Visualizzazione della morte delle cellule litiche macrofaschi durante l'infezione micobatterica negli embrioni di pesce zebra tramite la microscopia intravitale

Riepilogo

Questo protocollo descrive una tecnica per visualizzare il comportamento dei macrofagi e la morte nel pesce zebra embrionale durante l'infezione da Mycobacterium marinum. Sono inclusi i passaggi per la preparazione di batteri, l'infezione degli embrioni e la microscopia intravitale. Questa tecnica può essere applicata all'osservazione del comportamento cellulare e della morte in scenari simili che coinvolgono l'infezione o l'infiammazione sterile.

Abstract

Il pesce zebra è un eccellente organismo modello per studiare il comportamento delle cellule immunitarie innate a causa della sua natura trasparente e della dipendenza esclusivamente dal suo sistema immunitario innato durante lo sviluppo precoce. Il modello di infezione mycobacterium di zebre Mycobacterium (M. marinum) è stato ben consolidato nello studio della risposta immunitaria dell'ospite contro l'infezione micobatterica. È stato suggerito che diversi tipi di morte delle cellule macrofafie porteranno ai diversi esiti dell'infezione micobatterica. Qui descriviamo un protocollo che utilizza la microscopia intravitale per osservare la morte delle cellule di macrofaci oinfari negli embrioni di pesce zebra in seguito all'infezione da M. marinum. Le linee transgeniche di pesce zebra che etichettano specificamente i macrofagi e i neutrofili sono infettate mediante microiniezione intramuscolare di M. marinum fluorescente nel midbrain o nel tronco. Gli embrioni di pesce zebra infetti vengono successivamente montati su agarose a bassa fusione e osservati dalla microscopia confocale nelle dimensioni X-Y-Z-T. Poiché l'imaging dal vivo a lungo termine richiede l'utilizzo di bassa potenza laser per evitare la fotosbiancamento e la fototossicità, è altamente raccomandato un'espressione forte di transgenici. Questo protocollo facilita la visualizzazione dei processi dinamici in vivo, tra cui la migrazione delle cellule immunitarie, l'interazione con il patogeno ospite e la morte cellulare.

Introduzione

L'infezione micobatterica è stata dimostrata per causare la morte delle cellule immunitarie^{dell'ospite 1}. Ad esempio, un ceppo attenuato attiverà l'apoptosi nei macrofagi e conterrà l'infezione. Tuttavia, un ceppo virulento attiverà la morte delle cellule littiche, causando la diffusione batterica^1,2. Considerando l'impatto che questi diversi tipi di morte cellulare hanno sulla risposta anti-micobatterica dell'ospite, è necessaria un'osservazione dettagliata della morte delle cellule macrofagage durante l'infezione micobatterica in vivo.

I metodi convenzionali per misurare la morte delle cellule sono di utilizzare macchie cellulari morte, come Annnexin V, TUNEL, o acridina arancione / propidio iodide colorazione^3,4,5. Tuttavia, questi metodi non sono in grado di far luce sul processo dinamico della morte cellulare in vivo. L'osservazione della morte cellulare in vitro è già stata facilitata dall'imaging vivo⁶. Tuttavia, se i risultati imitano accuratamente le condizioni fisiologiche rimane poco chiaro.

I pesci zebra sono stati un ottimo modello per studiare le risposte anti-mycobacterio dell'ospite. Ha un sistema immunitario altamente conservato simile a quello degli esseri umani, un genoma facilmente manipolabili, e gli embrioni precoci sono trasparenti, il che consente l'imaging dal vivo^{7 ,8,9}. Dopo l'infezione da M. marinum, il pesce zebra adulto forma strutture di granuloma mature tipiche, e il pesce zebra embrionale forma il granuloma precoce come le strutture^9,10. Il processo dinamico di interazione immuno-batteri innato è stato esplorato in precedenza nel modello di infezione da pesce zebra M. marinum ^11,12. Tuttavia, a causa dell'elevato requisito di risoluzione spaziale-temporale, i dettagli che circondano la morte delle cellule immunitarie innate rimangono in gran parte indefiniti.

Qui descriviamo come visualizzare il processo di morte delle cellule littiche dei macrofafi innescato dall'infezione micobatterica in vivo. Questo protocollo può essere applicato anche per visualizzare il comportamento cellulare in vivo durante lo sviluppo e l'infiammazione.

Protocollo

Il pesce zebra è stato allevato in condizioni standard in conformità con le linee guida sugli animali di laboratorio per la revisione etica del benessere degli animali (GB/T 35823-2018). Tutti gli esperimenti relativi al pesce zebra in questo studio sono stati approvati (2019-A016-01) e condotti presso lo Shanghai Public Health Clinical Center, la Fudan University.

