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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo stabilito un modo efficiente per esaurire i batteri intestinali in tre giorni e successivamente trapiantare il microbiota fecale tramite sonda gastrica di liquido fecale preparato da contenuti intestinali freschi o congelati nei topi. Presentiamo anche un metodo ottimizzato per rilevare la frequenza dei batteri rivestiti di IgA nell'intestino.

Abstract

Il microbiota intestinale esercita ruoli pleiotropici nella salute e nelle malattie umane. Il trapianto di microbiota fecale (FMT) è un metodo efficace per studiare la funzione biologica dei batteri intestinali nel loro insieme o a livello di specie. Sono stati pubblicati diversi metodi FMT. Qui, presentiamo un protocollo FMT che esaurisce con successo il microbiota intestinale in pochi giorni, seguito dal trapianto di microbiota fecale dal contenuto intestinale fresco o congelato di donatore a topi convenzionali. La PCR in tempo reale viene applicata per testare l'efficacia della deplezione batterica. Il sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S (rRNA) viene quindi applicato per testare l'abbondanza relativa e l'identità del microbiota intestinale nei topi riceventi. Presentiamo anche un metodo di rilevamento basato sulla citometria a flusso dei batteri rivestiti di immunoglobuline A (IgA) nell'intestino.

Introduzione

Un microbiota intestinale diversificato svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi dell'ospite. Questo microbioma aiuta in vari processi fisiologici che vanno dalla digestione e dall'assorbimento dei nutrienti dal cibo, alla difesa contro le infezioni da agenti patogeni, alla regolazione dello sviluppo del sistema immunitario e all'omeostasi immunitaria1. La perturbazione della composizione microbica intestinale è stata collegata a molte malattie, tra cui il cancro2, le malattie autoimmuni3, le malattie infiammatorie intestinali4, le malattie neurologiche5 e le malattie metaboliche 6,7. I topi privi di germi (GF) sono strumenti potenti nei modelli di trapianto di microbiota fecale per studiare gli effetti biologici del microbiota8. Tuttavia, l'ambiente di stabulazione dei GF è molto rigoroso e l'esecuzione del trapianto di microbiota fecale (FMT) in questi topi è costosa. Inoltre, i topi GF hanno diverse proprietà di barriera e mucosa, che regolano la penetrazione batterica, rispetto ai topi convenzionali9. Questi fattori limitano l'ampia applicazione dei topi GF negli studi. Un'alternativa all'uso di topi GF è quella di esaurire il microbiota nei topi convenzionali utilizzando un cocktail di antibiotici seguito da FMT. I metodi FMT precedentemente riportati non sono ben descritti e incoerenti; pertanto, è necessario stabilire un protocollo fattibile, efficiente e riproducibile per eseguire l'FMT utilizzando topi convenzionali.

Diversi passaggi sono cruciali per un FMT di successo. L'efficienza della deplezione del microbiota è il primo passo importante. Per la deplezione batterica, è stato riportato l'uso di un singolo antibiotico ad ampio spettro (ad es. streptomicina10) o di un cocktail di antibiotici (triplo o quadruplo trattamento antibiotico)11,12. Il trattamento quadruplo antibiotico, tra cui ampicillina, metronidazolo, neomicina e vancomicina, è risultato essere il regime più efficace ed è stato utilizzato in diversi studi 13,14,15. Oltre al tipo di antibiotico utilizzato, la via di somministrazione, il dosaggio e la durata del trattamento antibiotico influenzano l'efficacia della deplezione batterica. Alcuni ricercatori applicano antibiotici nell'acqua potabile per eliminare i batteri nel tratto gastrointestinale15. Tuttavia, è difficile controllare il dosaggio di antibiotici che ogni topo riceve in questo modo. Pertanto, in studi successivi, i ricercatori hanno trattato topi con antibiotici mediante sonda gastrica orale per 1-2 settimane12 per ottenere una deplezione soddisfacente. Tuttavia, l'uso a lungo termine di antibiotici può essere problematico, poiché gli antibiotici stessi possono influenzare alcune malattie nei modelli di roditori16. Pertanto, sono necessari metodi più rapidi ed efficienti per la deplezione del microbiota.

