Knockdown condizionale combinato e formazione di sfere adattate Per studiare un gene associato alla staminalizza delle cellule staminali del cancro gastrico derivato dal paziente

Riepilogo

In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.

Abstract

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicate nell'iniziazione del tumore, nello sviluppo e nella recidiva dopo il trattamento e sono diventate al centro dell'attenzione di molti studi negli ultimi decenni. Pertanto, è importante sviluppare metodi per studiare il ruolo dei geni chiave coinvolti nella staminalità delle cellule tumorali. Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di cancro. Si ritiene che le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) siano la radice della ricaduta del cancro gastrico, della metastasi e della resistenza ai farmaci. Comprendere la biologia dei GCSCs è necessario per far progredire lo sviluppo di terapie mirate e, infine, per ridurre la mortalità tra i pazienti. In questo protocollo, presentiamo un progetto sperimentale utilizzando un sistema di knockdown condizionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare l'effetto della clusterina sullo stelo dei GCSC derivati dal paziente. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare sia in vitro che in vivo la funzione dei geni associati alla derivazione in diversi tipi di CSC.

Introduzione

Il cancro gastrico (GC) è uno dei tipi più comuni e mortali di tumori¹. Nonostante i progressi nella chirurgia combinata, chemioterapia e radioterapia nella terapia GC, la prognosi rimane scarsa e il tasso di sopravvivenza a cinque anni è ancora molto basso². La ricorrenza e la metastasi sono le ragioni principali che causano i decessi post-trattamento.

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono un sottoinsieme di cellule tumorali che possiedono la capacità di auto-rinnovarsi e generare le diverse linee cellulari che ricostituire il tumore³. Si ritiene che i CSC siano responsabili della ricaduta e della metastasi del cancro a causa delle loro capacità di auto-rinnovamento e semina di nuovi tumori, così come la loro resistenza alle tradizionali chemio e radioterapie⁴. Pertanto, il targeting per i CSC e l'eliminazione delle CSC offrono un potenziale entusiasmante per migliorare il trattamento e ridurre la mortalità dei pazienti oncologici.

I CSC sono stati isolati da molti tipi di tumori solidi⁵. Nel 2009, le cellule staminali del cancro gastrico (GCSC) isolate dalle linee cellulari del cancro gastrico umano sono state originariamente descritte da Takaishi et al.⁶. Chen e colleghi hanno in primo luogo identificato e purificato i GCSC dai tessuti tumorali dell'adenocarcinoma gastrico umano (GAC)⁷. Questi risultati non solo forniscono l'opportunità di studiare la biologia dei GCSCs, ma forniscono anche grande importanza clinica.

Una caratteristica particolare dei CSC è la loro capacità di formare una sfera⁸. Le singole cellule sono placcate in condizioni non aderenti a bassa densità, e solo le cellule possedute dall'auto-rinnovamento possono crescere in un solido ammasso sferico chiamato sfera. Pertanto, il saggio sulla formazione della sfera è stato considerato come il saggio gold standard e ampiamente utilizzato per valutare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali in vitro.

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è un potente strumento di ricerca per studiare la funzione genica mediante l'abbattimento di un gene^{specifico 9.} Tuttavia, le tecnologie di abbattimento genico stabili a lungo termine hanno alcune limitazioni, come la sfida di esplorare la funzione di un gene che è essenziale per la sopravvivenza cellulare. I sistemi RNAi condizionali possono essere utili per la downregolazione dei geni desiderati in modo temporale e/o controllato speciale dalla somministrazione di un agente induttivo. I sistemi indutbili di tetraciclina (Tet) sono uno dei sistemi RNAi condizionali più utilizzati¹⁰. I sistemi indutbili di Tet possono indurre il silenziamento genico bersaglio controllando l'espressione dello shRNA su aggiunta di un induttore esogeno (preferibilmente doxycycline, Dox). I sistemi Tet-inducible possono essere suddivisi in due tipi: sistemi Tet-On o Tet-Off. L'espressione di shRNA può essere attivata (Tet-On) o spenta (Tet-Off) in presenza dell'indottore. Nel sistema Tet-ON senza un induttore, il reprimere Tet (TetR) espresso in modo costitutivo si lega alla sequenza di elementi Tet-responsive (TRE) contenente un promotore dipendente da Pol III per l'espressione shRNA, reprimendo così l'espressione dello shRNA. Mentre su aggiunta di Dox, il TetR è sequestrato lontano dal promotore Tet-responsive Pol III-dipendente. Questo facilita l'espressione dello shRNA e porta al knockdown genico.

