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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.

Abstract

Le trappole extracellulari neutrophil (NET), composte da DNA privo di cellule (cfDNA) e proteine come gli istoni e l'elastasi dei neutrofili (NE), vengono rilasciate dai neutrofili in risposta all'infiammazione sistemica o agli agenti patogeni. Anche se in precedenza i NET hanno dimostrato di aumentare la formazione di coaguli e inibire la fibrinolisi negli esseri umani e nei cani, il ruolo dei NET nei gatti con tromboembolismo arterioso cardiogenico (CATE), una complicazione pericolosa per la vita secondaria alla cardiomiopatia ipertrofica , non è noto. Un metodo standardizzato per identificare e quantificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici nei gatti farà progredire la nostra comprensione del loro ruolo patologico in CATE. Qui, descriviamo una tecnica per identificare i NET nei trombi di formaldeide-fissi e di paraffina-embedded all'interno della biforcazione aortica, estratta durante la necropsia. Dopo la deparaffinazione con lo xilene, le sezioni aortiche sono sottoposte al recupero indiretto dell'antigene indotto dal calore. Le sezioni sono state poi bloccate, permeabilizzate e i NET ex vivo sono stati identificati mediante la co-localizzazione del DNA privo di cellule (cfDNA), il citrullinato l'istone H3 (citH3) e l'elastasi neutrofila (NE) usando la microscopia immunofluoresce. Per ottimizzare l'immunorilevamento dei NET nei trombi, l'autofluorescenza degli elementi tissutali è stata limitata utilizzando un processo di spegnimento dell'autofluorescenza prima della microscopia. Questa tecnica potrebbe essere uno strumento utile per studiare NET e trombosi in altre specie e offre nuove intuizioni sulla fisiopatologia di questa complessa condizione.

Introduzione

I gatti con cardiomiopatia ipertrofica sono a rischio di complicazioni tromboemboliche pericolose per la vita1,2. Nonostante l'elevata morbilità e mortalità associata al trombboembolismo arterioso cardiogenico felino (CATE), la fisiopatologia sottostante di CATE nei gatti è poco compresa. Ci sono anche strumenti diagnostici e terapeutici limitati per trattare e identificare i gatti a rischio di questa condizione devastante3.

Oltre al suo ruolo nell'immunità innata, i neutrofili hanno dimostrato di svolgere un ruolo nella trombosi rilasciando trappole extracellulari neutrofiche (NET), che sono reti simili a reti di DNA privo di cellule (cfDNA) incrostate di istoni e proteine granulari come elastasi neutrofili (NE) e mieloperossia. Neutrofili sottoposti formazione NETs in risposta all'infiammazione sistemica, incontro diretto con gli agenti patogeni, e l'interazione con piastrine attivate4,5,6,7. Nei cani, il DNA derivato dal neutrofia ha dimostrato di inibire la lisi del coagulo, mentre le proteine NET accelerano la formazione di coaguli. La capacità dei NET di intrappolare le cellule circolanti e i componenti di coagulazione è anche fondamentale per le loro proprietà trombogene8,9,10,11,12.

I NET sono rilevati dalla co-localizzazione di proteine neutrofili extracellulari, istoni e cfDNA. Per questo motivo, l'identificazione e la quantificazione di NET nei tessuti fissi mediante immunofluorescenza dei tessuti deparaffinati è superiore alla tradizionale ematossia (H&E) macchia utilizzando la microscopia a campo luminoso4,5. Diversi studi umani che utilizzano la microscopia immunofluorescenza hanno identificato i NET come componenti strutturali dei trombi coronarici, dei trombi dell'ictus cerebrale, dell'atrombromosi e dei trombi venosi13,14,15,16,17. Ad oggi, non è stato descritto un metodo standardizzato per rilevare e quantificare i NET nei trombi felini. Poiché l'identificazione dei NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini può facilitare la futura ricerca traslazionale in NET e trombosi, descriviamo tecniche di identificazione e valutazione della rete nei trombi arteriosi incorporati nella paraffina nei gatti.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della California, Davis. Necropsie e biopsie dei tessuti sono state eseguite con il consenso dei proprietari.

