Un approccio intravitale basato sulla microscopia per valutare la permeabilità intestinale e le prestazioni di spargimento di cellule epiteliali

Riepilogo

Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.

Abstract

La microscopia intravitale dell'intestino con imaging confocale consente l'osservazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali e la perdita di barriere negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale dei topi anestetizzati è macchiata localmente con colorazione non specifica (acriflavina) e un tracciante fluorescente (rodiammina-B dextran), montato su una piastra risciacquata a soluzione salina e direttamente immaginato utilizzando un microscopio confocale. Questa tecnica può integrare altre tecniche non invasive per identificare la perdita di permeabilità intestinale, come il passaggio transmucoso di traccianti somministrati per via orale. Oltre a questo, l'approccio qui presentato consente l'osservazione diretta degli eventi di spargimento di cellule in tempo reale. In combinazione con appropriati topi reporter fluorescenti, questo approccio è adatto per far luce nei meccanismi cellulari e molecolari che controllano l'estrusione delle cellule epiteliali intestinali, nonché in altri processi biologici. Negli ultimi decenni, studi interessanti che utilizzano la microscopia intravitale hanno contribuito alla conoscenza della permeabilità endoteliale, del homing intestinale delle cellule immunitarie, della comunicazione immuno-epiteliale e dell'invasione dei componenti luminali, tra gli altri. Insieme, il protocollo qui presentato non solo aiuterebbe ad aumentare la comprensione dei meccanismi che controllano l'estrusione cellulare epiteliale, ma potrebbe anche essere la base per lo sviluppo di altri approcci da utilizzare come strumenti per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici, anche in altri tessuti. Tra le limitazioni tecniche, le proprietà ottiche del tessuto specifico, così come la tecnologia di imaging selezionata e la configurazione del microscopio, determinerebbero a loro volta la distanza di lavoro dell'imaging e la risoluzione delle immagini acquisite.

Introduzione

L'intestino è un organo altamente specializzato con una funzione strettamente regolata che consente processi contrastanti, vale a dire nutrizione e protezione contro le sostanze luminali nocive. Foderando tra il corpo umano e l'ambiente, l'epitelio intestinale agisce come barriera fisica e immunologica e contribuisce al mantenimento dell'omeostasi mucosa^{nell'intestino 1,,2}. La perdita di integrità epiteliale e l'aumento della permeabilità alla giunzione stretta sono ben noti per essere associati alla malattia infiammatoria intestinale (IBD)^3,,4,,5,,6. Le alterazioni epiteliali sono quindi considerate cause e amplificatori secondari per l'infiammazione intestinale cronica nell'IBD. Pertanto, una migliore comprensione delle prime alterazioni epiteliali nell'intestino dei pazienti affetti da IBD sarebbe di immenso valore per lo sviluppo di nuove strategie per ripristinare l'integrità epiteliale per una previsione affidabile e la successiva prevenzione delle ricadute dell'IBD.

L'epitelio intestinale segue un processo di turnover complesso e strettamente regolato. Dal fondo della cripta, le cellule epiteliali intestinali differenziate terminale (IEC) derivate da cellule staminali pluripotenti migrano verso l'alto verso la punta del villus, dove le cellule invecchiate / danneggiate vengono versate nel lume⁷. L'equilibrio tra divisione ed estrusione cellulare consente il mantenimento del numero di cellule epiteliali intestinali, evitando la formazione di spazi vuoti e perdite, nonché l'accumulo di cellule epiteliali che potenzialmente portano a masse cellulari e tumorigenesi^8,,9,,10. Nonostante il ruolo chiave dello spargimento di cellule epiteliali nel fisiologico rinnovamento dell'epitelio intestinale, la conoscenza dei meccanismi molecolari che guidano l'estrusione delle cellule sulla punta del villus è limitata. Pertanto, è necessaria una ricerca di base che fornisca una descrizione precisa della sequenza di eventi molecolari coinvolti nello spargimento di cellule epiteliali.