Il protocollo qui descritto utilizza un sistema di shRNA inducibile in tetraciclino funzionale e un saggio di formazione della sfera adattato per studiare la funzione della clusterina nei GCSC derivati dal^paziente. Usiamo il protocollo descritto per studiare gli effetti della clusterina nell'auto-rinnovo dei GCSC. Questa metodologia è applicabile anche ad altri tipi di cellule staminali tumorali.

Protocollo

Tutte le sperimentazioni con cellule staminali gastriche derivate dal paziente sono state approvate nel documento del comitato etico^{locale 7.}

1. Coltura delle cellule staminali del cancro gastrico

1. Preparazione dei GCSC completa coltura media
   1. Preparare il mezzo di coltura completa GCSC aggiungendo un mezzo DME/F12 fresco con i seguenti ingredienti essenziali: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% insulina/Transferrin/Sodium selenite, 0,2% glucosio, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminoacido non essenziale, 10 M 2-mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO₃, 10 tioglicerolo da 100 M, 100 penicillina IU/mL e 100 g/mL streptomicina. Filtrare e sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 m.
      NOTA: si consiglia di memorizzare il supporto di coltura completo GCSC preferibilmente non più di due settimane a 4 gradi centigradi.
2. Recupero di GCSC e cultura
   NOTA: I GCSC sono stati ottenuti come segue: I campioni di tumore sono stati sottoposti a dissociazione meccanica ed ezimatica. Le sospensioni a singola cella sono state ottenute filtrando con rete di nylon da sospensioni ben disperse. Le cellule tumorali risultanti sono state coltivate in GCSCs Complete Culture Medium, e alcune cellule sono cresciute fino a formare sfere. Queste sfere sono state poi sottoposte a dissociazione ezimatica, e i GCSC possono essere ottenuti mediante smistamento citofluorometrico della popolazione cellulare macchiata con marcatori CD44/CD54. Il protocollo dettagliato e gli analisi funzionali dei GCSC sono stati riportati⁷.
   1. I GCSC pre-caldi completano il mezzo di coltura a 37 gradi centigradi per non più di 30 minuti.
   2. Scongelare i GCSC dallo stoccaggio dell'azoto liquido e dal rapido scongelamento dei criovials in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi. Continua a vorticoso le fiale fino a quando l'intero contenuto si scioglie totalmente.
      NOTA: Scongelare rapidamente le cellule congelate (<1 min) in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi.
   3. Trasferire l'intero contenuto dei criovials in un tubo di centrifuga da 15 mL contenente 10 mL di mezzo di coltura completa GCSC. Centrifuga a 800 x g per 5 min a RT.
   4. Aspirare il supernatant con attenzione e sospendere il pellet cellulare in 10 mL di gcSCs mezzo completo fresco. Piastra la sospensione cellulare in una piastra Petri da 100 mm. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi in un'incubatrice 5% CO₂ e aggiungere 5 mL di mezzo fresco completo il terzo giorno.
3. Sottocultura delle gcSCs
   NOTA: I GCSC del centro delle cellule hanno solo nutrienti sufficienti prima che le sfere abbiano una dimensione fino a 80-100 m di diametro. Una volta che appaiono sfere di refattività scure e basse (circa 6 giorni di coltura), è necessario sottoculturare le sfere tumorali.