1. Fissaggio, incorporamento e sezionamento dei tessuti

  1. Dissezionare la biforcazione aortica, tra cui l'aorta discendente, l'arteria femorale e le arterie iliache comuni(Figura 1A), poco dopo l'eutanasia umana o la morte. Blunt sezionare la fascia (Figura 1B) prima di immergerla completamente in formalina 10% neutro-bufferper un minimo di 24 h e non più di 48 h.
  2. Per disidratare il campione, immergere prima in formalina al 10% neutra mente riscaldata a 37 gradi centigradi per 1 h. Quindi, immergersi in concentrazioni crescenti di etanolo riscaldato a 37 gradi centigradi (70%, 95%, 100%) 2x per 1 h ciascuno. Infine, senza risciacquare, sommergere 2x nel 100% di toluene riscaldato a 37 gradi centigradi per 1 h ciascuno.
  3. Aggiungere la paraffina riscaldata a 62 gradi centigradi e lasciare che la paraffina si solidifichi completamente durante la notte.
  4. Sezione 2-3 del tessuto incorporato in paraffina utilizzando un microtoma e collocata su vetrini di vetro caricati positivamente. Conservare i tessuti sezionati a -80 gradi centigradi fino a ulteriori analisi.

2. Deparaffinazione, reidratazione e recupero di antigeni indotti dal calore

  1. Per eseguire la deparaffinazione e la reidratazione delle sezioni su vetrini, posizionare i vetrini in rack ed elaborare nel seguente ordine:
    1. Immergere completamente in 100% xilene per 3 min. Ripetere questo passaggio 2x. Non risciacquare tra i passaggi.
    2. Immergere completamente in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 95%, 70%) temperatura ambiente (RT), 3x per 3 min ciascuno. Non risciacquare tra i passaggi.
    3. Immergere completamente in acqua deionizzata per 2 min. Ripetete.
  2. Inserire le sezioni nella salina con una salina da 0,1% (TBST, pH - 7,6) per 2-3 min.
  3. Riempire il serbatoio con acqua deionizzata riscaldata a 100 gradi centigradi. Lasciare che la camera a vapore equilimi per 20 min.
    NOTA: il recupero dell'antigene indotto dal calore viene eseguito al meglio con il riscaldamento indiretto generato da un piroscafo con un'impostazione di temperatura preimpostata, ad esempio un piroscafo alimentare.
  4. Riscaldare la soluzione di recupero dell'antigene disponibile in commercio che contiene Tris ed EDTA (pH n. 9) a 95-97 gradi centigradi su una piastra calda a temperatura controllata con agitazione costante. Assicurarsi che non ebollizione.
    NOTA: La soluzione dovrebbe diventare torbida una volta riscaldata.
  5. Versare la soluzione di recupero dell'antigene riscaldato in un contenitore di slitta e posizionare il contenitore nella camera del piroscafo. Lasciare che la soluzione di recupero dell'antigene equilichi alla temperatura del piroscafo per 3-4 min. Assicurarsi che la temperatura della camera sia di 95 gradi centigradi.
  6. Immergere completamente i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene riscaldato e continuare l'applicazione del riscaldamento esterno tramite il piroscafo per 20 min.
  7. Togliere il contenitore scorrevole dal piroscafo e lasciare raffreddare i vetrini e la soluzione di recupero dell'antigene in RT. Memorizzare la soluzione di recupero dell'antigene diluito a 4 gradi centigradi e riutilizzare fino a 2x se necessario.
  8. Lavare i vetrini 3x con TBST per 5 min.

3. Immunolabeling e spegnimento autofluorescenza

NOTA: la tabella 1 descrive in dettaglio la composizione dei buffer di blocco utilizzati nei passaggi seguenti.

