Induzione della morte cerebrale nei topi utilizzando il monitoraggio della pressione sanguigna intra-arteriosa e la ventilazione tramite tracheostomia

Riepilogo

Presentiamo un modello murino di induzione della morte cerebrale al fine di valutare l'influenza dei suoi effetti patofisiologici sugli organi e su innesti consecutivi nel contesto del trapianto di organi solidi.

Abstract

Mentre sia la donazione vivente che la donazione dopo la morte circolatoria offrono opportunità alternative per il trapianto di organi, la donazione dopo la morte cerebrale del donatore (BD) rappresenta ancora la principale fonte di trapianti solidi. Sfortunatamente, la perdita irreversibile della funzione cerebrale è nota per indurre più cambiamenti patofisiologici, tra cui modifiche emodinamiche e ormonali, portando infine a una risposta infiammatoria sistemica. I modelli che consentono un'indagine sistematica di questi effetti in vivo sono scarsi. Vi presentiamo un modello murino di induzione BD, che potrebbe aiutare le indagini sugli effetti devastanti di BD sulla qualità allotrapianto. Dopo aver implementato la misurazione della pressione sanguigna intra-arteria attraverso l'arteria carotide comune e una ventilazione affidabile tramite una tracheostomia, BD è indotta da un costante aumento della pressione intracranica utilizzando un catetere a palloncino. Quattro ore dopo l'induzione di BD, gli organi possono essere raccolti per l'analisi o per ulteriori procedure di trapianto. La nostra strategia consente un'analisi completa del donatore BD in un modello murino, consentendo quindi una comprensione approfondita degli effetti correlati al BD nel trapianto di organi solidi e potenzialmente apaggendo la strada a un precondizionamento ottimizzato degli organi.

Introduzione

Il trapianto è attualmente l'unico trattamento curativo per l'insufficienza degli organi allo stadio finale. Fino ad ora, i pazienti con morte cerebrale (BD) sono stati la principale fonte di donazioni di organi, anche se la donazione e la donazione viventi dopo la morte circolatoria sono alternative preziose¹. BD è definito da un coma irreversibile (con una causa nota), l'assenza di riflessi del tronco cerebrale e apnea². Sfortunatamente, gli organi BD dimostrano risultati inferiori nella sopravvivenza del trapianto a lungo termine indipendente mente dall'antigene leucocito umano (HLA) -mismatch e freddo ischemico tempo³. Nel frattempo, è stata eseguita un'intensa ricerca su questo fattore di rischio indipendente dall'antigene, portando a tre aspetti principali dei cambiamenti patofisiologici mediati come conseguenza di BD: emodinamica, ormonale e infiammatoria⁴.

Fino ad oggi, i modelli BD sperimentali nei roditori sono stati per lo più eseguiti utilizzando ratti. Al fine di ottenere una maggiore comprensione delle conseguenze immunologiche sugli organi solidi dopo la BD, abbiamo cercato di stabilire un modello murino di BD, poiché attualmente solo i modelli murini consentono indagini complete sui fattori genetici o immunologici. In questo contesto, il sistema del mouse fornisce una maggiore varietà di strumenti analitici.

Il principio di induzione di BD come descritto qui si basa su un aumento della pressione intracranica indotta dall'inflazione di un catetere di palloncino inserito sotto il cranio. L'aumento della pressione intracranica imita il meccanismo fisiologico della BD bloccando la perfusione del cervello, del cervelletto e del tronco cerebrale^5,6. Per garantire una perfusione sufficiente di organi periferici, la misurazione della pressione sanguigna è obbligatoria durante la procedura. Il catetere utilizzato per questo scopo allo stesso tempo serve per la somministrazione salina al fine di stabilizzare la pressione sanguigna con la sostituzione del fluido. Poiché la BD è accompagnata da cessazione della respirazione spontanea, deve essere garantita una ventilazione sufficiente. Una coperta elettrica mantiene la temperatura corporea fisiologica del nucleo.

In sintesi, questo modello consentirà studi approfonditi sull'influenza delle lesioni indotte da BD, sulla migrazione del leucocito^7,sull'attivazione del^{complimento 8}, sulla lesione da reperfusione ischemica⁹e su altri fattori.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i Principi di Laboratorio Animali Formulati dalla National Society for Medical Research e dalla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio preparati dalla National Academy of Science e pubblicati dai National Institutes of Health (La pubblicazione n. 86-23, rivista 1985). Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Ministero austriaco dell'Istruzione, della Scienza e della Cultura (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. Cateterizzazione arteriosa

1. Anestesizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilosina¹⁰ e un analgesico secondo la pratica locale (ad esempio buprenorphine).  Pizzicare gli arti posteriori con pinze per confermare la corretta profondità di anestesia.
   NOTA: Per questo studio, sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6N all'età di 8-12 settimane (peso 20-25 g). Gli autori hanno testato il maschio BALB/c della stessa età senza successo, ma non hanno provato altri ceppi (vedi Discussione).
2. Rimuovere i capelli nelle regioni di interesse (testa, collo) utilizzando un rasoio elettrico. Assicurarsi che non rimangano capelli sciolti per prevenire la contaminazione della ferita. Successivamente disinfettare il campo chirurgico con il 70% di etanolo/clorexidina/ betadine e posizionare la supina del topo con la testa rivolta verso il chirurgo.
3. Fare un'incisione cervicale media con forbici dissecistrici di sedzio.
4. Dissezionare le ghiandole submandibolare e il tessuto muscolare del collo e separarli al fine di esporre l'arteria carotide comune. Utilizzare per lo più dissezione smussata tramite pinze.
5. Mettere tre 8-0 legature di seta sotto l'arteria carotide comune destra.
6. Posizionare un morsetto sulla legatura prossimale e portare tensione nell'arteria in modo che il flusso sia sospeso.
7. Chiudere la legatura più dissina.
8. Inserire il catetere arterioso attraverso un piccolo foro cutaneo preformato sull'aspetto cranico dell'incisione. Spremere e deformare il lume del catetere se appare troppo grande per ridurre il sangue. Fissare con tutte e tre le legature.
9. Fissare il catetere sulla pelle per evitare la lussazione. Fare questo utilizzando una sutura (ad esempio, monofilamento 5-0, non assorbibile) che collega il catetere alla pelle nell'area del foro cutaneo preformato.