1. m. marinum Preparazione all'inoculum a cella singola(Figura 1)

1. Scongelare losterolo Cerulean-fluorescente M. marinum e inoculare una piastra di 7H10 agar con 10% (v/v) OADC, 0.25% glicemia e 50 g/mL hygromycin. Incubare la piastra a 32 gradi centigradi per circa 10 giorni.
2. Selezionare una colonia che esprima fluorescenza positiva e inoculare 3 mL di 7H9 medio con 10% OADC, 0.5% glicerolo, e 50 g/mL di igromycina.
   1. Incubare l'inoculazione a 32 gradi centigradi e 100 giri al minuto (rpm) per 4-6 giorni fino a quando la coltura raggiunge la fase logaritmica (OD₆₀₀ - 0,6–1,0).
   2. Sottocultura (1:100) in 30 mL di nuovo mezzo 7H9 con 10% OADC, 0,5% glicerolo, 0.05% Tween-80, e 50 g/mL fino a quando l'OD₆₀₀ raggiunge 1,0 dollari.
      NOTA: per la massima qualità della cultura, si consiglia una fase di sottocultura a questo punto. Nella nostra esperienza, l'aggiunta del clone direttamente a un grande volume di mezzo porterà alla formazione di ciuffi batterici.
3. Raccogliere le cellule M. marinum come descritto di seguito.
   1. Centrifuga a 3.000 x g per 10 min per raccogliere il M. marinum come pellet. Scartare tutto tranne 300 l del super-natante e usarlo per la rassicurante del pellet.
   2. Aggiungere 3 mL di 7H9 medio con 10% glicerolo per risospendere ulteriormente il pellet, quindi sonicare la sospensione in un bagno d'acqua a 100 W a 15 s ON, 15 s OFF per un totale di 2 min.
      NOTA: Lo scopo della sonicazione è quello di ottenere un omogeneo a singola cellula per l'inoculo, che impedirà il blocco dell'ago di microiniezione.
4. Trasferire la sospensione batterica in una siringa da 10 mL, quindi passare attraverso un filtro da 5 m per rimuovere eventuali ciuffi batterici.
5. Misurare la densità ottica (OD) delle sospensioni utilizzando uno spettrofotometro e diluirlo in OD₆₀₀ - 1,0 con supporti 7H9 contenenti il 10% di glicerolo. Dividere la sospensione in 10 gradi e conservare a -80 gradi congelatore per un uso futuro.
6. Confermare la concentrazione batterica dell'inoculo (cfu/mL) mediante diluizione seriale e placcatura del grezzo su una piastra di 7H10 agar contenente il 10% (v/v) dell'OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 g/mL di igrina.

2. Preparazione dell'embrione di pesce zebra

1. Un giorno prima della deposizione delle uova, allestire coppie di riproduzioni di pesci zebra nella camera di riproduzione.
   NOTA: aggiungere una sola coppia a ogni camera di riproduzione.
2. Raccogliere gli embrioni la mattina successiva entro 1 h dopo la fecondazione (hpf). Lavare con cura gli embrioni con acqua distillata e trasferire fino a 100 embrioni in una tela Petri da 100 mm contenente 30 mL di mezzo E3. Incubare a 28,5 gradi centigradi.
3. Dopo 12 h, osservare al microscopio e scartare le uova non fecondate o danneggiate.
4. A 24 hpf, cambiare il mezzo medio per fresco eterzo medio con N-phenylthiourea (PTU, 0.2 nM concentrazione finale) per prevenire lo sviluppo del pigmento. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi centigradi fino a quando gli embrioni non sono pronti per la microiniezione.