   1. Agitare delicatamente il piatto e trasferire il mezzo di coltura della coltura della coltura della coltura della cisfera tumorale GCSCs (il mezzo e le tasse tumorali non aderenti) in un tubo sterile di centrifuga da 15 mL. Per volumi medi più grandi, potrebbero essere necessari tubi di centrifuga più grandi.
   2. Centrifuga a 600 x g per 5 min e smaltire con cura il supernante. Dopo la centrifugazione, sarà visibile un pellet bianco e calato.
   3. Aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione cellulare per riesmirne il pellet per la dissociazione meccanica ed ezimatica a 37 gradi centigradi. Pipetta delicatamente su e giù 10 volte ogni 2-3 minuti nella procedura di digestione per rompere le sfere fino a quando le cellule tumorali sono disperse in sospensione a singola cellula. Questo processo di dissociazione totale è raccomandato per essere inferiore a 15 min.
      NOTA: Eseguire un controllo visivo al microscopio per verificare che non rimangano grandi sfere o aggregati di cellule.
   4. Aggiungere 10 mL di GCSCs freschi pre-riscaldati mezzo di coltura completa (5 volte il volume della soluzione di distacco cellulare) per terminare la procedura di digestione e centrifugare a 800 x g a RT per 5 min.
   5. Scartare il supernatant e risundere le cellule con 1 mL di fresco mezzo di coltura completa pre-riscaldata. Semina un numero adeguato di cellule in un nuovo piatto Petri da 100 mm con 10 mL di GCSC freschi pre-riscaldati completano il mezzo di coltura e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
   6. Rifinanziato le colture di tumori dopo 3 giorni con l'aggiunta di 5 mL di mezzo fresco pre-riscaldato completo. Dopo 6 giorni, le cellule di passaggio quando le cellule tumorali crescono fino a 80-100 m di diametro.
4. Crioconservazione dei GCSC
   NOTA: Non crioconservare le cellule GCSC aggiungendo direttamente le cellule medie alle cellule tumorali. Le cellule tumorali GCSCs devono essere digerite in singole cellule in modo che l'agente protettivo cellulare possa entrare in ogni cellula per garantire l'immagazzinamento stabile a lungo termine delle cellule. Assicurarsi che le cellule siano in una situazione sana e senza contaminazione.
   1. Raccogliere le cellule gcSCs. Centrifuga a 600 x g per 5 min.
   2. Scartare il supernatant e aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione cellulare per dissociare le cellule tumorali GCSCs a 37 gradi centigradi. Terminare la procedura di digestione aggiungendo 10 mL di gcSC completo supporto di coltura.
   3. Centrifuga a 800 x g per 5 min e raccogliere singoli GCSC.
   4. Sospendere delicatamente i GCSC con mezzo crioconservatorio privo di siero. La concentrazione finale raccomandata è 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ celle/mL.
   5. Erogare la sospensione cellulare in aliquots da 1 mL in fiale criogeniche marcate.
   6. Posizionare immediatamente i criovials contenenti le cellule in una camera isopropanolo e conservarli a -80 gradi centigradi. Trasferire le fiale in azoto liquido il giorno successivo per lo stoccaggio a lungo termine.

2. Generazione di linee GCSCs knockdown inducibili

CAUTION: Le lentivirus ricombinanti sono state designate come organismi di livello 2 dal National Institute of Health and Center for Disease Control. Il lavoro che coinvolge il lentivirus richiede il mantenimento di una struttura di Biosafety Level 2, considerando che i supernatanti virali prodotti da questi sistemi lentivirali potrebbero contenere virus ricombinanti potenzialmente pericolosi.

