Visualizzazione della resistenza batterica utilizzando sonde antibiotici fluorescenti

Riepilogo

Gli antibiotici fluorescenti etichettati con fluorescente sono potenti strumenti che possono essere utilizzati per studiare molteplici aspetti della resistenza agli antimicrobici. Questo articolo descrive la preparazione di antibiotici fluorescenti con tag e la loro applicazione allo studio della resistenza agli antibiotici nei batteri. Le sonde possono essere utilizzate per studiare i meccanismi di resistenza batterica (ad esempio, l'efflusso) mediante spettrofotometria, citometria di flusso e microscopia.

Abstract

Gli antibiotici fluorescenti sono strumenti di ricerca multiuso che vengono facilmente utilizzati per lo studio della resistenza agli antimicrobici, a causa del loro significativo vantaggio rispetto ad altri metodi. Per preparare queste sonde, i derivati dell'azide degli antibiotici sono sintetizzati, quindi accoppiati con alkyne-fluorofori utilizzando la cicloaddition dipolare azide-alkyne con la chimica del clic. Dopo la purificazione, l'attività antibiotica dell'antibiotico fluorescente è testata dalla valutazione della concentrazione inibitoria minima. Per studiare l'accumulo batterico, può essere utilizzata la spettrofotometria o la citometria di flusso, consentendo un'analisi molto più semplice rispetto ai metodi che si basano su derivati antibiotici radioattivi. Inoltre, la microscopia confocale può essere utilizzata per esaminare la localizzazione all'interno dei batteri, offrendo preziose informazioni sulla modalità di azione e sui cambiamenti che si verificano nelle specie resistenti. L'uso di sonde antibiotiche fluorescenti nello studio della resistenza agli antimicrobici è un metodo potente con molto potenziale per l'espansione futura.

Introduzione

La resistenza agli antimicrobici (AMR) è una crisi crescente che rappresenta una grave minaccia per la salute umana in tutto il mondo. È stata segnalata resistenza alla maggior parte degli antibiotici e stanno emergendo infezioni causate da batteri resistenti a tutti i farmaci clinicamente disponibili. Per combattere l'ascesa della resistenza anti-amr, dobbiamo aumentare la nostra comprensione di questo fenomeno sfaccettato e dei meccanismi e delle interazioni sottostanti tra antibiotici e batteri. Un aspetto storicamente poco compreso è la permeazione degli antibiotici nei batteri, insieme ai fenomeni di accumulo ed afflusso. Questa conoscenza è fondamentale nella progettazione di nuovi farmaci e nella comprensione dei meccanismi di resistenza. Quindi, questo svolge un ruolo fondamentale nella ricerca sulla aMR.

Ci sono due approcci principali che possono essere adottati per misurare la concentrazione di antibiotici: misurare direttamente il farmaco o etichettare con una moiety progettata per facilitare la quantificazione. Anche se l'etichettatura dell'antibiotico migliora il rilevamento, questo può perturbare l'attività biologica del farmaco, come l'attività antimicrobica e la permeabilità. Questo non è un problema per i metodi senza tag; tuttavia, il rilevamento può essere difficile. Negli ultimi anni, i progressi tecnologici hanno portato ad un boom nella ricerca utilizzando la spettrometria di massa (MS) per misurare direttamente la concentrazione antibiotica nei batteri^{1,2,3,4,5,6,7}. Questi studi hanno dimostrato che è possibile studiare l'accumulo intracellulare in una varietà di batteri, con i batteri gram-negativi i più ampiamente studiati. La quantificazione della permeabilità molecolare è stata poi collegata all'attività e utilizzata per informare lo sviluppo di farmaci^2,3,4, anche se occorre prestare attenzione quando si confonde direttamente l'accumulo e^l'attivitàtarget 5 . Prima dello sviluppo della SM, gli unici antibiotici la cui concentrazione poteva essere misurata direttamente erano quelli in possesso di fluorescenza intrinseca, come la tetraciclina e le quinoline^8,9,10,11. Anche se ovviamente limitata nella portata, l'accumulo e l'efflusso sono stati esaminati e quantificati, illustrando l'utilità della quantificazione basata sulla fluorescenza.

Gli antibiotici con tag sono stati utilizzati per molti decenni per studiare distribuzioni, modalità d'azione e resistenza, con tag radioattivi e fluorescenti comuni. Le sonde con tag radio hanno il vantaggio di essere quasi identiche al composto genitore, quindi è improbabile che l'attività biologica sia significativamente diversa. Isotopi come ³H, ¹⁴C e ¹⁵N sono stati frequentemente utilizzati a causa della prominenza di questi elementi negli antibiotici, e una varietà di scaffold antibiotici sono stati esaminati^1,10,12,13. Mentre il rilevamento delle radiosonde è semplice, ci sono una serie di preoccupazioni logistiche (ad esempio, sicurezza, emitopo isotopo) che hanno limitato l'uso di questo approccio. Un'altra strategia è gli antibiotici con etichetta fluorescente. Queste sonde possono essere utilizzate per esaminare la distribuzione e le modalità di azione e resistenza del farmaco genitore, utilizzando una tecnologia più semplice rispetto alla SM e senza i problemi logistici delle radiazioni⁸. L'inconveniente principale di questo approccio è che gli antibiotici sono generalmente molecole relativamente piccole, da qui l'introduzione di una moiety fluorescente pone un cambiamento chimico significativo. Questa alterazione può avere un impatto sulle proprietà fisiochimiche e sull'attività antibatterica. Pertanto, occorre prestare attenzione a valutare questi fattori al fine di generare risultati rappresentativi dell'antibiotico genitore.