Interazioni complesse tra diversi tipi di cellule all'interno della mucosa intestinale sono fondamentali per comprendere i meccanismi molecolari che regolano il turnover epiteliale e l'omeostasi intestinale. Pertanto, gli studi in vivo offrono alti vantaggi rispetto agli approcci in vitro ed ex vivo in questo contesto. Inoltre, le tecniche di imaging in tempo reale consentono la descrizione della sequenza di eventi che controllano fenomeni specifici. In questo contesto, lo studio di processi altamente dinamici richiede l'utilizzo di tecniche ottimizzate ad alta risoluzione per l'osservazione diretta del tessuto. Le tecniche di imaging intravitale appaiono come strumenti adatti unici per lo studio dello spargimento di cellule epiteliali nell'intestino.

Il termine "microscopia intravitale" si riferisce ad approcci sperimentali che sfruttano le tecniche di imaging ad alta risoluzione (microscopia multifotonale o confocale) per visualizzare direttamente cellule e tessuti nei loro dintorni nativi all'interno di un animale^{vivente 11}. Consente l'acquisizione in tempo reale di informazioni in vivo fino alla risoluzione a cella singola e comporta chiari vantaggi rispetto ai metodi statici o a bassa risoluzione. La microscopia intravitale fornisce informazioni complementari e supera alcune limitazioni delle tecniche classiche e/o di fascia alta, come gli artefatti dovuti alla lavorazione dei tessuti. Al contrario, la principale limitazione della microscopia intravitale è che il tessuto deve essere direttamente esposto al microscopio, che nella maggior parte dei casi richiede un intervento chirurgico. Sebbene approcci sofisticati conservino la vitalità e minimizzino l'impatto del tessuto immaginato (camere scuoiate e finestre di imaging)^12,,13, nella maggior parte dei casi viene eseguita una semplice incisione cutanea per l'esternalizzazione del tessuto (lembi della pelle)¹⁴. Nell'ultimo decennio, questi approcci hanno fornito prove chiave su processi altamente dinamici, che in precedenza erano imperscrutabili. Traslazione, l'imaging in tempo reale ha fornito nuove intuizioni biologiche su cellule staminali e leucociti che hanno^{affinato 15}, nonché la diffusione del cancro e la formazione di metastasi^13,,16. Nel contesto clinico, l'endomicroscopia è attualmente sfruttata come strumento diagnostico del^{cancro 17} e delle malattie gastrointestinali, come l'IBD^18,19; mentre la microscopia a mosaico confocale è diventata uno strumento di patologia rapida durante l'intervento^{chirurgico 20}. Insieme, la microscopia intravitale è recentemente emersa come uno strumento prezioso e versatile per la ricerca biomedica e l'applicazione futura in clinica.

La microscopia intravitale è qui implementata per la visualizzazione in tempo reale della perdita epiteliale intestinale e l'osservazione di eventi di spargimento di cellule epiteliali. La perdita di permeabilità intestinale può essere identificata da altre tecniche in vivo non invasive, come la quantificazione della somministrazione orale di traccianti fluorescenti nel siero²¹. Tuttavia, questa tecnica non consente l'osservazione diretta delle prestazioni di spargimento né la segregazione tra permeabilità para- e transcellulare. La combinazione di esperimenti di tracciante standard e microscopia intravitale rappresenta un approccio adeguato a: i) identificare i disturbi nella permeabilità intestinale e ii) separare tra permeabilità epiteliale para- e transcellulare. Oltre allo spargimento di cellule, la microscopia intravitale in combinazione con l'etichettatura a fluorescenza in vivo consente lo studio di altri meccanismi cellulari e molecolari (ad esempio, una stretta ridistribuzione della giunzione durante lo spargimento di cellule utilizzando topi reporter fluorescenti²² o interazioni tra IEC e altre cellule all'interno della mucosa intestinale²³).