2. Tracheostomia

1. Dissezionare la muscolatura pre-tracheale senza mezzi termini usando pinze.
2. Posizionare due 8-0 legature di seta sotto la trachea.
3. Tracheotomizza utilizzando micro forbici il più possibile proximalmente per evitare la ventilazione unilaterale. Utilizzare una linea di taglio orizzontale tra due cartilagini tracheali.
4. Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con entrambe le legature preparate.
   NOTA: l'estremità prossimale della trachea non deve essere ligata.
5. Chiudere la pelle con una sutura in funzione (ad esempio, monofilamento 6-0, non assorbibile).
6. Ventilate il mouse con una frequenza di 150/min e un volume di marea di 200 l.

3. Induzione della morte cerebrale

1. Disporre il mouse nella posizione prona.
2. Rimuovere la pelle dal cranio utilizzando forbici chirurgiche e pinze per tenere la pelle.
3. Forare un foro di trivellazione calibro 1 mm paradisiaca sopra la corteccia parietale sinistra. Interrompere la perforazione prima di rompere l'osso compatto interno e la dura mater.
4. Penetrare il ponte intessuto finale del cranio con pinze smussate, rimuovendo i bordi taglienti.
5. Inserire il catetere a palloncino, in modo che sia interamente all'interno della cavità cranica. Assicurarsi che il palloncino sia precompilato con salina e che tutta l'aria sia evacuata.
6. Iniziate l'inflazione a 0,1 mL/min per un periodo di 10,15 min (volume totale di 0,8,1,2 mL) con l'aiuto di una pompa di siringa.
   NOTA: Il topo esporrà mioclonus, midriasi, ulteriore attività di sequestro e rantoli agonali.
7. Pronunciare il cervello topo morto una volta che la coda del topo è andato rigido ed eretto.
   NOTA: Il BD è confermato da un caratteristico picco iniziale di pressione sanguigna (riflesso di Cushing), l'assenza di riflessi del tronco cerebrale e respirazione spontanea. I test regolari dell'apnea dovrebbero essere evitati durante gli esperimenti, poiché i topi possono diventare instabili circolatori a causa della mancanza di ossigeno.
8. Fermare l'inflazione del catetere del palloncino.
9. Mettere una coperta di riscaldamento sul mouse per evitare l'ipotermia.

4. Durante il periodo BD

1. Monitorare e documentare regolarmente la pressione sanguigna. Escludere i topi con una fase ipotensiva prolungata (pressione arteriosa media [MAP] < 50 mmHg per >30 min).
2. Infondere 0,1 mL di salina ogni 30 min per stabilizzare la pressione sanguigna del topo.
   NOTA: In totale è stato somministrato 0,8 mL di salina a ciascun topo in questo studio.
3. Dopo 4 h di durata BD, raccogliere organi/tessuti per topi. Escludere il mouse dall'esperimento se il cuore del mouse non batte alla fine dell'esperimento.

5. Procedura Sham

1. Eseguire i passaggi 1.1/3.3.
   NOTA: Non aprire l'osso compatto interno. Non inserire o gonfiare un catetere a palloncino.
2. Stare vicino al mouse e osservare continuamente l'animale. Pizzicare ripetutamente gli arti posteriori con pinze per confermare la corretta profondità di anestesia. Applicare l'anestesia aggiuntiva sottocutaneamente (circa 1/2 della dose iniziale) se il topo mostra segni di risveglio, che, per nostra esperienza, avviene approssimativamente dopo 2/3 h dopo l'anestesia.
3. Applicare la stessa quantità di salina per via endovenosa dei topi BD.
   NOTA: Il topo farsi riacquisterà la respirazione spontanea dopo la cessazione della ventilazione. Il mouse BD non lo farà. Il test dell'apnea dovrebbe essere fatto mentre si stabilisce il modello, ma durante gli esperimenti dovrebbe essere evitato a causa di inutili stress fisiologico.

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Risultati

Il modello murine BD è stato eseguito con successo più di 100 volte con un tasso di successo di oltre il 90%. Inoltre, il trapianto di organi post intervento di cuore e rene è stato eseguito in modo sicuro⁷.

BD induce una varietà di cambiamenti patofisiologici che possono essere ulteriormente studiati utilizzando questo modello. Come mostrato nella Figura 1,la pressione s...

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Discussione

Il BD, un fattore di rischio per la qualità dell'allotrapianto nei donatori multiorgano, comporta una pletora di cambiamenti patofisiologici, che possono essere valutati solo in modo sufficiente utilizzando modelli in vivo. I cambiamenti emodinamici, la tempesta di citochine, i cambiamenti ormonali e il loro impatto finale sulla qualità e sulla sopravvivenza dell'innesto degli organi non possono essere analizzati in vitro⁴. La maggior parte dei trapianti di base e della ricerca immunologica dipe...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G)	BD	391349
Blood Pressure Transducers (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Forceps	FST	11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Needle holder	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Stereotactic microscope	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109