In questo lavoro, viene descritto un metodo per sintetizzare, valutare e utilizzare antibiotici fluorescenti, come nelle nostre precedenti pubblicazioni^14,15,16. Attraverso i lavori precedenti, un certo numero di antibiotici fluorescenti sono stati preparati e utilizzati per una varietà di scopi (vedi Stone et al.⁸). Al fine di ridurre al minimo la probabilità di impatto sull'attività biologica, vengono utilizzati fluorofori molto piccoli in questo lavoro: nitrobenzoxadiazole (NBD, verde) e 7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl (DMACA, blu). Inoltre, viene descritta la valutazione dell'attività antibatterica utilizzando l'indice di inibizione minima di diluizione del microbroto (MIC), in modo da poter misurare l'effetto delle modifiche sull'attività. Queste sonde fluorescenti possono essere utilizzate nei saggi spettrofotometrici, nella citometria del flusso e nella microscopia. La gamma di possibili applicazioni è dove si trova il vantaggio degli antibiotici fluorescenti. L'accumulo cellulare può essere quantificato, categorizzato e visualizzato, qualcosa che non è possibile utilizzando la sola SM. Si spera che le conoscenze acquisite attraverso l'uso di antibiotici fluorescenti aiuteranno nella nostra comprensione della resistenza e nella lotta contro la resistenza.

Protocollo

1. Sintesi di Alkyne-fluorofori

1. Sintesi di NBD-alkyne (7-nitro-N-(prop-2-yn-1-yl)benzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-amine)
   1. Sciogliere 1.031 mg di 4-chloro-7-nitro-benzofuran (5.181 mmol) in 60 mL di tetraidrofuran (THF). Aggiungere 1.857 mg di CsCO₃ (5.696 mmol), quindi 0,39 mL di propargylamina (6.1 mmol). Riscaldare la reazione a 50 gradi centigradi per 2 h, che si trasformerà da marrone a verde, quindi raffreddare a temperatura ambiente (RT).
   2. Filtrare la reazione utilizzando un ausilio filtrante (vedere Tabella dei materiali)e lavare con acetato etilico (EA). Concentrare il filtrato a pressione ridotta, quindi sciogliere il residuo in 150 mL di EA e passare a un imbuto di separazione di 500 mL.
   3. Lavare la soluzione EA con 100 mL rispettivamente con acqua e salamoia. Quindi combinare le fasi acquose e lavare 2x con 100 mL di EA.
   4. Asciugare le fasi organiche combinate sopra il solfato di magnesio anidroso, quindi filtrare e concentrarsi sotto pressione ridotta.
   5. Purificare il prodotto greggio mediante cromatografia flash su gel di silice (20-30% EA nell'etere petrolifero [PE]), controllando la purezza mediante spettrometria di massa della cromatografia liquida (LCMS, [M-H]^- 219,1) e/o spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), sposta chimica come segue:
      ^{1 : il} nome del H NMR (CD₃OD, 600 MHz) che svago 8,54 (d, J - 8,7 Hz, 1 H), 6,35 (d, J - 8,4 Hz, 1H), 4,31 (dd, J - 5,7 Hz, J - 2,5 Hz, 2 H), 2,43 (t, J - 2,5 Hz, 1H); ¹³ del sistema C NMR (CD₃OD, 150 MHz) 144,3, 143,7, 142,2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.
      NOTA: Quando si esegue la purificazione mediante cromatografia gel di silice, preparare la colonna utilizzando il meno polare dei solventi elencati. Il composto grezzo può essere caricato come soluzione concentrata o adsorbito sulla silice se la solubilità non lo consente. Dopo che il composto è stato aggiunto alla parte superiore della silice, eseguire attraverso 1–2 volumi di colonna dello stesso solvente utilizzato per bagnare la silice. Quindi iniziare con il rapporto di solvente elencato, che attraversa almeno 1 volume di colonna di ogni solvente, e assicurandosi di non fare grandi salti nella composizione del solvente. Raccogliere le frazioni e verificare la purezza/identità mediante LCMS o TLC (cromatografia a strati sottili). Unire le frazioni pure e concentrare sotto pressione ridotta per evaporazione rotante.
2. Sintesi di DMACA-alkyne (2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide).
   1. Scioglire 5,02 g di 3-(dimetilamino)fenolo (36,6 mmol) in 30 mL di etanolo, quindi aggiungere 6,7 mL di dietil 1,3-acetonedicarboxylate (36 mmol). Aggiungete 10,5 g di nCl₂ (77,2 mmol), quindi reflusso della soluzione rossa per 42 h. Aggiungere ulteriori 9,20 g di nCl₂ (67,6 mmol), quindi reflusso per 8 h.