La preparazione del fluido fecale è un altro passo fondamentale per garantire il successo dell'FMT. Nel tratto gastrointestinale, il pH varia da 1 nello stomaco a 7 nell'intestino prossimale e distale9. Il microbiota nello stomaco è limitato a causa dell'elevata acidità e include l'Helicobacter pylori17. L'intestino prossimale produce acido biliare per la circolazione epatica-intestinale e contiene microbiota associato alla digestione di grassi, proteine e glucosio. Il tratto intestinale distale contiene abbondanti batteri anaerobi e presenta un'elevata diversità microbica18. Data l'eterogeneità spaziale del microbiota intestinale, è imperativo isolare il contenuto intestinale da diverse regioni dei tratti intestinali per la preparazione del liquido fecale. Inoltre, altri fattori, tra cui la natura del campione del donatore (ad esempio, campione fresco o congelato), la frequenza e la durata del trapianto sono cruciali quando si esegue l'FMT. Le feci congelate sono più comunemente usate per colonizzare topi convenzionali con microbiota intestinale umano19. Al contrario, l'FMT che utilizza feci fresche da donatori animali è più appropriato e comunemente usato nei modelli animali20,21. La frequenza e la durata dell'FMT variano a seconda del disegno sperimentale e dei modelli. In studi precedenti, l'FMT veniva eseguito quotidianamente o ogni due giorni. La durata del trapianto variava da 3 giorni22 a 5 settimane23. Oltre ai fattori di cui sopra, il mantenimento di un ambiente chirurgico asettico e l'uso di strumenti chirurgici sterilizzati è fondamentale per evitare contaminazioni batteriche ambientali impreviste.

Il microbiota intestinale ha il potenziale per regolare l'accumulo di cellule che esprimono l'immunoglobulina A (IgA). Le IgA, un isotipo anticorpale predominante, sono fondamentali per proteggere l'ospite dall'infezione attraverso la neutralizzazione e l'esclusione. Le IgA ad alta affinità vengono trascitozzate nel lume intestinale e possono legarsi e rivestire i patogeni incriminati. Al contrario, il rivestimento con IgA può fornire un vantaggio di colonizzazione per i batteri24. A differenza delle IgA indotte da patogeni, le IgA autoctone indotte da commensali hanno un'affinità e una specificità inferiori25. Si dice che la percentuale di batteri intestinali rivestiti di IgA sia significativamente aumentata in alcune malattie25,26. I batteri rivestiti di IgA possono avviare un ciclo di feedback positivo della produzione di IgA27. Pertanto, il livello relativo di batteri rivestiti di IgA può prevedere l'entità della risposta infiammatoria nell'intestino. Infatti, questa combinazione può essere rilevata tramite citometria a flusso28. Utilizzando la selezione basata su IgA, Floris et al.27, Palm et al.25 e Andrew et al.29 hanno acquisito batteri IgA+ e IgA-fecali da topi e hanno caratterizzato il microbiota intestinale rivestito taxa-specifico tramite sequenziamento dell'rRNA 16S.

In questo studio, descriviamo un metodo ottimizzato per esaurire in modo efficiente i batteri dominanti intestinali e colonizzare topi convenzionali con microbiota fecale fresco o congelato isolato dal contenuto dell'ileo e del colon. Dimostriamo anche un metodo basato sulla citometria a flusso per rilevare i batteri leganti le IgA nell'intestino.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le attuali normative etiche per la cura e l'uso degli animali in Cina.

NOTA: Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente controllato privo di agenti patogeni specifici (SPF) con cicli di luce e buio di 12 ore a 25 °C. Il cibo veniva irradiato prima di essere somministrato ai topi. L'acqua potabile e le gabbie sono state sterilizzate in autoclave prima dell'uso. Nello studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di otto settimane dopo 1 settimana di acclimatazione. Sono stati divisi in diversi gruppi in base al disegno dell'esperimento. Ogni gruppo era composto da almeno tre topi.