3. Infezione tramite microiniezione batterica

1. Preparare gli aghi di iniezione microcapillare di vetro borosilicato come descritto in precedenza nel riferimento¹³.
2. Embrioni di pesce zebra che montano per l'infezione
   1. Microonde 100 mL dell'1% (w/v) e 100 mL di 0,5% (w/v) di agarose a bassa fusione in un mezzo E3 autoclaved fino a quando l'agarose non è completamente fuso. Dividere in tubi aliquota 1 mL e conservare a 4 gradi centigradi per un uso futuro.
   2. Prima dell'uso, riscaldare l'agarose in un blocco di riscaldamento di 95 gradi centigradi fino a quando non è completamente sciolto. Mantenere l'agarose in forma liquida collocandola in un blocco di riscaldamento a 45 gradi centigradi (Figura 2).
   3. Montaggio per infezione intramuscolare nella regione del tronco
      1. Creare lo strato inferiore di agarose versando 0,5 mL dell'1% (w/v) agarose uniformemente su uno scivolo di vetro. Posizionare su una scatola di ghiaccio o su una superficie fredda per 3 min per solidificare.
      2. Anestesizzare gli embrioni di pesce zebra (48–72 hpf) in acqua di uovo con tricaina (200 g/mL) e PTU per 5 minuti prima del montaggio. Posizionare fino a 60 embrioni di pesce zebra sullo strato di agarose inferiore e disporli con attenzione in due file (Figura 2B).
      3. Rimuovere l'acqua rimanente sullo strato di agarose inferiore con carta velina prima di aggiungere 0,3 mL di 0,5% (w/v) agarose per creare lo strato superiore. Assicurarsi che gli embrioni siano completamente incorporati nell'agarose. Riportare lo scivolo di vetro nella scatola di ghiaccio per solidificare l'agarose e prevenire la disidratazione.
      4. Mantenere lo strato superiore di agarose umido coprendo la superficie con acqua di uovo E3 extra.
   4. Montaggio per infezione da midbrain
      1. Coprire la scanalatura di un singolo vetrino di microscopia in vetro di concavità con 1% (w/v) agarose, quindi trasferire gli embrioni 4-6 anestesizzati di tricaina nell'agarose.
      2. Posizionare la testa di ogni embrione con attenzione con un ago da 10 G (Figura 2C).
      3. Una volta che tutte le posizioni degli embrioni sono fisse, trasferire lo scivolo di vetro in una scatola di ghiaccio o superficie fredda per lasciare che l'agarose si solidifichi.
         NOTA: Evitare la diluizione di agarose a bassa fusione riducendo al minimo il volume di trasferimento di acqua di uovo con gli embrioni.
3. Preparazione batterici per l'infezione
   1. Aggiungete 1 o L di rosso fenolo sterile (10x) a un 10 - L. di brodo batterico (fatto al punto 1) e mescolate per brevi volte vortice.
      NOTA: la concentrazione finale può essere regolata utilizzando PBS sterile.
   2. Sonicare la preparazione utilizzando 100 W a 10 s ON, 10 s OFF per 1 min per rompere eventuali grumi che possono avere formato¹⁴.
4. Infezione tramite microiniezione
   1. Regolare il microiniettore e il micromanipolatore nella posizione corretta e nell'impostazione per la microiniezione come precedentemente riportato¹³.
   2. Trasferire 3 L della preparazione batterica utilizzando un micro caricatore nell'ago preparato (vedere il punto 3.1). Pipette lentamente e con attenzione per evitare di formare bolle d'aria.
   3. Per l'infezione della regione del tronco, iniettare 100 cfu nella regione del tronco (Figura 3A). Evitare di iniettare batteri nel notocordo.
      NOTA: Il cfu per l'iniezione è stimato dalla formula cfu : concentrazione di stock batterico x fattore di diluizione x volume gocciolina di iniezione. Il cfu effettivo è confermato dalla placcatura di una goccia di inoculum batterico su una piastra di 7H10 agar contenente il 10% (v/v) di OADC, lo 0,5% di glicerolo e 50 g/mL di igromycina.
   4. Per l'infezione cerebrale, iniettare circa 500 cfu nella regione midbrain (Figura 3B).
   5. Dopo la microiniezione, sciacquare con cura gli embrioni di pesce zebra in acqua dolce con una pipetta di plastica.
      NOTA: Montare gli embrioni nella teglia inferiore di vetro il più presto possibile per coprire l'osservazione della risposta delle cellule immunitarie innate molto precoce.

4. Live Imaging dell'infezione

1. Montaggio dei pesci per l'imaging dal vivo
   1. Trasferire fino a 10 embrioni anestesizzati tricaini al centro di un piatto inferiore di vetro 35 mm. Eliminare il supporto E3 aggiuntivo.
   2. Coprire il piatto con un agarose agarose agarose a1% a basso punto di fusione e orientare gli embrioni di pesce zebra con attenzione utilizzando un ago da 10 G. Incubare il piatto di fondo di vetro sul ghiaccio per 10 s per solidificare l'agarose.
      NOTA: Per l'iniezione di midbrain, gli embrioni devono essere montati nell'agarose con la testa rivolta verso l'alto (Figura 4A). Per l'infezione intramuscolare della regione del tronco, gli embrioni devono essere montati lateralmente nell'agarose (Figura 4B).
   3. Una volta che si è completamente solidificato, coprire l'agarose con uno strato di acqua di uovo (più 1 x tricaina e PTU).
2. Microscopia confocale time lapse ad alta risoluzione a tre colori
   NOTA: I seguenti passaggi sono azionati su una microscopia confocale dotata di un obiettivo UV da 63,0 x 1,40 olio.
   1. Impostare la temperatura della camera ambiente a 28,5 gradi centigradi. Collocare un po' di carta velina bagnata all'interno della camera per evitare umidità e prevenire l'evaporazione dell'acqua dell'uovo (Figura supplementare 1).
   2. Posizionare il piatto di fondo in vetro da 35 mm con il pesce zebra nella camera ambientale.
   3. Aprire il software confocal e inizializzare lo stage. Passare all'obiettivo UV dell'olio 63.0 x 1,40 e individuare il pesce zebra utilizzando il canale di campo luminoso con un filtro di contrasto di interferenza differenziale (DIC).
   4. Aprire il laser 405 Diode, Argon (20% di potenza) e DPSS 561 nm. Impostare le impostazioni di potenza laser e spettro appropriate.
      NOTA: Di seguito sono riportate le impostazioni dello spettro per Cerulea (eccitazione - 405 nm; emissione - 456-499 nm), eGFP (eccitazione - 488 nm; emissioni ) 500-550 nm), DsRed2 (esordimento 561 nm; emissione) (575-645 nm)(Figura supplementare 2B).
   5. Scegliere la modalità di acquisizione "XY ""Sequential Scan" e impostare il formato delle immagini su "512 x 512 pixel" ( Figurasupplementare 2A).
   6. Passare a "Live Data Mode". Puntare la posizione del primo pesce zebra e segnare la posizione "Begin" e "End". Ripetere questo processo per ciascuno degli embrioni rimanenti. Una "Pausa" può essere aggiunta alla fine del programma (Figura supplementare 2C).
   7. Definire il ciclo e il ciclo del programma.
   8. Salvare il file.

