Preparazione delle scime cromosomiche meiotiche da Spermatociti di pesce zebra

Riepilogo

Le creme nucleari sono uno strumento indispensabile per studiare gli eventi cromosomici durante la meiosi. Qui dimostriamo un metodo per preparare e visualizzare cromosomi meiotici durante la profase I dagli spermatociti del pesce zebra.

Abstract

La meiosi è il processo cellulare chiave necessario per creare gameti aploidi per la riproduzione sessuale. Gli organismi modello sono stati determinanti nella comprensione degli eventi cromosomici che si verificano durante la profase meiotica, tra cui l'accoppiamento, la sinapsi e gli eventi di ricombinazione che garantiscono una corretta segregazione cromosomica. Mentre il topo è stato un modello importante per comprendere i meccanismi molecolari alla base di questi processi, non tutti gli eventi meiotici in questo sistema sono analoghi alla meiosi umana. Recentemente abbiamo dimostrato l'entusiasmante potenziale del pesce zebra come modello di spermatogenesi umana. Qui descriviamo, in dettaglio, i nostri metodi per visualizzare i cromosomi meiotici e le proteine associate nei preparati di diffusione cromosomica. Questi preparati hanno il vantaggio di consentire l'analisi ad alta risoluzione delle strutture cromosomiche. In primo luogo, descriviamo la procedura per la sezionamento dei testicoli da pesci zebra adulti, seguita da dissociazione cellulare, lisi e diffusione dei cromosomi. Successivamente, descriviamo la procedura per rilevare la localizzazione delle proteine cromosomiche meiotiche, mediante rilevamento dell'immunofluorescenza e sequenze di acidi nucleici, mediante fluorescenza nell'ibridazione in situ (FISH). Queste tecniche comprendono un utile insieme di strumenti per l'analisi citologica dell'architettura della cromatina meiotica nel sistema del pesce zebra. I ricercatori della comunità dei pesci zebra dovrebbero essere in grado di padroneggiare rapidamente queste tecniche e incorporarle nelle loro analisi standard della funzione riproduttiva.

Introduzione

La riproduzione sessuale procede attraverso la combinazione di due gameti aploidi, ognuno dei quali trasporta metà del complemento cromosomico di una cellula somatica. La meiosi è una divisione cellulare specializzata che produce gameti aploidi attraverso un ciclo di replicazione del DNA e due cicli successivi di segregazione cromosomica. Nella profase I, i cromosomi omologhi (omologi) devono subire l'abbinamento, la ricombinazione e la sinapsi, quest'ultima caratterizzata dalla formazione del complesso sinatonemale che comprende due assi omologi colmati dal subverso, Sycp1 (Figura 1A,B). La mancata esecuzione corretta di questi processi può portare alla produzione di gameti aneuploidi, che sono una delle principali cause di aborti spontanei in esseri umani¹. La nostra conoscenza del coordinamento tra abbinamento, ricombinazione e sinapsi è stata facilitata da studi in una vasta gamma di organismi, come lievito, C. elegans, topo e Drosophila, tra gli altri². Mentre il processo generale di accoppiamento cromosomico omologato seguito dalla segregazione è ben conservato, la sua dipendenza dalla ricombinazione e dalla sinapsi e l'ordine di questi eventi varia.

La formazione meiotica di rottura a doppio filamento (DSB), che avvia una ricombinazione omologa, si verifica vicino ai telomeri raggruppati nel bouquet durante il leptotene e la sinapsi segue poco dopo^3,4. Questa configurazione della formazione e dell'avvio della sinapsi di DSB è anche una caratteristica della meiosi maschile negli esseri umani ma non nel topo^5,6,7,8, suggerendo che il pesce zebra può servire come modello per la spermatogenesi umana. Ci sono anche diversi vantaggi pratici dello studio della meiosi del pesce zebra. Sia i maschi che le femmine subiscono gametogenesi durante l'età adulta, le loro gonadi sono facilmente accessibili e centinaia di prole sono generate da una singola croce. Inoltre, gli embrioni sono trasparenti e si sviluppano esternamente, il che facilita la diagnosi precoce di aberrazioni nello sviluppo embrionale a causa di gameti aneuploidi^3,9. Svantaggi dell'uso di pesci zebra sono che sono lenti a raggiungere la maturità sessuale (60 giorni) e la quantità di materiale necessaria per gli spread di superficie nucleare deve essere raccolta da 10-20 dollari animali adulti, a seconda delle loro dimensioni.