1. Generazione di particelle di lentivirus
   1. Sintetizzare 2 vettori lentivirali che trasportano shRNA inducibili mirati a clusterina umana e un vettore lentivirale di controllo non bersaglio (GV307) di GeneChem basato sulla progettazione della tabella 1 (il vettore GV307 contiene: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
   2. Seme 4 x 10⁶ 293T cellule di confezionamento lenti-virali in un piatto Petri da 100 mm con 10 mL di DMEM integrato con siero bovino fetale al 10%.
   3. Incubare le cellule 293T durante la notte a 37 gradi centigradi, 5% CO₂. Assicurarsi che la densità delle cellule 293T sia circa il 50-80% confluente il giorno della trasfezione.
   4. Portare il siero ridotto a temperatura ambiente e preparare il tubo A e il tubo B come descritto nella tabella 2.
   5. Trasferire il tubo A nel tubo B, mescolare bene e incubare i complessi per 20 minuti a temperatura ambiente per preparare complessi lipidico-DNA.
   6. Rimuovere 5 mL di media, prima di aggiungere il complesso lipidico-DNA, lasciando un totale di 5 mL.
   7. Aggiungere 5 mL di complesso lipidico-DNA nel piatto di coltura dropwise e girare delicatamente il piatto per distribuire il complesso.
      NOTA: Erogare con cura il liquido contro la parete del piatto per evitare di disturbare le cellule 293T.
   8. Piatto di coltura incubato per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
   9. Dopo 24 ore dopo la trasfezione, rimuovere con cura il mezzo di trasfezione e sostituire delicatamente con 10 mL di DMEM pre-riscaldato integrato con 10% FBS. Incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
      NOTA: Tutti i supernatant e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
   10. Circa dopo 48 ore dopo la trasfusione, raccogliere 10 mL di supernatanti contenenti lentivirus.
       NOTA: Tutti i vasi e le punte di coltura cellulare devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
   11. Filtrare il supernatant lentivirale utilizzando un filtro poro da 0,45 m per rimuovere i detriti cellulari.
       NOTA: Tutti i filtri e le siringhe devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
   12. Trasferire il supernatant chiarito in un contenitore sterile, aggiungere Lenti-X Concentrator (1/3 volume di supernatant chiarito) da mescolare per inversione delicata.
   13. Miscela di incubazione a 4 gradi centigradi durante la notte.
   14. Campioni di centrifuga a 1.500 x g per 45 min a 4 gradi centigradi. Dopo la centrifugazione, e pellet bianco sarà visibile. Rimuovere con attenzione supernatant, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
       NOTA: Tutti i supernatant e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
   15. Rispendere delicatamente il pellet in 1 mL di DMEM integrato con 10% FBS come stock di virus, negozio a -80 gradi centigradi.
2. Generazione di linee cellulari trasfettate stabili
   1. Seme 6 x 10⁶ GCSC in un piatto Petri da 100 mm con DMEM da 10 mL integrato con 10% FBS per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ (70-80% di confluenza prima dell'infezione).
   2. Aspirare il mezzo nel piatto, aggiungere le particelle lentivirali concentrate diluite con 4 mL di mezzo DMEM completo contenente reagente di polibrene (5 g/mL) nel piatto. Incubare per 18 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
      NOTA: La concentrazione ottimale di polibrene dipende dal tipo di cellula e potrebbe essere necessario testare in diverse concentrazioni per decidere le concentrazioni effettive. In caso contrario, può essere determinato empiricamente, di solito nell'intervallo di 2-10 g/mL. Tutti i tubi e le punte devono essere trattati con candeggina del 10% prima dello smaltimento.
   3. Cambiare il mezzo, sostituire con 10 mL di DMEM con 10% FBS medio e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
      NOTA: Tutto il mezzo e le punte devono essere trattati con 10% di candeggina prima dello smaltimento.
   4. Aspirare il supernante con detriti cellulari, sostituire con DMEM fresco integrato con 10% di supporto FBS contenente puramicina (2,5 g/mL) e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂. Sostituire quindi il DMEM fresco integrato con un supporto FBS al 10% contenente puromicina (5 g/mL) e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ per ulteriori 24 h.
   5. Sciacquare due volte i GCSC aderenti con 5 mL di DPBS senza calcio e magnesio.
   6. Dissociare i GCSC con 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare pre-riscaldata e incubare 2-3 min a 37 gradi centigradi.
   7. Aggiungere 5 mL di gcSCs freschi pre-riscaldati media di coltura completa alla sospensione cellulare.
   8. Erogare 3 mL in un tubo centrifugo da 15 mL (tubo A) per crioconservare le cellule, mentre gli altri 3 mL in un tubo centrifugo da 15 mL (tubo B) per indurre la doxycycline.
   9. Tubo centrifugare A e tubo B a 800 x g per 5 min.
   10. Rispendere il pellet del tubo A con 1 mL di mezzo criopreservativo privo di siero, trasferire la fiala a -80 gradi centigradi durante la notte e rimuoverla in un deposito di azoto liquido.
   11. Aspirare il supernante e risundere le cellule del tubo B in 1 mL di nuovi gcSC pre-riscaldati completa media di coltura. Seme un numero appropriato di cellule in un nuovo piatto Petri da 100 mmL di 10 mL GCSC freschi pre-riscaldati completano il mezzo di coltura con doxycycline (Dox) (2,5 g/mL) e incubato per 48 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.
       NOTA: La concentrazione ottimale di Dox può variare tra le linee cellulari. Ogni linea cellulare deve essere testata in diverse concentrazioni di Dox per decidere le concentrazioni effettive per KD e per la tossicità sulle cellule.
   12. Confermare la repressione stabile della clusterina in GCSC da parte del blotting occidentale.