5. L'irradiazione UV a cella singola per indurre l'apoptosi e l'imaging dal vivo

1. Montare il pesce come descritto al punto 4.1.
2. Imaging nella regione midbrain di 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) macrofaage specifico embrione transgenico Tg (mfap4-eGFP) ¹⁵
3. Selezionare la regione di interesse di un singolo macrofago fluorescente etichettato e la scansione a 400 Hz di velocità e 6% potenza laser UV per 50 s.
   NOTA: la velocità e il tempo di scansione devono essere ottimizzati in base al microscopio individuale. Il tempo di scansione dovrebbe essere ottimizzato per causare l'esita danno al DNA che successivamente causerà l'apoptosi della cellula bersaglio, ma non il fotobleach l'intera cellula.
4. Ripetere il passaggio precedente per irradiare più celle di destinazione.
5. Eseguire l'imaging time lapse della regione midbrain come descritto nella sezione 4.

6. Elaborazione delle immagini

1. Eseguire "Proiezione massima" per le immagini acquisite.
2. Trovare e contrassegnare la posizione EXY e il tempo delle celle di destinazione nella vista "Proiezione massima".
3. Tornare alla visualizzazione standard per trovare e contrassegnare la posizione z delle celle di destinazione.
4. Ritagliare l'immagine a livello singolo delle celle di destinazione.
5. Esportare il canale di sovrapposizione e il campo luminoso come video in formato AVI.
6. Ritaglia l'area di interesse del canale di sovrapposizione e del campo luminoso in ImageJ.
7. Combina i due video nell'ultimo passaggio verticalmente e salvalo come un unico video in formato AVI in ImageJ.

Risultati

L'infezione da mycobacterium può innescare diverse risposte dell'ospite in base alle vie di infezione. In questo protocollo, gli embrioni di pesce zebra sono infettati da microiniezione intramuscolare di batteri etichettati fluorescentmente nel midbrain o nel tronco(Figura 3) e osservati mediante imaging dal vivo confocale. L'infezione attraverso questi due percorsi limiterà localmente l'infezione che causa il reclutamento di cellule immunitarie innate e la successiva morte cellulare.

...

Discussione

Questo protocollo descrive la visualizzazione della morte dei macrofaghi durante l'infezione micobatterica. Sulla base di fattori come l'integrità della membrana cellulare, l'infezione ha guidato la morte cellulare può essere divisa in apoptosi e morte delle cellule litiniche^24,25. La morte delle cellule littiche è più stressante per l'organismo rispetto all'apoptosi, perché innesca una forte risposta infiammatoria ^24,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tween-80	Sigma	P1379
10 mL syringe	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
3-aminobenzoic acid	Sigma	E10521
5 μm filter	Mille X	SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
A glass bottom 35 mm dish	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Enviromental Chamber	Pecon	temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader	Eppendorf	No.5242956003
Glass microscope slide	Bioland Scientific LLC	7105P
Glycerol	Sangon Biotech	A100854
Incubator	Keelrein	PH-140(A)
M.marinum			ATCC BAA-535
Microinjection needle	World Precision Instruments	IB100F-4
Microinjector	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	NARISHIGE	MN-151
msp12:cerulean			Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red	Sigma	P3532
PTU	Sigma	P7629
Single concavity glass microscope slide	Sail Brand	7103
Sonicator	SCICNTZ	JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburg
Stereo Microscope	OLYMPUS	SZX10
Tg(mfap4:eGFP)			Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)			Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)			Ref.: PMID 27424497; 17477879