   2. Raffreddare la reazione e concentrarsi sotto pressione ridotta. Disperdere il solido rosso risultante in 200 mL di EA, filtrare, quindi trasferire a un imbuto di separazione 500 mL.
   3. Lavare l'EA con 200 mL ciascuno di acqua e salamoia, quindi asciugare sopra il solfato di magnesio idroelettrico. Filtrare la fase organica essiccata e concentrarsi sotto pressione ridotta.
   4. Purificare il solido rosso (ethyl 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)aceto) con la cromatografia flash su gel di silice (0-100% EA in PE), controllando la purezza da parte di LCMS ([M-H]^- 275,1) e/o NMR, spostare i prodotti chimici come segue:
      ^{1 : il} nome del H NMR (CDCl₃, 600 MHz) 7,30 (d, J - 8,9 Hz, 1H), 6,52 (dd, J - 8,9 Hz, J - 2,6 Hz), 1,40 (d, J - 2,6 Hz, 1H), 5,87 (m, 1H), 2,96 (m, 8H), 2,25 (d, J - 1,2 Hz, 3H).
   5. Sciogliere 488 mg di etilo 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)aceato (1,18 mmol) in 10 mL di THF, quindi aggiungere una soluzione di 157 mg di LiOH H₂O (3,74 mmol) in 15 mL d'acqua. Mescolare la reazione a RT per 3 h, quindi passare a un imbuto di separazione e diluire con ulteriori 50 mL di acqua.
   6. Lavare la miscela di reazione 2x con 50 mL di etere dietillo (Et₂O), quindi lavare la fase organica combinata 2x con 25 mL di acqua. Prendere qualsiasi precipitato giallo con lo strato organico. Concentrare la fase organica a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
   7. Acidifiare la fase acquosa a pH 2 con HCl concentrato, e raffreddare a 4 gradi durante la notte. Filtrare la fase acquosa acidificata e aggiungere il solido giallo alla fase organica concentrata.
      NOTA: L'acido acetico 2-(7-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) può essere utilizzato senza ulteriore purificazione, ma questo può essere controllato da LCMS ([M-H]^- 247,1) e/o NMR, spostamenti chimici come segue:
      ^{1 : il} nome del H NMR (CDCl₃, 600 MHz) 7,41 (d, J - 9,0 Hz, 1H), 6,62 (dd, J - 9,2 Hz, J - 2,8 Hz), 1,82 (d, J , 2,8 Hz, 1H), 5,98 (d, J - 0,9 Hz, 1H), 3,05 (s, 6H), 2,35 (d, J - 0,9 Hz, 2H); ¹³ del sistema C NMR (CDCl₃, 150 MHz) 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109.3, 109.1, 108.8, 98.3, 40.2, 18.5.
   8. Sciogliere 466 mg di 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl) acido acetico (1,89 mmol) in 7 mL di secco N,N-dimethylformamide (DMF) e posizionare sotto un'atmosfera di azoto.
   9. Sciogliere 0,33 mL di propargylamina (5,1 mmol) in 7 mL di DMF secco sotto azoto. Aggiungere 1,30 mL di ammina di-isopropiletilo (DIPEA, 7,50 mmol) alla soluzione di tintura, quindi 535 mg di O-(1H-6-chlorobenzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramelutibro exafluorophosphate (HCTU, 1.29mmol). Mescolare la soluzione di tintura attivata per 15 min a RT, quindi aggiungere la soluzione di ammina dropwise, e lasciare mescolare durante la notte.
   10. Il giorno successivo, diluire la reazione con 35 mL di acqua poi concentrarsi sotto pressione ridotta.
   11. Partizionare il solido arancione risultante tra EA e salamoia (100 mL ciascuno) in un imbuto di separazione di 250 mL. Separare gli strati (eseguire i due strati in diversi flaconi) e lavare la fase acquosa con 100 mL di EA.
   12. Concentrare le fasi organiche combinate sotto pressione ridotta, quindi risciogliete il solido arancione in 3 mL di 1:1 acetonitrile (ACN)/acqua (v/v). Purificare il prodotto grezzo iniettando su un sistema di cromatografia liquida a media pressione in fase inversa (MPLC) dotato di una colonna di cartuccia C18 (solvente A: acqua, solvente B: ACN).
   13. Controllare le frazioni per la purezza da parte di LCMS ([M-H]^- 284.1, spostamenti chimici NMR riportati di seguito), quindi combinare e licifilizzare le frazioni appropriate per dare 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-chromen-4-yl)-N-(prop-2-yn-1-yl)aamide, NMR chemicals come segue:
       ^{1 : il} nome del H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) 8,65 (t, J - 5,4 Hz), 7,52 (d, J 1 H), 6,72 (dd, J - 9,1, 2,6 Hz, 1H), 6,55 (d, J - 2,6 Hz, 1 H), 6,00 (s, 1 H), 3.88–3.87 (m, 2.62 (s, 2H), 3.13 (t, J - 2.5 Hz, 1H), 3.00 (s, 1H), 3.00). ¹³ del sistema C NMR (125 MHz, DMSO-d₆₎- 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109,1, 108,1, 97,5, 80,9, 73,3, 39,7, 38,4, 28,2.