Il metodo qui presentato rappresenta un adattamento della microscopia intravitale per consentire l'osservazione in tempo reale della mucosa intestinale, utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Pertanto, usiamo topi knock-out condizionali di GGTasi (Geranylgeraniltransferasi) nelle cellule epiteliali intestinali (IEC) in(topi Pggt1b^iΔIEC), poiché soffrono di una grave malattia intestinale e di una maggiore permeabilità epiteliale²⁴. Vengono descritti la preparazione chirurgica del topo e la colorazione della mucosa intestinale, nonché le impostazioni appropriate utilizzate per l'acquisizione dell'imaging e l'analisi post-acquisizione. Questo protocollo potrebbe consentire studi futuri che contribuiscono alle attuali conoscenze sulla dinamica e cinetica dello spargimento di cellule epiteliali intestinali. Inoltre, il protocollo potrebbe servire come base per vari adattamenti per studiare altri fenomeni che si verificano sulla superficie della mucosa intestinale e persino in altri tessuti.

Protocollo

Il seguente protocollo è stato approvato dalle autorità locali competenti di Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germania). I topi erano alloggiati in specifiche condizioni esenti da agenti patogeni.

NOTA: L'inibizione della prenilazione mediata da GGTasi all'interno degli IEC provoca una grave alterazione della permeabilità intestinale nei topi Pggt1b^{iΔIEC 24}. Pertanto, questo modello di mouse è stato utilizzato per dimostrare come il protocollo può essere utile per studiare i difetti della barriera intestinale. Tuttavia, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per lo studio di qualsiasi altra linea di mouse.

1. Preparazione chirurgica e colorazione della mucosa intestinale del topo

NOTA: La preparazione chirurgica si basa sui protocolli precedentemente descritti²⁵. Tenere il topo anestetizzato sotto una lampada rossa durante la preparazione chirurgica, per evitare un calo della temperatura corporea.

1. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina (96 mg/kg di chetamina; e 12,8 mg/kg di xilazina). Verificare l'anestesia verificando la mancanza di un riflesso palpebrale.
2. Applicare la crema per la protezione degli occhi con un cotton fioc.
3. Effettuare un'incisione (1 cm) sull'area ventrale sinistra utilizzando forcette standard e forbici sottili dritte.
4. Esternarizzare un segmento dell'intestino (5-7 cm, approssimativamente).
5. Aprire il segmento intestinale esternalizzato longitudinalmente per elettrocauterizzazione sul lato antimesenterico.
6. Esporre la mucosa e risciacquare a breve con soluzione salina per rimuovere il contenuto fecale.
   NOTA: Facoltativamente, applicare xylazin direttamente sull'intestino per evitare artefatti di movimento dovuti alla peristalisi.
7. Macchiare la superficie della mucosa intestinale con acriflavina e rodiammina-B dextran (10 kDa).
   1. Applicare la soluzione di acriflavina da 1 mg/mL (100 μL) pipettando goccia a goccia sulla mucosa e incubare per 3 minuti. Lavare la soluzione rimanente con PBS.
   2. Applicare la soluzione di 2 mg/mL rhodamine-dextran (100 μL) pipettando goccia a goccia sulla mucosa e incubare per 3 min. Lavare la soluzione rimanente con PBS.
      NOTA: Facoltativamente, rimuovere il sangue dalla preparazione usando cotone asettico.
8. Posizionare la supina del mouse anestetizzata su uno scivolo di copertura montato in una camera risciacquata con soluzione salina preri warmed (37 °C).
   NOTA: Il segmento intestinale aperto viene quindi posizionato sulla superficie luminare verso il basso, sullo scivolo di copertura.
9. Posizionare la preparazione (topo anestetizzato nella camera) sullo stadio del microscopio invertito.
10. Coprire l'animale con un tampone isotermico (circa 37 °C).
11. Procedere immediatamente alla microscopia intravitale.
    NOTA: Mantenere la preparazione chirurgica risciacquata con soluzione salina preri warmed per evitare la disidratazione del tessuto e la morte cellulare.