I preparati meiotici sono uno strumento vitale per studiare la dinamica cromosomica in tutti gli organismi modello, poiché è possibile sondare le firme chiave della dinamica cromosomica meiotica. Nel pesce zebra, gli aspetti chiave della progressione del programma meiotico e dell'organizzazione nucleare sono stati sezionati attraverso la sonda di diffusione della superficie nucleare, indicati qui come si diffonde cromosomica, con anticorpi per il rilevamento immunofluorescenza di proteine e/o acidi nucleici da FISH^{3,4,9,10,11,12}. Infatti, la localizzazione polarizzata dei telomeri raggruppati nel bouquet può essere preservata nella preparazione della diffusione (Figura 1C). Recentemente, abbiamo usato i cromosomi di spermatociti zebrati insieme a metodi di rilevamento della fluorescenza e microscopia a super-risoluzione per chiarire la progressione dettagliata della dinamica dei telomeri di pesce zebra, l'abbinamento cromologo omologoso, la localizzazione delle rotture a doppio filamento e la sinapsi alle transizioni meiotiche chiave³. Qui presentiamo metodi per preparare le crescite cromosomiche dagli spermatociti dei testicoli del pesce zebra e successivamente le macchiamo con sonde fluorescenti di acido nucleico peptide (PNA) a sequenze di telomeri ripetute e rilevamento di immunofluorescenza delle proteine associate al cromosoma.

Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono il pesce zebra sono stati effettuati utilizzando standard etici approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'UC Davis.

1. Procedura di diffusione dei cromosomi

NOTA: Il seguente protocollo è progettato per creare 4-6 vetrini, con centinaia di nuclei meiotici diffusi per diapositiva. Il numero di testicoli utilizzati dipenderà dalle dimensioni del pesce. Aspettatevi di utilizzare 20 animali a 60 giorni dopo la fecondazione (dpf) e 15 animali a 6 mesi dopo la fecondazione (mpf). Per i pesci zebra di grandi dimensioni (ad esempio, 12 mpf) dovrebbero essere sufficienti 10 animali. Essere consapevoli del fatto che i testicoli di alcuni mutanti meiotici (ad esempio, spo11^-/-) saranno un po 'più piccoli³. In questo protocollo, un pool di teste viene considerato come un singolo campione. Si raccomanda di preparare in parallelo non più di 4 campioni.