2. Sintesi degli antibiotici fluorescenti

1. Preparare un azide-derivato di un antibiotico come descritto in precedenza^14,15,16.
   NOTA: La procedura è specifica per ogni antibiotico e richiede un attento esame del rapporto di attività della struttura (SAR) della molecola madre per garantire che l'antibiotico funzionalizzato mantenga un'attività paragonabile alla controllante. (ad esempio, ciprofloxacin¹⁶, linezolid¹⁴e trimethoprim¹⁵). Vedere la figura 1 per esempi di antibiotici fluorescenti pubblicati e lo schema di sintesi generale.
2. Procedura di reazione click A
   NOTA: Per la maggior parte degli antibiotici, seguire la procedura descritta qui per il rame catalyzato Huisgen [2x3] cicloaddition di azide (passaggio 2.1) e alchino fluorescente (preparato nel passaggio 1).
   1. Mettere l'antibiotico dell'azide in un pallone rotondo in basso e aggiungere tert-butanol (^tBuOH) e acqua (1:1 v/v, 25 mL ciascuno per azide mmol).
   2. Aggiungere il fluoroforo-alkyne preparato al punto 1.1 (3 eq.) e riscaldare la reazione a 50 gradi centigradi. Aggiungere quindi il solfato di rame (100 mM in acqua, 0,6 eq.) alla reazione, seguito dall'acido ascorbico (500 mM in acqua, 2,4 eq.).
   3. Mescolare la reazione a 50 gradi centigradi per 1 h, o fino all'analisi di LCMS su indicazione del completamento della reazione (consumo completo di azide iniziale).
   4. Raffreddare la reazione e purificare a seconda dell'impalcatura antibiotica e procedere per la purificazione al passo 2.3 o 2.4.
      NOTA: Sono possibili diversi metodi di purificazione, a seconda della polarità e della stabilità dell'impalcatura.
3. Procedura di reazione click B
   NOTA: Seguire questa procedura per gli antibiotici a base di peptidi, per fornire condizioni di reazione più forti (lavoro inedito, Phetsang, 2019).
   1. Mettere l'azide-antibiotico peptide in una fiaschetta inferiore rotonda e aggiungere abbastanza DMF (750 mL/mmol azide) per sciogliere.
   2. Aggiungere il fluoroforo-alkyne preparato al punto 1 (5 eq.) e riscaldare la reazione a 50 gradi centigradi per 1 h.
   3. Aggiungere rame (I) ioodio (20 eq.), quindi DIPEA (120 eq.), quindi acido acetico (240 eq.).
   4. Mescolare la reazione a 50 gradi centigradi per 1 h, o fino a quando l'analisi di LCMS indica il completamento della reazione (cioè il consumo completo di azide iniziale). Raffreddare la reazione e procedere per la purificazione con il metodo 1 (vedere il punto 2.3).
4. Metodo di purificazione 1 (utilizzato per ciprofloxacin, trimethoprim e linezolid)
   1. Iniettare la reazione di clic raffreddato direttamente su una colonna di cartuccia MPLC C18.
   2. Incorporare una lunga fase di lavaggio (circa 10 min) all'inizio della corsa (100% solvente A), quindi eseguire un gradiente fino al 100% solvente B, seguito da un ritorno al solvente A.
      NOTA: Il solvente A può essere scelto dall'acqua, 0,05–0,1% di acido formico (FA) in acqua, 0,05–0,1% acido trifluoroacetico (TFA) in acqua, a seconda della solubilità, della stabilità e della migliore risoluzione dei picchi. Il Solvente B può essere scelto tra acetonitrile (ACN), 0,05-0,1% FA in ACN, 0,05-0,1% TFA in ACN, per abbinare il solvente A. Se l'eluizione si rivela difficile, il metanolo può essere utilizzato al posto di ACN.
   3. Raccogliere e combinare le frazioni appropriate, come indicato da LCMS e colore (massa corretta vista, picco singolare), quindi liofilizzare per dare l'antibiotico fluorescente (semi)puro.
   4. Se necessario, purificare ulteriormente il prodotto. Valutare la purezza da NMR e/o LCMS e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC), utilizzando una colonna e un metodo appropriati per lo scaffold.
5. Metodo di purificazione 2
   NOTA: Se la solubilità lo consente, la prepurificazione può essere effettuata dall'acquisivo lavoro (utilizzato per macrolidi, lavori inediti, Stone 2019).
   1. Diluire la reazione di clic raffreddato con acqua ed Et₂O (1:1 v/v, circa 10 volte diluizione dal volume di reazione iniziale), trasferendo ad un imbuto di separazione di dimensioni adeguate.
   2. Separare gli strati e lavare due volte la fase aqueous con Et₂O.
   3. Lavare le fasi organiche combinate 2x con acqua (uguale volume con fase organica), quindi asciugare su Na₂SO₄.
   4. Filtrare la fase organica essiccata e concentrarsi sotto pressione ridotta.
   5. Purificare il prodotto grezzo da MPLC e/o HPLC come descritto al punto 2.4.4.
      NOTA: vedere la figura 2 per esempi di tracce LCMS di reazione a scatto incomplete, complete e purificate. Le tipiche rese purificate per le reazioni di clic antibiotico-fluoroforo vanno dal 30 all'80%.
      AVVISO: La maggior parte delle sostanze chimiche utilizzate in queste sintesi possiedono rischi specifici per la sicurezza. Occorre prestare attenzione in ogni momento, compreso l'uso di dispositivi di protezione personale. Et₂O, ^tBuOH, FA, acido acetico, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, propargylamine e HCTU sono tutti infiammabili; evitare il contatto con sorgenti di calore o scintille. THF, propargylamine, DIPEA, ^tBuOH, FA, DMF e PE sono tutti tossici; evitare l'esposizione. Propargylamine, CsCO₃, nCl₂, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, acido acetico, e HCl sono tutti corrosivi; evitare il contatto ed essere consapevoli del contatto superficiale. NCl₂, CuSO₄, CuI e PE presentano rischi ambientali; tenere presente le condizioni di smaltimento. IL THF può formare perossidi esplosivi; fare attenzione con le condizioni di conservazione. Gli azidi organici sono esplosivi; prestare attenzione soprattutto con la produzione su larga scala.

3. Valutazione dell'attività antimicrobica

NOTA: Tutti i lavori che coinvolgono batteri devono essere eseguiti in condizioni sterili per evitare la contaminazione del saggio o del laboratorio. Tutti i supporti devono essere autoclavi prima dell'uso, e plasticware e attrezzature come pipette devono essere mantenuti sterili. Si raccomanda di lavorare in un cofano di biocontenimento (tipo 2).

1. Streak glicerol stock di ceppi batterici appropriati per l'agar di brodo di lisogenia antibiotico su agar di lisogenesi (LB, preparato per istruzioni del produttore), e crescere durante la notte a 37 .
   NOTA: La scelta dei batteri per testare l'attività antibatterica deve essere effettuata in base all'scaffold antibiotico utilizzato. Una gamma rappresentativa di 5-10 batteri dovrebbe essere scelta tra le specie che sono noti per essere suscettibili all'antibiotico, tenendo conto delle capacità logistiche del laboratorio. Se possibile, devono essere testati anche batteri resistenti. Il protocollo riportato di seguito funzionerà sulla maggior parte dei batteri, ma controlla se sono necessarie condizioni speciali (ad esempio, CO₂, supporti speciali) e farà delle modifiche se necessario. I batteri analizzati con successo usando queste condizioni includono Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecium.
2. Scegli una singola colonia dalla piastra, e la cultura durante la notte in 5 mL di cation regolato Mueller-Hinton Broth (CAMHB, preparato per istruzioni del produttore) a 37 gradi centigradi.
3. Diluiare le colture notturne di 40 volte in CAMHB e crescere fino a una fase intermedia del log, densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) - 0,4–0,8, volume 5 mL).
4. Preparare le soluzioni di riserva di ogni antibiotico fluorescente a 1,28 mg/mL in acqua sterile, e pipetta 10 -L di antibiotico alla prima colonna di una piastra di 96 pozze.
5. Aggiungere 90 l di CAMHB alla prima colonna e 50 l in tutti gli altri pozzi. Quindi, eseguire la diluizione seriale di 2 volte attraverso la piastra.
6. Mescolare accuratamente, quindi diluire le colture di fase mid-log a 10⁶ unità formanti colonia (CFU)/mL e aggiungere 50 L a tutti i pozzi, per fornire una concentrazione finale di 5 x 10⁵ CFU/mL.
   