1. Deplezione del microbiota intestinale

  1. Preparazione di cocktail antibiotici
    1. Preparare una soluzione antibiotica in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) con 0,5 mg/mL di vancomicina cloridrato, 1 mg/mL di metronidazolo, 1 mg/mL di sale sodico di ampicillina e 1 mg/mL di neomicina solfato.
      NOTA: Conservare gli antibiotici a 2-8 °C ed evitare la luce diretta. Preparare la soluzione del cocktail antibiotico fresca e utilizzarla immediatamente.
  2. Regime di trattamento
    1. Per 3 giorni, somministrare per via orale 200 μL di cocktail antibiotico preparato con un ago #10 a un topo. Tenere il mouse verticalmente in una mano mentre si usa l'altra mano per regolare l'angolazione dell'ago per evitare di raggiungere lo stomaco.
      NOTA: Il topo deve essere maneggiato delicatamente per evitare di lottare, perché il danno alla superficie dell'esofago e dello stomaco può provocare infiammazione o morte.
    2. Aggiungere antibiotici all'acqua potabile alle stesse concentrazioni indicate al punto 1.1.1.
    3. Tre giorni dopo, sacrifica il topo per asfissia da CO2 .
    4. Sezionare l'addome in modo asettico utilizzando strumenti sterili. A una distanza di 2 cm dal cieco, tagliare un tratto di 2 cm dell'ileo. Usando una pinzetta sterile per bloccare un'estremità del tratto, spremere il contenuto fresco dal tratto in tubi pre-pesati.
    5. Per raccogliere il contenuto del cieco, tagliarlo a metà con le forbici chirurgiche. Spremere il contenuto di ciascuna metà del cieco in provette pre-pesate.
  3. Valutare l'efficacia della deplezione del microbiota intestinale.
    1. Pesare il contenuto intestinale isolato dall'ileo o dal cieco di topi naïve e topi trattati con cocktail antibiotici ed estrarre il DNA del microbiota fecale utilizzando un kit secondo le istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione di DNA secondo la formula:

      campione di concentrazione (μg/mL) = OD260 x 50
       
    2. Costruire una curva standard.
      1. Amplificare i geni di E. Coli con una reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando primer specifici V3-V4. Predenatura a 95 °C per 1 minuto, amplificare per 40 cicli a 95 °C per 10 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 30 s.
      2. Costruisci un plasmide collegando il prodotto amplificato a un vettore TA. Clonare la coltura con un kit vettoriale TA secondo le istruzioni del produttore.
      3. Misurare la concentrazione di plasmidi (ng/μL) in base al valore OD260 come descritto al punto 1.3.1.
        NOTA: L'unità di misura della concentrazione del plasmide è diversa dall'unità di misura della concentrazione del DNA.
      4. Calcola il numero di copie utilizzando la seguente formula, dove MW sta per peso molecolare:

        copie in 1 μL = concentrazione (ng/μL) x 10-9 x 6,02 x 1023/(plasmide MW x 660)
         
      5. Ricostituire il plasmide con acqua distillata doppia fino a una concentrazione finale di 40 μg/μL. Preparare una serie di diluizioni in gradiente 10x con otto stadi. Costruire una curva standard tracciando il valore CT (asse Y) rispetto al log (copie del plasmide) (asse X) dopo l'amplificazione PCR, dove CT sta per ciclo di soglia per l'amplificazione del bersaglio. Estrai l'equazione dal grafico (in questo caso, era y = -3,07x + 45,07, R2 = 0,994).
    3. Amplificare 1 μl dei campioni di DNA ottenuti nella fase 1.3.1 estratti dall'ileo o dal cieco da un gruppo di controllo naive e dal gruppo di trattamento con cocktail di antibiotici mediante PCR in tempo reale come descritto nella fase 1.3.2.1. Calcolare il numero di copie in 1 μl dei campioni di DNA in base alla curva standard al passaggio 1.3.2.5 e quindi calcolare il numero totale di copie utilizzando la seguente formula:
      Numero totale di copie (per mg) nei campioni pesati = numero di copie × volume totale di DNA/peso iniziale del campione
  4. Analizza il DNA del microbiota sequenziando le regioni 16S rRNA V3 e V4.