1. Effettuare le seguenti soluzioni prima di iniziare la procedura di diffusione
   NOTA: È conveniente preparare le seguenti soluzioni nelle quantità specificate per l'uso in esperimenti di diffusione futuri.
   1. Preparare una soluzione di saccarosio di 0,1 m sciogliendo 3,42 g di saccarosio in 100 mL di acqua distillata. Portare la soluzione di saccarosio al pH 8 utilizzando 1 M Tris-HCl che è anche a pH 8. Quindi filtrare sterilizzare la soluzione di saccarosio. Conservare a temperatura ambiente.
   2. Rendere una soluzione di stock salina (PBS) con buffer di fosfato per una concentrazione finale di 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na₂HPO₄ e 27,6 mM KH₂PO₄ in 1,8 L di acqua distillata. Mescolare fino a dissoluzione, quindi regolare pH a 7.3 utilizzando NaOH e autoclave. Conservare a temperatura ambiente.
   3. Fare una soluzione di 400 g/mL DNase I in acqua distillata sterile. Conservare a -20 gradi centigradi. Si consiglia di preparare 5 mL di questa soluzione e quindi conservare come 100 aliquote.
2. Effettuare le seguenti soluzioni il giorno del protocollo di diffusione
   NOTA: Per l'efficienza del tempo, è meglio fare la soluzione di collagenasi immediatamente dopo aver sezionato tutti i testicoli e quindi fare le soluzioni inibitori della trypsin e della tripsina durante il tempo in cui i campioni vengono trattati in collagenase.
   1. Sciogliere 4 mg di collagenasi in 200 gradi l del mezzo Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) per campione (2% w/v di collagenana Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. La collagenase dissocierà i testicoli.
   2. Sciogliere 1,4 mg di metapsina in 200 : L di DMEM per campione (0,7% w/v tryps in concentrazione finale). Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. La trypsin aiuterà a dissociare le cellule.
   3. Sciogliere 10 mg di inibitore della tripsina in 500 :L di DMEM per campione (2% w/v trypsin inibitore concentrato finale). Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. L'inibitore della orpsina impedisce alla trypsin di degradare le cellule.
   4. Preparare una soluzione di formaldeide dell'1% (da una soluzione pre-made del 16%) con 0,15% Triton X-100 in acqua distillata sterile. Tenere sul ghiaccio fino a quando necessario. L'1% di formaldeide può essere preparata mentre i testicoli sono trattati con trypsin e DNase I (cioè durante la fase 1.4.7 della procedura di diffusione).
      AVVISO: La formaldeide è pericolosa.
3. Dissezione dei testicoli da pesci zebra maschi adulti
   1. Eutanasia il pesce zebra maschile (> 60 dpf) immergendoli nell'acqua ghiacciata. I pesci possono essere tenuti in acqua ghiacciata fino a quando non sono pronti a sezionare, tuttavia dovrebbero essere sezionati il prima possibile.
      NOTA: Il ceppo di tipo selvaggio AB viene utilizzato per questa procedura, ma anche altri ceppi di tipo selvatico dovrebbero essere suscettibili. Il tempo più lungo che abbiamo mantenuto il pesce in acqua ghiacciata prima della dissezione è 3 h senza alcun effetto evidente sul protocollo.
   2. Decapitare un pesce alla volta con piccole forbici e quindi utilizzare micro forbici per tagliare lungo la linea mediana ventrale per esporre la cavità del corpo.
   3. Dissezionare il testis utilizzando pinze (vedi Tabella dei materiali)con ingrandimento 1,65x al microscopio. Eseguire le dissezioni in una piastra Petri rivestita in silicone con coperto da una piscina poco profonda di 1x PBS.
      NOTA: Il testico si trova tra la vescica da bagno e l'intestino e apparirà più leggero del tessuto muscolare (Figura 2A). Il testico deve avere 2 lobi quando viene rimosso dal pesce zebra (Figura 2B).
   4. Rimuovere il maggior contenuto di grasso e tessuto circostante dal testire è possibile. Quindi aggiungere ogni testicolo sezionato direttamente in un tubo da 5 mL con 2 mL di DMEM e tenere sul ghiaccio.
      NOTA: i passaggi 1.3.3 e 1.3.4 devono essere masterizzati prima di eseguire qualsiasi esperimento.
4. Dissociazione delle cellule dei testicoli
   1. Pre-caldo 100 mL di 0,1 M soluzione di saccarosio a 37 gradi centigradi.
   2. Aggiungere 200 l di soluzione di collagenasi al tubo da 5 mL con i testicoli. Mescolare la soluzione invertendola più volte.
   3. Agitare delicatamente i testicoli in uno shaker incubatore orizzontalmente a 300 giri a 32 gradi centigradi per 50 min a un'ora fino a quando il DMEM è nuvoloso e i testicoli sono a pezzetti. Invertire rapidamente il tubo ogni 10 min per facilitare la dissociazione.
   4. Per lavare il collagenasi, aggiungere DMEM ad un volume finale di 5 mL e invertire il tubo un paio di volte. Pellet i testicoli a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente. Rimuovere 3 mL del supernatante in modo che rimangano solo 2 mL.
      NOTA: L'aggiunta, la rimozione e il trasferimento di DMEM viene effettuato con pipette di trasferimento in plastica per l'intera procedura di diffusione del cromosoma.
   5. Ripetere il passaggio 1.4.4 altre due volte per un totale di 3 ormeggi DMEM. Non risospendere il pellet tra i ventilatori DMEM. Dopo l'ultimo lavaggio DMEM, rimuovere 4 mL del supernatante in modo che rimanga solo 1 mL.