   volume di impostazioni cultura (mL) (volume multimediale in mL)/(OD₆₀₀ x 1.000)
   
   ad esempio, per una coltura OD₆₀₀ - 0,5 in un volume multimediale desiderato di 12 mL, aggiungere (12/(0,5 x 1.000) : 0,024 mL di coltura a 12 mL di supporti
7. Coprire le piastre con i coperchi e incubare a 37 gradi centigradi per 18-24 h senza agitare.
8. Ispezionare visivamente le piastre, con il MIC che è il pozzo di concentrazione più basso senza crescita visibile.
   NOTA: Vedere la tabella 1 per alcuni esempi di antibiotici fluorescenti attivi e inattivi.

4. Analisi dell'accumulo di sonde mediante spettrofotometria e citometria di flusso

NOTA: Questi tempi di centrifugazione sono stati ottimizzati per E. coli, quindi potrebbero essere necessarie lievi modifiche per altre specie. Per la sonda di sonda fucilosa con etichetta NBD vengono riportati dati rappresentativi per l'accumulo di sonde.

1. Le scorte di glicerolo Streak dei ceppi batterici sull'agar LB e crescono durante la notte a 37 gradi centigradi.
2. Scegli una singola colonia dal piatto e la cultura durante la notte in LB a 37 gradi centigradi.
3. Diluire le colture notturne di 50 volte nei media e crescere fino alla fase intermedia del log (OD₆₀₀ - 0,4–0,8).
4. Centrifugare le culture a 1.470 x g per 25 min e decantare i media.
5. Risospendere i batteri in 1 mL di salina tampone fosfata (PBS), quindi centrifugare a 1.470 x g per 15 min.
6. Decant il supporto e risospendere i pellet lavati in PBS fino a un OD_{finale 600} x 2.
7. Se lo si desidera, aggiungere 10,1 o L di cianuro di carbonio 3 clorophenylhydrazone (CCCP, 10 mM in PBS) a 1 mL di batteri (concentrazione finale 100 M) e incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
   NOTA: CCCP è un inibitore della pompa di efflusso. L'aggiunta di CCCP consentirà l'esame dell'impatto dell'efflux.
8. Centrifugare le colture a 18.000 x g per 4 min a 20 gradi centigradi e decantare i media.
9. Aggiungere al pellet 1 mL di soluzione antibiotica fluorescente (10-100 m in PBS) e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
10. Centrifugare le colture a 18.000 x g per 7 min a 4 gradi centigradi e decantare i media.
11. Risospendere i batteri in 1 mL di PBS freddo e ripetere il passaggio 4.9.
12. Ripetere il passaggio 4.10 per un totale di 4x.
13. Se lo si desidera, liscizzai i batteri aggiungendo 180 l of lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 2 mM di sodio EDTA) quindi 70 l di lisozyme (72 mg/mL in H₂O).
14. Incubare a 37oC per 30 min, quindi congelare-disgelo 3x (78 gradi centigradi per 5 min, poi 34 gradi C per 15 min).
15. Sonicare i campioni per 20 min, poi riscaldare a 65 gradi centigradi per 30 min.
16. Centrifugare i campioni di lisming (18.000 x g, 8 min), quindi filtrare attraverso una membrana di filtro 10 kDa.
17. Lavare il filtro 4x con 100 ll di acqua.
18. Trasferire il lisfatto su una piastra nera piatta 96 e misurare l'intensità della fluorescenza su un lettore di lastre con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione appropriate per il fluoroforo (cioè DMACA: s₄₀₀ nm,_e - 490 nm; NBD:₄₇₅ nm,₅₄₅ nm.
    NOTA: Vedere la figura 3 per esempi di analisi spettrofotometriche di batteri che utilizzano l'antibiotico fluorescente con etichetta nbfloxacin.
19. Per l'analisi per citometria di flusso, possono essere utilizzate le stesse condizioni di crescita e colorazione (passaggi da 4.1 a 4,17), con variazioni esclusivamente nella preparazione finale.
    1. Portare il volume totale a 1 mL di PBS.
    2. Leggere i campioni su un citometro di flusso a una velocità di flusso di circa 60 l/min, utilizzando l'amplificazione logaritmica per l'acquisizione dei dati (eccitazione F1 - 488 nm; emissione - 525/20 nm).
    3. Registrare un totale di 10.000 eventi, quindi analizzare i dati utilizzando il software appropriato.
    4. Tracciare l'intensità della fluorescenza da F1 rispetto al numero di eventi conta, stimando l'intensità mediana della fluorescenza dai picchi dell'istogramma dopo che i batteri sono stati macchiati.
       NOTA: Vedere la figura 4 per esempi di analisi della citometria di flusso di batteri che utilizzano l'antibiotico ciprofloxacina con etichetta NBD.