3. Analisi della formazione della sfera

1. Scongelare le linee GCSCs induttivi di knockdown congelate (vedere il punto 1.2).
2. Determinare la densità delle cellule praticabili di un campione di 10 L utilizzando un contatore automatico delle cellule.
3. Regolare il volume con il supporto di coltura completo pre-riscaldato GCSC per ottenere una concentrazione di 2 x 10⁴ celle vitali/mL.
4. Erogare in 3 nuovi pozzi di coltura ultra-basso-attaccamento (0,1 mL/pozzo) ogni gruppo.
5. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% CO₂. La formazione della sfera dovrebbe avvenire entro 3-10 giorni. Monitorare e registrare la visualizzazione della formazione delle cellule ogni 2 giorni.
   NOTA: Il mezzo non è raccomandato per essere cambiato in caso di qualsiasi disturbo della formazione delle cellule tumorali. Queste cellule tumorali devono essere facilmente distinte dalle cellule singole e aggregate.
6. Determinare i risultati della formazione della tumoros facendo valutazione delle dimensioni delle cellule formate utilizzando un software di imaging.

Risultati

Le cellule staminali del cancro gastrico dell'adenocarcinoma gastrico umano primario sono state covate in un mezzo di coltura privo di siero. Dopo 6 giorni, le cellule si sono espanse dal fenotipo a cella singola (Figura 1A) per formare sfere di grandi dimensioni (Figura 1B).

Per valutare la funzione della clusterina nei GCSC, le sequen...

Discussione

La GC è la terza causa di morte legata al cancro in tutto il mondo. I GCSC sono fondamentali nella ricaduta del cancro gastrico, nella metastasi e nella resistenza ai farmaci. L'utilizzo di GCSC da pazienti affetti da cancro gastrico ci permetterà di esplorare il loro punto debole e sviluppare i farmaci di targeting per il trattamento dei pazienti affetti da GC.

Il saggio sulla formazione della sfera è un metodo utile per esaminare il potenziale di auto-rinnovamento delle cellule staminali ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate	Gibco	10569044
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190250
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X	Gibco	41400045
lentiviral vector	GeneChem	GV307
Lenti-X Concentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RB
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, Liquid	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (gag/pol component)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG component)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Cell Dissociation Solution	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverted Microscope	ZEISS	Axio Vert.A1