2. Trapianto di microbiota fecale

  1. Preparazione del fluido fecale per campioni di feci fresche e congelate
    NOTA: Tutti gli strumenti sono immersi in alcol al 75% prima dell'uso per evitare contaminazioni batteriche preesistenti. È fondamentale evitare la contaminazione quando viene raccolto il contenuto dell'ileo e del colon.
    1. Sacrificare 3-5 topi donatori per asfissia da CO2 .
    2. Raccogliere il contenuto dell'ileo come descritto nel passaggio 1.2.4.
    3. Per raccogliere il contenuto nel colon, praticare la prima incisione vicino all'ano e tagliare il tratto superiore di 2 cm. Estrarre il contenuto come spiegato nel passaggio 1.2.4. Raccogliere i campioni in 1 minuto per ridurre l'esposizione all'aria.
    4. Per il liquido fecale congelato, raccogliere il contenuto dell'ileo o del colon come descritto nei passaggi 2.1.2 e 2.1.3 e congelare il contenuto in azoto liquido.
    5. Conservare i campioni in un congelatore a -80 °C fino al momento dell'uso.
  2. Raggruppare e pesare il contenuto, aggiungere in provette sterili fresche con perline. Per i campioni congelati, scongelare i pellet fecali su ghiaccio prima di pesarli.
  3. Aggiungere PBS sterile nella provetta e risospendere i pellet fecali in PBS (1 mL di PBS/0,2 g di pellet fecale) utilizzando un ago siringa da 5 mL. Omogeneizzare completamente il pellet fecale con perline e vortice 3 volte per 1 minuto ciascuno.
  4. Centrifugare a 800 x g per 3 minuti, quindi filtrare i surnatanti passando attraverso un colino cellulare da 70 μm. Raccogliere il liquido fecale filtrato in una provetta sterile e utilizzare immediatamente per l'FMT.

3. Procedura di trapianto di microbiota fecale

  1. Somministrare 200 μL di liquido fecale preparato ai topi impoveriti di microbiota tramite sonda gastrica orale ogni due giorni per 7 giorni. Topi di controllo con sonda gastrica con 200 μL di PBS sterile.
  2. Sacrificare i topi per asfissia da CO2 e prelevare il contenuto dall'ileo e dal colon secondo i passaggi 2.1.2 e 2.1.3. Conservare i campioni a -80 °C fino a nuova lavorazione.
  3. Estrarre il DNA del microbiota dell'ileo e del colon come descritto al punto 1.3.1. Verificare la composizione del microbiota nell'intestino dei topi trapiantati mediante sequenziamento dell'rRNA 16S.