5. Preparazione per l'analisi microscopica

1. Coltivare le sottocolture fino a_0,4 OD, per quanto riguarda la valutazione MIC, quindi dividere in 1 mL e centrifugare a 18.000 x g per 3-5 min.
2. Decant e scartare i supporti, quindi risospendere il pellet batterico in 500 gradi l di HBSS.
3. Centrifuga a 18.000 x g per 3 min, quindi decant e scartare i supporti.
4. Preparare soluzioni di sonde antibiotiche in HBSS a concentrazioni di 1-100 M.
5. Risospendere i batteri lavati a 500 gradi della soluzione della sonda e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
6. Ripetere il passaggio 5.3. Per un esperimento di etichettatura multipla, risospendere il pellet in 500 litri di un coloracido nucleico color ortogonale. Per il verde, utilizzare Syto9 (5 m in HBSS); per il blu, utilizzare Hoechst 33342 (20 g/mL in HBSS). Incubare a RT per 15-30 min.
7. Ripetere il passaggio 5.3, quindi risospendere in 500 : L di FM4-64FX (5 g/mL in HBSS) e incubare a RT per 5 min.
8. Ripetere il passaggio 5.3, quindi risospendere in 500 gradi l di HBSS e ripetere nuovamente il passaggio 5.3.
9. Ripetere il passaggio 5.8, quindi sospendere infine i batteri lavati e tinto in 15 : L del supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali).
10. Supporto di montaggio pipetta su un vetrino e piano con un coperchio ad alte prestazioni, quindi sigillare i bordi con smalto trasparente.
    NOTA: Vedere la figura 5 per esempi di immagini di microscopia confocale scattate con antibiotici ciprofloxacin e trimethoprim con etichetta NBD e Figura 6 per l'antibiotico oxazolidinone con etichetta tamponato DMACA (linezolid).

Risultati

Figura 1 Illustra la reazione chimica di clic chiave (A) per la preparazione degli antibiotici fluorescenti, e con (B) esempi di strutture dei nostri antibiotici fluorescenti pubblicati a base di ciprofloxacin (cipro), trimethoprim (TMP) e linezolid. Queste sonde sono state tutte sintetizzate dagli antibiotici corrispondenti tramite un intermedio azido. Furono poi accoppiati ai fluorofori NBD e DMACA, ciascuno funzionalizzò con un alchino.

La figura 2 mostra tracce LCMS di esempio da una reazione ai clic di ciprofloxacin-N₃ e NBD-alkyne, in cui l'azide elarizzato a 3,2 min e il prodotto a 3,8 min. Il confronto di 1 e 2 min mostra come l'avanzamento della reazione click potrebbe essere seguito dalla scomparsa del picco di azide (da UV o MS detector). Gli spettri 3 dimostrano l'impatto della purificazione, con picchi errati che scompaiono dalle tracce MS e UV. Sia la purezza che il progresso della reazione potrebbero essere quantificati dall'integrazione del picco del prodotto e da eventuali picchi di impurità.

La figura 3 dimostra i risultati tipici della valutazione dell'accumulo intracellulare mediante spettroscopia a fluorescenza in presenza e assenza di efflusso. In questo esperimento, E. coli è stato trattato con TMP-NBD con o senza l'aggiunta di CCCP, che collassa la forza di movente protone (PMF). La fluorescenza intracellulare dei batteri era significativamente più alta quando pretrattata con CCCP, indicando che l'efflusso ha ridotto l'accumulo in questi batteri. Questo esperimento è stato ripetuto utilizzando batteri carenti in tolC, mostrando la capacità di questo saggio di esaminare l'impatto dei singoli componenti della pompa di efflusso. In questo caso, anche se c'è stato un aumento della fluorescenza intracellulare rispetto ai batteri di tipo selvatico, l'accumulo di CCCP è ancora aumentato. Questi risultati indicano che tolC partecipa all'efflusso di TMP, ma non è l'unica pompa a trazione PMF coinvolta.

Nella figura 4 viene illustrato il risultato dello stesso esperimento della Figura 2,ma con l'accumulo misurato dalla citometria di flusso anziché dalla spettroscopia. Sono state osservate le stesse tendenze dei dati, dimostrando che entrambe le tecniche possono essere utilizzate per studiare il fenomeno dell'efflusso mediato dall'accumulo intracellulare.

La figura 5 mostra immagini di microscopia confocale rappresentative di sonde fluorescenti gram-positive (S. aureus) e gram-negative (E. coli) etichettate rispettivamente con TMP-NBD (1) e sonde fluorescenti cipro-NBD ( 2x 3). In entrambi i casi, il colorno a membrana rossa FM4-64FX è stato aggiunto al fine di confrontare la co-localizzazione. Per Il TMP-NBD è stato utilizzato anche il coloranti acido nucleico blu Hoechst-33342. Sovrapponendo queste immagini, è stata visualizzata la localizzazione dell'antibiotico nei batteri. Il confronto dei pannelli 2 e 3 mostra come è stato esaminato l'impatto dell'efflusso, con l'inibitore dell'efflusso CCCP utilizzato in 2, con conseguente accumulo intracellulare. Nel pannello 3, non è stato aggiunto alcun CCCP. Quindi, l'efflusso è attivo e non è stato visto alcun accumulo di sonde.

La figura 6 mostra immagini di microscopia confocale rappresentative di batteri Gram-positivi (S. aureus) etichettati con la sonda oxazolidinone Lz-NBD etichettata DMACA. Il coloranti a membrana rossa FM4-64FX è stato aggiunto al fine di confrontare la co-localizzazione, ed è stato utilizzato anche il coloranti acido nucleico verde Hoechst-33342. Sovrapponendo queste immagini, è stata visualizzata la localizzazione dell'antibiotico nei batteri, mostrando la localizzazione interna distinta dalla membrana e dall'acido nucleico.

La tabella 1 mostra i valori MIC per tre serie di antibiotici fluorescenti, ciprofloxacin, trimethoprim (TMP) e linezolid (Lz), con i dati presentati per i derivati dell'antibiotico principale, NBD e DMACA di ciascuno. Sono state scelte specie rappresentative per ogni antibiotico, compresi sia gram-positivo che gram-negativo. Per la serie di ciprofloxacina, entrambe le sonde fluorescenti hanno perso l'attività antibiotica rispetto al farmaco genitore, ma hanno mantenuto una certa attività contro tutte le specie. Allo stesso modo, le sonde linezolidhanno hanno perso un po 'di attività, ma sono rimaste un antibiotico da moderato a debole. Le sonde TMP hanno perso quasi tutta l'attività contro i batteri di tipo selvatico, ma erano attive contro l'eflesse E. coli, il che indica che la perdita di attività antibatterica era dovuta alla mancanza di accumulo.