   6. Aggiungere 1 mL di DMEM per un volume totale di 2 mL e aggiungere 200 l della soluzione trypsin e 20 l of DNase I. Invertire il tubo un paio di volte per mescolare la soluzione.
   7. Agitare in modo orizzontale il tubo a 32 gradi centigradi per 5-15 min a 100 giri/m fino a quando la soluzione DMEM non contiene solo pochi grumi. Invertire rapidamente il tubo ogni 5 min per facilitare la dissociazione.
      NOTA: I grumi devono essere notevolmente più piccoli dopo lo scuotimento.
   8. Aggiungete 500 l della soluzione inibitore della trypsin e 50-L di soluzione DNase I. Invertire il tubo un paio di volte per mescolare, poi girare brevemente verso il basso a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente per rimuovere liquidi o grumi che possono aderire al tappo del tubo o il lato del tubo.
   9. Posizionare il tubo sul ghiaccio e risospendere la sospensione cellulare ripetutamente pipetting su e giù con una pipetta di trasferimento di plastica per 2 min per facilitare la dissociazione di eventuali grumi rimanenti. Non lasciare che la sospensione cellulare vada nella lampadina della pipetta di trasferimento. Dopo i 2 min, pipette la sospensione di nuovo nel tubo 5 mL.
   10. Pre-bagnato di un colino da 100 m con DMEM e posizionarlo sopra un tubo da 50 mL sul ghiaccio.
   11. Trasferire la sospensione cellulare attraverso il colino una goccia alla volta utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica. Assicurarsi che la sospensione cellulare non entri nella lampadina della pipetta di trasferimento.
   12. Trasferire il filtrato utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica in un nuovo tubo da 5 mL e aggiungere DMEM ad un volume finale di 5 mL. Assicurarsi di raccogliere le celle raggruppate attaccate alla parte inferiore del filtro con una pipetta di trasferimento di plastica pulita. Pellet le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente.
   13. Rimuovere il maggior numero possibile di supernatali senza disturbare il pellet.
   14. Aggiungete 5 -L di Soluzione DNase I direttamente nel pellet. Quindi mescolare il pellet con la soluzione DNase I raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo 4-5 volte lungo un rack tubo di microcentrifuga vuoto da 1,5 mL. La raschiatura troppo dura può comportare una riduzione degli spread recuperati.
   15. Aggiungere DMEM ad un volume finale di 5 mL e mescolare la soluzione invertendo il tubo più volte. È comune che i grumi siano ancora presenti dopo il primo trattamento DNase I.
   16. Pellet la sospensione cellulare a 200 x g per 2 min a temperatura ambiente.
   17. Ripetere i passaggi 1.4.13-1.4.16 un'ulteriore 1-3 volte fino a quando il pellet risospeso non si agglomera al momento dell'aggiunta di DMEM. Dopo l'ultimo giro, rimuovere il maggior numero possibile di supernatali senza disturbare il pellet.
       NOTA: Aspettatevi una riduzione delle dimensioni del pellet ad ogni trattamento DNase I; superando 4 lavamenti DNase I possono provocare una significativa perdita di cellule. Se dopo i passaggi dei trattamenti DNase I non è visibile alcun pellet, non procedere con la procedura. Eliminare qualsiasi DNase I inutilizzato.
   18. Aggiungere 1 mL di 1x PBS e risospendere il pellet raschiando delicatamente il fondo esterno del tubo lungo un rack tubo vuoto da 1,5 mL.
   19. Pellet la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min poi rimuovere il maggior numero di supernatante possibile senza disturbare il pellet.
   20. Tagliare 3 mm dall'estremità di una punta di pipetta da 200 , per allargare l'apertura e sospendere il pellet in soluzione di saccarosio di 0,1 M, pipeting su e giù con la punta pipetta tagliata. Lasciare che le sospensioni cellulari si siedano a temperatura ambiente per 3 min.
5. Diffusione cromosomi su vetrini di vetro
   1. Coprire uno scivolo con 100 l una slitta dell'1% con 0,15% Triton X-100 con il lato di una punta di pipetta. Quindi aggiungere 18 - L della sospensione della cella di saccarosio al centro della diapositiva in una linea retta perpendicolare al bordo lungo. Inclinare lo scivolo avanti e indietro di (60 gradi) per facilitare la diffusione della sospensione della cella a tutti gli angoli.
   2. Posizionare i vetrini in una camera di umidità aperta leggermente incrinata (Figura 3) per evitare che la soluzione di formaldeide si secchi. Collocare la camera di umidità in un cassetto scuro durante la notte.
   3. Togliere il coperchio dalla camera di umidità e lasciare che i vetrini si asciughino completamente.
   4. Mettere i vetrini in un barattolo Coplin quindi riempire il vaso Coplin con acqua distillata e incubare per 5 min con agitazione delicata a temperatura ambiente.
      NOTA: Le diapositive possono essere posizionate nel barattolo Coplin in un motivo a zig-zag per massimizzare il numero di diapositive per vaso Coplin. Assicurarsi che ci sia spazio per il liquido di passare tra tutte le diapositive.
   5. Versare l'acqua e riempire il barattolo con 1:250 agente bagnanti (vedere Tabella dei materiali). Lavare 2 volte per 5 min ciascuno con agitazione delicata a temperatura ambiente.
   6. Lasciare asciugare completamente i vetrini e conservarli a -20 gradi centigradi fino a quando non sono macchiati.
      NOTA: Il più lungo abbiamo memorizzato diapositive senza alcuna degradazione evidente dei cromosomi è di 2 mesi.

