin	Gibco	15140122	Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	430791	a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K	Beyotime	ST532	Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm)	Corning	430166	Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin	Sigma	T1426	This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056