Figura 1: Sintesi e strutture di sonde derivate da antibiotici. (A) Lo schema di reazione generale per la sintesi di sonde antibiotici fluorescenti da antibiotici azide e alkyne-fluorofori. (B) Le strutture delle nostre sonde pubblicate basate su ciprofloxacin, trimethoprim e linezolid. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Misurazione della purezza della sonda derivata da antibiotici da parte di LCMS. Tracce analitiche di LCMS da (1) incomplete, (2) complete e (3) picchi di ciprofloxacin-N₃ , NBD-alkyne, che dimostrano la scomparsa del materiale iniziale al completamento della reazione, e picchi vari sulla purificazione. A traccia UV-Vis (assorbimento a 250 nm), traccia B - MS (modalità positiva e negativa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Misurazione del lettore di piastre dell'accumulo di sonde derivate da antibiotici. Misurazione spettroscopica di fluorescenza dell'accumulo cellulare di TMP-NBD (50 m) in natura selvaggia (1, ATCC 25922) etolC (2, ATCC 25922) E. coli incubato (A) con e (B) senza aggiunta di CCCP (100 M). La significatività statistica è compresa tra l'assenza o la presenza di CCCP e tra il tipo selvaggio e ilvalore di tolCE. coli. I dati riportati sono la media: SD per tre esperimenti. Questa cifra è adattata dalla nostra precedente pubblicazione¹⁵, e illustra l'uso della spettroscopia per chiarire il ruolo dell'efflusso sull'accumulo intracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Misurazione della citometria di flusso dell'accumulo di sonda derivato da antibiotici. Misurazione della citometria di flusso dell'accumulo cellulare utilizzando TMP-NBD in tipo selvaggio (1, ATCC 25922) ea slC (2, ATCC 25922) E. coli incubato con e senza aggiunta di CCCP (100 M). L'attività di fluorescenza mediana è illustrata da 10.000 eventi batterici, il significato statistico (sezione , p , 0,001; , p , 0,0001) è mostrato tra l'assenza e la presenza di CCCP e tra il tipo selvaggio eilcol . I dati riportati sono la media: SD per tre esperimenti. Questa cifra è adattata dalla nostra precedente pubblicazione¹⁵, e illustra l'uso della citometria di flusso per chiarire il ruolo dell'efflusso sull'accumulo intracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Visualizzazione microscopia confocale della localizzazione della sonda NBD. Immagini di microscopia confocale di 1) S. aureus dal vivo etichettate con Hoechst-33342 (blu, acido nucleico), TMP-NBD (verde), FM4-64FX (rosso, membrana) e sovrapposto; 2) E. coli vivo trattato con CCCP (efflux inhibitor) etichettato con cipro-NBD (verde), FM4-64FX (rosso, membrana) e sovrapposto; 3) E. coli vivo etichettato con cipro-NBD (verde), FM4-64FX (rosso, membrana), e sovrapposto. Questa cifra è adattata dalle nostre pubblicazioni precedenti^15,16, e illustra l'uso della microscopia per esaminare la localizzazione della sonda, compreso l'impatto dell'efflusso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Visualizzazione della microscopia confocale della localizzazione della sonda DMACA. Immagini microscopia confocale di S. aureus dal vivo etichettato con sonda oxazolidinone Lz-DMACA (blu), verde sciox (verde, acido nucleico) e FM4-64FX (rosso, membrana). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

			MIC (G/mL)
Specie		Ceppo	Cipro	Cipro-NBD	Cipro-DMACA	Tmp	TMP-NBD	TMP-DMACA	Linezolid (Lz)	Lz-NBD	Lz-DMACA
Staphylococcus aureus		ATCC 25923	0.125 - 0.5	32 - 64 USD	16	1	16	>64
		ATCC 43300							1	16	>64
Streptococcus pneumoniae		ATCC 700677							1	4	64
Enterococcus faecium		ATCC 35667	1 - 8	32	32 - 64 USD
		ATCC 51559							2	16	32
Klebsiella pneumoniae		ATCC 13883	0.015 - 0.06	8 - 16	8 - 32
Pseudomonas aeruginosa		ATCC 27853	0.25 - 1	32 - 64 USD	32 - 64 USD
Escherichia coli		ATCC 25922	0.004	8	2	0.5	>64	>64
		Mutante - TolC				0.125	0.25	2

Tabella 1. Attività antibiotiche delle sonde antibiotiche fluorescenti basate su ciprofloxacin, trimethoprim e linezolid contro adeguati ceppi batterici clinicamente rilevanti, misurati da analisi MIC di microdiluizione del brodo. Nella maggior parte dei casi, le sonde hanno perso una certa attività rispetto al farmaco genitore, ma hanno mantenuto una certa potenza antibiotica misurabile (sufficiente per essere utile in ulteriori studi).

Discussione

La creazione di una sonda antibiotica fluorescente di successo deve iniziare con un'attenta pianificazione e considerazione del SAR del farmaco genitore. Se la RAS non è nota o completamente esplorata, potrebbe essere necessario testare diverse opzioni per trovare un sito che possa essere modificato in modo selettivo senza abolire l'attività biologica. Una volta identificato un sito/i, l'installazione di una moiety del linker è spesso essenziale per fornire una spaziatura sterica tra il sito biologico di azione e il fluoroforo inattivo. Occorre fare attenzione che la reazione utilizzata per collegare il linker all'antibiotico lasci un gruppo funzionale biostabile, evitando, ad esempio, esteri suscettibili di scissione di assenzo da parte di in vivo. A seconda del profilo farmacodinamico e farmacocinetetico dell'antibiotico, può essere utilizzato un semplice linker alchil, altrimenti dovrebbe essere considerata un'opzione meno lipofilica come un linker di glicole di polietilene (PEG). Con il linker collegato, l'attività antibatterica dovrebbe essere valutata per garantire che i MIC contro i batteri rilevanti siano simili al composto genitore.