2. Microscopia intravitale

NOTA: Eseguire il passaggio 2.1 prima di iniziare la preparazione chirurgica, per evitare lunghi tempi di attesa tra anestesia, chirurgia e acquisizione di immagini. Se necessario, ulteriori dosi di anestetici possono essere somministrate ad animali preparati chirurgicamente per tenerli in anestesia per gli esperimenti di imaging.

1. Impostare il microscopio CLSM.
   1. Avviare il microscopio CLSM accendendo la base del microscopio e la scatola dello scanner. Accendere il computer premendo il pulsante Start.
   2. Avviare il software di acquisizione delle immagini (ad esempio, LAS X) facendo doppio clic sull'icona. Selezionare la configurazione appropriata (Configurazione: macchina; Microscopio: DMI6000) e fare clic su OK.
      1. Definire la risoluzione appropriata. Vai a Configurazione | | Procedura di risoluzione | Profondità del bit. Selezionare 12.
   3. Passare al menu Acquisizione. Selezionate xyzt per la modalità di acquisizione dell'immagine dal menu a discesa. Selezionare l'obiettivo dal menu a discesa (20x o 40x).
   4. Progettare l'impostazione di acquisizione sequenziale. Clicca su Seq. Aggiungere una seconda sequenza, facendo clic sul pulsante aggiungi (+). Selezionare Tra fotogrammi.
      1. Configurare la sequenza 1 (rilevamento dell'acriflavina; eccitazione a 416 nm; emissione di 514 nm). Accendere la scatola laser visibile. Attivare il PMT1 (ON). Definire la finestra della lunghezza d'onda di emissione (490-550 nm).
      2. Configurare la sequenza 2 (rilevamento di rhodamineB-dextran; eccitazione a 570 nm; 590 nm, emissione). Accendere la scatola laser visibile. Attivare il PMT2 (ON). Definire la finestra della lunghezza d'onda di emissione (550-760).
   5. Attivare i laser corrispondenti (488 e 552). Vai a Configurazione | Laser. Attivare laser da 488 e 552 nm (attivare).
2. Regolare l'impostazione in base alle feature specifiche dell'esperimento corrente.
   1. Accendere la sorgente luminosa (premere l'alimentazione). Posizionare la preparazione (mouse anestetizzato nella camera) sullo stadio del microscopio e modificare la posizione xy fino a quando l'asse di illuminazione non è focalizzato sulla preparazione del tessuto.
   2. Selezionare il campo di interesse utilizzando la sorgente luminosa standard e gli oculari.
      1. Selezionare il cubo filtro (I3). Aprire l'otturatore. Concentrati sulla superficie della mucosa intestinale utilizzando la macro e la microruola. Cercare un'area in cui è possibile visualizzare diversi villi all'interno del campo visivo modificando la posizione XY.
   3. Verificare che la colorazione rhodamine-dextran sia visibile anche in quell'area. Modificare il cubo del filtro (N2.1). Controllare l'immagine attraverso gli oculari.
   4. Avviare l'acquisizione delle immagini CLSM dal software. Ottimizzare le impostazioni per le due sequenze.
      1. Selezionare Sequenza 1. Regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la sequenza 1.
      2. Selezionare Sequenza 2. Regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la sequenza 2.
   5. Definire l'intervallo di stack z.
      1. Aprire il menu di consegna dello stack Z. Concentrati sulla superficie della mucosa usando il controllo dell'asse Z. Premere Begin.
      2. Concentrati sul limite inferiore in cui il segnale è ancora rilevabile. Premere Fine.
      3. Definire i numeri delle pile z (10). Evitare perdite di tempo superiori a 2 minuti per due punti di tempo consecutivi.
   6. Definire le impostazioni dell'ora. Passare al menu Ora. Fare clic su Riduci a icona. Selezionare Acquisisci fino all'arresto.
   7. Definire la media della linea. Selezionare Seq 1. Selezionare Media riga 2. Selezionare Seq 2. Selezionare Media riga 2.
3. Acquisire le immagini corrispondenti.
   1. Selezionare Formato (1024 x 1024) e Velocità (400). Premere Start.
   2. Premere Interrompi dopo il tempo di acquisizione dell'immagine desiderato.
4. Salvare il file. Passare a Progetto. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file corrispondente. Premere Salva con nome.
   1. Assegnare un nome appropriato al file. Selezionare la cartella adeguata. Premere Salva.
5. Eutanasia dell'animale (lussazione cervicale) e raccogliere i tessuti per l'analisi del secondo, se necessario.