2. Colorazione sonda Telomere PNA

NOTA: le ripetizioni di telomeri possono essere macchiate utilizzando sonde PNA di telomeri coniugate con fluoroforo che si ibridano alle ripetute dei telomeri del filamento (CCCTAA). Le sonde PNA hanno una spina dorsale neutra, che aumenta l'affinità di ibridazione al DNA caricato negativamente, risultando in poco o nessun background. La fase di sonda dei telomeri è facoltativa. Per procedere alla colorazione degli anticorpi, reidratare i vetrini in 1x PBS come indicato al punto 2.2.2., quindi procedere direttamente alla "colorazione primaria degli anticorpi".

1. Rendere i reagenti della sonda PNA prima di iniziare la colorazione dei telomeri
   NOTA: è conveniente preparare le seguenti soluzioni nelle quantità specificate per l'uso in esperimenti futuri. Le condizioni di conservazione sono indicate di seguito.
   1. Preparare 2 L di 20x citrato saline-sodio (SSC) con una concentrazione finale di 3 M NaCl e 0,3 M di citrato di sodio. Autoclave e conservare a temperatura ambiente.
   2. Creare 50 mL di soluzione di pre-ibridazione contenente l'RNA di trasferimento a una concentrazione finale del 50% di formamide, 5x SSC, 50 g/mL di eparina, 500 RNA di trasferimento g/mL, 0,1% Tween 20 e aggiungere 460 - L di 1 M di acido citrico per portare la soluzione a pH 6. Conservare a -20 gradi centigradi.
      AVVISO: Formamide è pericoloso. Preparare la soluzione in una cappa di fumi.
   3. Preparare 50 mL di soluzione di pre-ibridazione allo stesso modo del passaggio 2.1.2 senza aggiungere RNA di trasferimento. Conservare a -20 gradi centigradi.
   4. Le sonde in telomeri PNA TelC-Cy3 e TelC-Alexa647 sono preparate come 50 stock di m in formamide come da istruzioni del produttore. Conservare le sonde PNA come 8 - L aliquote a -80 gradi centigradi.
   5. Fare almeno 1 mL di 100 mg/mL soluzione stock di albumina siero bovina (BSA) in acqua distillata sterile. Conservare a -20 gradi centigradi. Se si preparano più di 1 mL di magazzino BSA, memorizzare la soluzione come 1 aliquote mL.
   6. Utilizzando un tubo da 2 mL, preparare 2 mL di soluzione di ibridazione aggiungendo 27 -L di 100 mg/mL BSA e 8 -L di 50 sonda PNA a 1,965 mL di soluzione di pre-ibridazione contenente RNA di trasferimento. Conservare al buio a -20 gradi centigradi.
2. Colorazione sonda telomeri PNA
   1. Preriscaldare il forno di ibridazione a 82 gradi centigradi.
   2. Reidratare i vetrini con 500 l-L di 1x PBS per scivolo per 5 min in una camera di umidità a temperatura ambiente. Rimuovere il PBS toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
   3. Riscaldare i vetrini e il tubo da 2 mL contenente la soluzione di ibridazione direttamente su una superficie metallica nel forno di ibridazione riscaldato per 2 min.
   4. Mantenendo i vetrini sulla superficie metallica, aggiungere 100 l della soluzione di ibridazione per diapositiva e quindi coprire i vetrini con copricapi in plastica (25 mm x 75 mm) tagliati fuori da un sacchetto di autoclave. Lasciare sciacquare gli scivoli a 82 gradi centigradi per 10-12 min.
   5. Collocare i vetrini in una camera di umidità al buio a 37 gradi centigradi per 16-24 h. Da questo punto in avanti e per la colorazione dell'anticorpo primario e secondario, i vetrini devono essere tenuti al buio per evitare il fotosbiancamento del segnale di fluorescenza. Dopo il periodo di incubazione, i reagenti per la colorazione degli anticorpi possono essere preparati durante la fase 2.2.9.
   6. Rimuovere i copricopertine con una punta di pipetta.
      NOTA: Per facilitare la rimozione del coperchio, è possibile erogare delicatamente l'uso della soluzione di ibridazione senza RNA di trasferimento tra il vetrino e il coperchio quando il coperchio viene sollevato.
   7. Pipette 500 - L di pre-ibridazione senza RNA di trasferimento su ogni vetrino e posizionare i vetrini nella camera di umidità per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
      NOTA: La soluzione di pre-ibridazione senza RNA di trasferimento non viene preriscaldata prima di essere aggiunta a ogni diapositiva.
   8. Pipetta 500 - L del 50% di pre-ibridazione senza RNA di trasferimento in 1x PBS su ogni vetrine e posizionare i vetrini nella camera di umidità per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
   9. Trasferire i vetrini in un barattolo Coplin e lavare 3 volte in 1x PBS con agitazione delicata per 15 min per lavaggio a temperatura ambiente.
   10. Rimuovere i vetrini dal barattolo Coplin e rimuovere il PBS in eccesso toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta. Quindi procedere al passaggio 3.2 "Colorazione anticorpale primaria".