In questo lavoro, si consiglia l'uso di Huigsen azide-alkyne [3x2] cicloaddition dipolare (funzione di chimica del clic, vedi Figura 1) per ridurre il fluoroforo all'antibiotico, per una serie di motivi. Le reazioni a i clic sono altamente selettive, il che significa che la protezione dei gruppi reattivi sull'antibiotico non è necessaria, e inoltre, la reazione lascia una moiety triazolo stabile e biocompatibile. La componente azide viene introdotta nella parte antibiotica nelle nostre procedure, in quanto questo è generalmente più facilmente realizzabile con una varietà di tipi strutturali rispetto all'introduzione di un alchino. Le sintesi di due fluorofori derivati dall'alchino sono descritte qui, anche se altri potrebbero essere esplorati se lo si desidera. NBD e DMACA sono stati scelti a causa delle loro piccole dimensioni, riducendo al minimo la possibilità di interferire con la penetrazione cellulare e l'interazione con il bersaglio. La reazione di clic stessa viene effettuata utilizzando la catalis in rame, dove è possibile utilizzare Cu^{2 o} (CuSO_4,con un agente di riduzione dell'acido ascorbico) o Cu^(CuI) come reagente di partenza. Dopo la purificazione (Figura 2), i MIC dovrebbero essere testati come con l'azide. Anche con un'attenta considerazione della scelta del fluoroforo e del sito di fissaggio, è possibile che si osservi una scarsa attività antibiotica. Ciò non significa, tuttavia, che una sonda inattiva sia senza uso. Come mostrato con le sonde TMP, i composti con scarsa attività antibatterica possono ancora legarsi allo stesso obiettivo del farmaco genitore. Ciò può consentire studi sulla modalità di azione e l'esame di fenomeni che portano alla resistenza, come l'efflusso.

Come descritto nella sezione protocolli, è possibile analizzare l'etichettatura batterica da parte degli antibiotici fluorescenti utilizzando un semplice analisi spettrofotometria (Figura 3) o citometria di flusso (Figura 4). Entrambi i metodi sono in grado di quantificare l'accumulo cellulare, e da lisciviando le cellule ed esaminando la localizzazione della fluorescenza in lisa, è possibile valutare l'accumulo intracellulare. In questo protocollo, l'uso del lysozyme per la lisi cellulare è descritto, come questa è una tecnica rapida e universale. Altre condizioni di lisi, come il trattamento notturno con glicina-HCl⁷, sono state utilizzate con successo. Utilizzando questa tecnica, è possibile studiare l'impatto dell'efflusso sull'accumulo cellulare antibiotico, che è un importante meccanismo di resistenza. Se l'efflusso è effettivamente presente nei batteri, si osserverà una mancanza di accumulo intracellulare, anche se questo può essere salvato utilizzando un inibitore dell'efflusso come CCCP.

La microscopia può anche essere effettuata per ispezionare visivamente la localizzazione della sonda in diversi batteri, raccogliendo informazioni sul modo di agire e potenzialmente anche resistenza (vedi Figura 5 per esempi rappresentativi). Per vedere la localizzazione all'interno dei batteri, è necessario un microscopio confocale ad alta risoluzione, dotato di funzionalità come SIM (microscopia ad illuminazione strutturata), SR-SIM (superrisoluzione-SIM), Airyscan o STED (esaurimento delle emissioni stimolato). Inoltre, devono essere utilizzati cover slip ad alte prestazioni e analisi post-imaging su un software appropriato (ad esempio, FIJI, zen o Imaris). La localizzazione delle sonde viene confrontata con i coloranti che macchiano architetture specifiche, come Hoechst-33342 (acido blu, nucleico), Syto-9 (verde, acido nucleico), e FM4-64FX (rosso, membrana). La scelta dei coloranti deve essere fatta per abbinare l'antibiotico fluorescente, in modo che ogni colore utilizzato abbia una minima sovrapposizione spettrale. Per ottenere le migliori immagini possibili, potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione. Ad esempio, se i batteri sono troppo affollati sul vetrino, prendere solo una parte del pellet sospeso, quindi diluire con più supporto di montaggio. Al contrario, se i batteri sono troppo sparsi sul vetrino, è sufficiente iniziare con più batteri. In questo protocollo, l'uso di un gel termoresibile compatibile con cellule vive (ad esempio, Cygel) è raccomandato per l'imaging delle cellule vive, in quanto immobilizza i batteri (compresi i batteri motili), ma sono stati utilizzati con successo anche altri supporti di montaggio o agarose.

Nel complesso, nonostante le sfide che possono essere affrontate nella preparazione di derivati antibiotici fluorescenti biologicamente attivi, la semplicità del loro utilizzo e la loro versatilità rendono queste sonde strumenti interessanti per la ricerca in AMR. Il lavoro futuro con antibiotici fluorescenti ha il potenziale per fornire informazioni sui meccanismi della resistenza agli antibiotici, migliorare la nostra comprensione del funzionamento degli attuali antibiotici e aiutare lo sviluppo di farmaci migliori.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-(dimethylamino)phenol	Alfa-Aesar	B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran	Sigma-Aldrich	163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane	Merck	UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm)	Waters	186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm)	Waters	186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer	Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge	Buchi	BUC145152103
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Celite 545	Sigma-Aldrich	22140-5KG-F
Cygel	ABCAM	Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope	Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain	Life Technologies Australia Pt	F34653
Gallios flow cytometer	Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise	CHRIST
Gilson HPLC 2020	Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32	Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm)	Schott/Zeiss	474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo	Life Technologies Australia Pt	H21492
LB	AMRESCO	J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation	Leica
Lysozyme from chicken egg white lyophilized powder	Sigma-Aldrich	L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted	Becton Dickinson	212322
Propargylamine	Sigma-Aldrich	P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC	Buchi
Shimadzu LCMS-2020	Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge	Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM)	Merck	1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Life Technologies Australia Pt	S34854
TECAN Infinite M1000 PRO	TECAN