4. Misurazione dei batteri rivestiti di IgA

  1. Preparazione del campione
    1. Raccogliere 50 mg di pellet fecali da topi donatori come descritto nei passaggi 2.1.2 e 2.1.3 e incubare in 1 mL di PBS sterile a 4 °C per 1 ora. Omogeneizzare i pellet con un battitore di sfere per 5 s.
    2. Centrifugare la soluzione a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante dopo la filtrazione attraverso un colino da 70 μm.
      NOTA: Evitare la centrifugazione ad alta velocità.
    3. Aggiungere 5 μL di surnatante a 1 mL di albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS (tampone FACS). Pellettare a 8.000 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
    4. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone FACS, centrifugare a 8.000 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il surnatante.
      NOTA: Potrebbe essere necessario ottimizzare il volume utilizzato qui. Una quantità eccessiva di surnatante in questa fase può mascherare il segnale positivo dei batteri rivestiti di IgA.
    5. Risospendere il pellet in 100 μL di PBS contenente il 10% di siero di capra e incubare su ghiaccio o a 4 °C per 30 minuti. Aggiungere 1 mL di tampone FACS nella provetta e centrifugare a 8.000 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare.
  2. Citometria a flusso
    1. Risospendere il pellet ottenuto al punto 4.1.5 con 200 μL di tampone FACS contenente anticorpo anti-IgA di topo biotina (1:100) e anticorpo anti-biotina coniugato con APC (1:100) e incubare per 30 min a 4 °C.
    2. Aggiungere 1 mL di tampone FACS nella provetta e centrifugare a 8.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.
    3. Colorare il pellet dal passaggio 4.2.2 aggiungendo 200 μl di tampone FACS contenente colorante di acido nucleico fluorescente verde (1:200) e incubare a 4 °C per 5 minuti.
    4. Aggiungere 1 mL di tampone FACS e centrifugare a 8.000 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettare.
    5. Risospendere il pellet in 250 μL di tampone FACS prima della misurazione.
    6. Acquisisci i dati utilizzando un citometro a flusso e analizzali utilizzando il software FlowJo.

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Risultati

Il programma FMT utilizzato in questo studio è delineato nella Figura 1. Dopo il trattamento con il cocktail di antibiotici, l'efficienza della deplezione del microbiota intestinale è stata analizzata sequenziando la regione 16S rRNA. Abbiamo rilevato 196 specie nell'ileo di topi naïve, mentre il trattamento antibiotico di 3 giorni ha ridotto rapidamente le specie batteriche a 35 (Figura 2A). Sono state rilevate otto specie s...

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Discussione

Gli antibiotici utilizzati nella procedura di deplezione hanno diverse proprietà antibatteriche. La vancomicina è specifica per i batteri gram-positivi30. La doxiciclina orale può indurre cambiamenti significativi nella composizione del microbiota intestinale nei topi femmina C57BL/6NCrl31. La neomicina è un antibiotico ad ampio spettro che prende di mira la maggior parte dei batteri residenti nell'intestino32. T...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato svolto sotto il patrocinio dell'eccezionale progetto interdisciplinare del West China Hospital, dell'Università del Sichuan (Grant Nr: ZYJC18024) e della National Natural Science Foundation of China (Grant: 81770101 e 81973540).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL syringe needleSheng guang biotech5mL
70 µm cell strainerBD biosciences352350
Ampicillin sodium saltAMERESCO0339
APC StreptavidinBD biosciences554067
Biotin anti-mouse IgA antibodyBiolegend407003
Bovine serum albiumin (BSA)SigmaB2064-50G
C57BL/6J miceChengdu Dashuo
CO2Xiyuan biotech
E.Coil genome DNATsingKe
Eppendorf tubesAxygenMCT150-C
Fast DNA stool mini HandbookQIAGEN51604
MetronidazoleShyuanyeS17079-5g
Neomycin sulfateSIGMAN-1876
Oral gavage needleYuke biotech10#
pClone007 Versatile simple TA vector kitTsingKe007VS
Phosphate Buffer Saline (PBS)HycloneSH30256
Precellys lysing kitPrecellysKT03961-1-001.2
RT PCR SYBR MIXVazymeQ411-01
SYTO BC green Fluorescent Nucleic Acid StainThermo fisher scientificS34855
V338 F primerTsingKeACTCCTACGGGAGGCAGCAG
V806 R primerTsingKeGGACTACHVGGGTWTCTAAT
Vancomycin hydrochlorideSigmaV2002
Equipments
BD FACSCalibur flow cytometerBD biosciences
Bead beater vortxScilogex
BIORAD CFX ConnectBIORAD
Centrifuge machineEppendorf
Illumina MiSeqIllumina
Nanodrop nucleic acid measurements machineThermo fisher scientific
Surgical instrumentsYuke biotech
Software
Adobe Illustrator CC 2015Version 2015
BIORAD CFX qPCR SOFTWARE
FlowJo software
Graphpad prism 7
Database
Silva (SSU132) 16S rRNA database

Riferimenti

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