3. Colorazione anticorpale

NOTA: gli anticorpi allevati a proteine meiotiche note possono essere utilizzati per il rilevamento dell'immunofluorescenza nei preparati ai cromosomi diffusi. Gli anticorpi secondari coniugati a diversi fluorofori consente di colorare contemporaneamente più proteine, se gli anticorpi primari sono stati allevati in animali diversi.

1. Effettuare le seguenti soluzioni il giorno della colorazione degli anticorpi primari e secondari
   1. Fare 1 L di PBT con 1x PBS e 0.1% Triton X-100 diluito in acqua distillata. Conservare a temperatura ambiente. Questo può essere preparato in anticipo e in grandi quantità per futuri esperimenti di diffusione.
   2. Preparare 500 l di blocco dell'anticorpo per diapositivtivo ad una concentrazione finale di 2 mg/mL di BSA e 2% siero di capra in PBT.
   3. Per fare 100 l di miscela di anticorpi primari o secondari per diapositiva, aggiungere gli anticorpi appropriati alla corretta concentrazione (vedi Tabella dei materiali) nel blocco anticorpale.
      NOTA: Potrebbe essere necessario determinare empiricamente la concentrazione di anticorpi. Nella discussione, includiamo un elenco di anticorpi che abbiamo provato con successo (con diluizione/concentrazioni) e quelli che abbiamo provato senza successo.
2. Colorazione anticorpale primaria
   NOTA: Coniglio anti-umano SCP3 e pollo anti-zebrafish Sycp1 sono tipicamente utilizzati per la colorazione anticorpale primaria.
   1. Dopo aver rimosso il PBS in eccesso dai vetrini, aggiungere 500 l di blocco anticorpo per diapositiva e posizionare i vetrini in una camera di umidità a temperatura ambiente per un minimo di 20 min.
   2. Rimuovere il blocco anticorpo toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
   3. Aggiungere 100 l di miscela di anticorpi primari nel blocco anticorpo per vetrina e coprire i vetrini con un coperchio di plastica realizzato da un sacchetto di autoclave. Collocare i vetrini in una camera di umidità durante la notte a 4 gradi centigradi.
   4. Rimuovere i coperchi con una punta di pipetta e lavare i vetrini 2 volte per un minimo di 5 minuti ciascuno con 1x PBS in un barattolo Coplin con leggera agitazione a temperatura ambiente.
   5. Rimuovere il PBS toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
3. Colorazione anticorpale secondaria
   NOTA: Gli anticorpi contro il coniglio e l'anti-pollo coniugati a diversi fluorofori vengono utilizzati per la colorazione ad una concentrazione di 1:1000.
   1. Aggiungere 500 l di blocco anticorpale per diapositiva e posizionare i vetrini nella camera di umidità a temperatura ambiente per un minimo di 5 min.
   2. Rimuovere il blocco anticorpo toccando il lato del vetrino su un tovagliolo di carta.
   3. Aggiungere 100 l di miscela di anticorpi secondari nel blocco anticorpo per vetrine e coprire i vetrini con un coperchio di plastica fatto da un sacchetto autoclave. Collocare i vetrini in una camera di umidità per 1 h a 37 gradi centigradi.
   4. Rimuovere i copricopertine con una punta di pipetta e lavare i vetrini 3 volte per un minimo di 5 minuti ciascuno con 1x PBS in un barattolo Coplin con leggera agitazione a temperatura ambiente.
   5. Sciacquare gli scivoli una volta per un minimo di 2 min con acqua distillata in un barattolo Coplin con agitazione delicata a temperatura ambiente.
   6. Asciugare all'aria i vetrini inclinati, per facilitare l'essiccazione.
   7. Posizionare 20 l di supporto anti-dissolvenza con o senza DAPI (vedere Tabella dei materiali) come 3 punti equidistanti sui riccielli di vetro (24 mm x 60 mm).
   8. Posizionare i vetrini a faccia in giù sul coperchio del vetro, quindi sigillare i copricapi con smalto sul bordo sovrapponendo l'estremità smerigliata della diapositiva.
   9. Conservare i vetrini preparati a 4 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per l'imaging.