3. Analisi dell'immagine: determinare la velocità di spargimento cellulare e l'epitelio intestinale

1. Tasso di spargimento cellulare
   1. Avviare il software di acquisizione delle immagini.
   2. Passare a Apri progetti. Selezionare il file appropriato.
   3. Definire il tempo totale di acquisizione dell'immagine.
      1. Selezionare l'ultimo stack z completo. Selezionare l'ultima posizione Z dal punto di tempo selezionato in precedenza. Leggi l'ora nell'angolo inferiore destro dello schermo (tempo totale di acquisizione dell'immagine).
   4. Selezionare un villus.
      1. Selezionare la posizione della pila Z appropriata (superficie del villus, ma abbastanza profonda da evitare l'interferenza con celle già versate e altri componenti presenti al lume).
      2. Misurare la lunghezza della membrana basale. Selezionare lo strumento righello. Dividi il villus in diverse linee per coprire o disegnare l'intero perimetro del villus. Aggiungere i diversi valori (lunghezza totale della membrana basale). Eliminare i segmenti dello strumento Righello.
   5. Contare il numero di eventi che si verificano durante l'intera durata dell'acquisizione dell'immagine.
      1. Dividere il villus in segmenti con dimensioni adeguate. Analizza la sequenza di eventi/segmenti facendo scorrere la barra attraverso i diversi punti di tempo. Annotare gli eventi di spargimento delle celle identificati.
   6. Calcolare il numero di eventi di spargimento/tempo/lunghezza della membrana basale, che indica la velocità di spargimento cellulare. Conta fino a 5 villi/video e almeno due video/mouse. Calcola la media di queste 10 misurazioni.
2. Perdita
   1. Selezionare un villus.
   2. Selezionare la posizione della pila Z appropriata (superficie del villus, ma abbastanza profonda da evitare l'interferenza con celle già versate e altri componenti presenti al lume). Contare il numero totale di cellule epiteliali/vilo.
   3. Contare il numero di punti di perdita (presenza paracellulare di rodimina dextran. Questo evento è transitorio, che può essere confermato controllando le immagini acquisite precedenti e più ulterior).
   4. Calcolare il numero di perdite/numero totale di cellule epiteliali. Analizzare 10 diversi villus/campione/video e calcolare il numero medio di perdite e cellule permeabili/villus.

Risultati

Il protocollo qui presentato descrive un approccio intravitale basato sulla microscopia per visualizzare le perdite epiteliali intestinali e osservare le prestazioni di spargimento cellulare nell'intestino in tempo reale. In breve, i topi vengono anestetizzati e sottoposti a preparazione chirurgica al fine di esporre la superficie della mucosa dell'intestino tenue. Gli IEC vengono quindi macchiati tramite l'applicazione topica dell'acriflavina; mentre la rodimina luminare B-dextran è usa...

Discussione

Sebbene tecnicamente impegnativa, la metodologia basata sulla microscopia intravitale rappresenta un approccio sperimentale unico per visualizzare il processo cellulare altamente dinamico in tempo reale, come le prestazioni di spargimento di cellule. Finora, non esiste un approccio sperimentale alternativo per visualizzare l'estrusione cellulare in vivo. Crediamo che questo protocollo possa contribuire alla descrizione di diversi processi cellulari che svolgono un ruolo nel mantenimento dell'omeostasi intestinale.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422