Risultati

Abbiamo delineato un metodo per preparare e visualizzare i preparativi per la diffusione dello spermatocito del pesce zebra. Se eseguita correttamente, la nostra procedura produce nuclei ben diffusi e non sovrapposti. Per recuperare tali nuclei, è importante avere la quantità appropriata di materiale di partenza (cioè testicoli), trattare i testicoli per un periodo di tempo sufficiente nella trypsina e un numero adeguato di trattamenti DNase I. Questi spread possono quindi essere macch...

Discussione

Qui descriviamo i metodi per sondare la posizione dei telomeri e delle proteine associate ai cromosomi nella superficie nucleare si diffonde dagli spermatociti isolati dai testicoli dei pesci zebra. Prevediamo che questi metodi saranno applicabili per l'analisi di spermatociti in altre specie teleost con regolazione delle dimensioni dei testicoli.

Mentre solo pochi anticorpi sono stati sollevati per le proteine meiotiche dei pesci zebra, abbiamo avuto successo usando i seguenti anticorpi solle...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack	Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free	ThermoFisher Scientific	28908
2 mL	Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips	Corning	2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips	VWR International	16004-312
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	363696
Autoclave bag	Several commercial brands available		Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605-100	Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm	Fisher Scientific	08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed	Biotium	203775-500uL	Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1	Generated by Burgess lab	N/A	Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-500MG
Coplin jar	Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas	Roche Diagnostics	10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL	VWR International	89429-308
Formamide	Fisher Scientific	BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11039	Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11042	Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1	Santa Cruz Biotechnology	sc-8973	Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11008	Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012	Use at 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-10mL
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-100KU
Humidity chamber	Fisher Scientific	50-112-3683
Hybridization Oven	VWR International	230401V (Model 5420)
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	Model Classic C25
KCl	Fisher Scientific	P217-500
Kimwipes	Kimerbly-Clark Professional	34155	Used for the humidity chamber
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
Microscope	Several commercial brands available		Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3	Abcam	ab97672	Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1	BD Biosciences	550838	Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA	Sigma-Alrich	MABE285	Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O	Fisher Scientific	S373-500
NaCl	Fisher Scientific	S271-3
Photo-Flo 200 solution	Electron Microscopy Sciences	74257
Plastic transfer pipettes	Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647	PNA Bio Inc	F1013	Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3	PNA Bio Inc	F1002	Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher Scientific	P36971
Rabbit anti-hRPA	Bethyl	A300-244A	Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3	Abcam	ab150292	Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51	GeneTex	GTX100469	Use at 1:300
Sodium citrate	Fisher Scientific	S279-500
Sucrose	Fisher Scientific	S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm	Fisher Scientific	50-822-353	Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit	Fisher Scientific	NC9897184	Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin	Worthington Biochemical	LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white	Sigma-Aldrich	T9253-500MG
Tween 20	Bio-Rad	170-6531	Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors)	Fine Science Tools	15018-10