  1. Incubare le sezioni in Blocking Buffer 1 per 2 h a RT a dondolo delicato (30-50 rpm). Sigillare con pellicola di paraffina per evitare l'essiccazione.
  2. Senza lavaggio, applicare immediatamente 100 l of diluito coniglio policlonale anti-umano citrullied istone H3 (citH3) anticorpo (0,03 mg/mL diluito nel buffer di blocco 1) direttamente sul vetrino.
  3. Posizionare un coperchio (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) su ciascuna sezione per consentire una distribuzione uniforme della miscela di anticorpi.
  4. Incubare per 12-16 h a 4 gradi centigradi con dondolo delicato (30-50 giri/min). Sigillare con pellicola parafilm per evitare l'essiccazione.
  5. Lavare 3x con TBST per 5 min.
  6. Applicare 100 l di anticorpi anti-coniglio di capra coniugati ad Alexa Fluor 488 (diluito a una concentrazione finale di 0,04 mg/mL o 1:50 in Buffer di blocco 1) come descritto al punto 3.3. Incubare per 1 h a RT sotto dondolo delicato (30-50 rpm). Proteggere i vetrini dalla luce.
  7. Lavare con TBST 3x per 5 min.
  8. Incubare le sezioni in Blocking Buffer 2 durante la notte a 4 gradi centigradi sotto dondolo delicato (30-50 giri/min). Proteggere dalla luce.
  9. Lavare con TBST 3x per 5 min.
  10. Sezioni di blocco in Blocco buffer 3 come descritto nel passaggio 3.3 a RT per 2 h sotto dolce dondolo (30-50 rpm).
  11. Sezioni di incubatura con anticorpo NE del coniglio policlonale biotinylato (concentrazione finale : 0,2 g/mL nel buffer di blocco 3) a 4 gradi centigradi per 12–16 h come descritto nei passaggi da 3.2 a 3.4.
  12. Lavare con TBST 3x per 5 min.
  13. Incubare con Alexa Fluor 594 coniugato streptavidin (diluire a 1:100 o 0,02 mg/mL in Blocking Buffer 3) come descritto nei passaggi da 3,2 a 3,3 per 1 h a RT. Proteggere dalla luce e sigillare con paraffina per evitare l'essiccazione.
  14. Lavare con TBST 1x per 5 min.
  15. Applicare 100 l'l di miscela di soluzione di spegnimento dell'autofluorescenza direttamente sulle sezioni per 1 min come indicato dal produttore.
  16. Lavare immediatamente i vetrini con TBST 6x per 10 min.
  17. Coprire ogni vetrino con 100 gradi l- 300 nM DAPI per 5 min al buio.
  18. Lavare con TBST per 3 min. Ripetere questo per un totale di 5x.
  19. Applicare una goccia (50 dollari) di supporto di montaggio antifade, parte del kit di spegnimento autofluorescenza, direttamente sullo scivolo di vetro che circonda la sezione. Posizionare delicatamente una vestra (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) sulla sezione senza creare bolle.
  20. Lasciare che i campioni si guariscano durante la notte al buio a 4 gradi centigradi fino a quando il supporto di montaggio non si è indurito per l'analisi microscopica con lenti ad immersione.

4. Identificazione trappola extracellulare Neutrophil

NOTA: Il protocollo seguente utilizza un microscopio a epifluorescenza invertito con una telecamera CCD digitale 1.280 x 960 (vedere Tabella dei materiali).

  1. Per individuare i trombi, scansionare cranicamente lungo la lunghezza dell'aorta, la biforcazione aortica e ogni arteria femorale utilizzando la microscopia a contrasto di fase con un obiettivo 10x. Un trombo è un conglomerato di tessuto contenente globuli rossi, globuli bianchi e piastrine adiacenti all'endotelio sul contrasto di fase e microscopia del campo luminoso (Figura 2A, Figura 2B).
  2. Esaminare innanzitutto le sezioni per i NET utilizzando il canale DAPI (eccitazione 357/44 nm) con obiettivi 10x e 20x (Figura 2C). Si noti che il cfDNA appare come DNA decondensato che non è all'interno dei confini del citoplasma di una cellula quando visto sul contrasto di fase o microscopia campo luminoso.
  3. Identificare extracellular NE e citH3 sui canali Texas Red (eccitazione - 585/29 nm, emissione di 628/32 nm) e il canale proteico fluorescente verde (eccitazione : 470/22 nm, emissione - 525/50 nm), rispettivamente con obiettivi 10, 20 e 40x.
  4. Valutare e analizzare i FORMATI di rete all'interno di un trombo utilizzando il software disponibile, ad esempio Image J (NIH). La formazione della rete è identificata in base alla co-localizzazione di cfDNA, extracellular citH3 e NE come descritto in precedenza18. Mantenere un tempo di esposizione coerente e guadagni di ogni canale durante l'acquisizione di immagini per evitare la saturazione in intensità di pixel.
  5. Mappare ogni trombo in base alla sua vicinanza all'aorta discendente dividendolo in tre zone uguali, con la zona 1 più vicina all'aorta, la zona 3 più lontana dall'aorta e la zona 2 tra le zone 1 e 3). Con l'operatore accecato alle condizioni mediche di ogni soggetto, prendere almeno dieci campi casuali in ogni zona. Caratterizzare la distribuzione di NET nei trombi calcolando la media del numero di campi con NET in ogni zona o calcolando l'area media che occupa la rete per zona.

Risultati

Utilizzando questo protocollo per la deparaffinizzazione, il recupero di antigeni indotti dal calore e la doppia immunoetichettatura dei trombi incorporati nella paraffina, abbiamo identificato per la prima volta i NET in felino CATE. I trombi all'interno della biforcazione aortica sono stati localizzati mediante microscopia a fluorescenza e microscopia a campo luminoso utilizzando la colorazione H&E standard e la microscopia a contrasto di fase. Sulla microscopia a campo luminoso, i trombi arteriosi felini consistevano ...

Discussione

Descriviamo un protocollo per identificare i NET nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi utilizzando un protocollo di doppia immunoetichettatura e la microscopia immunofluorescenza. Anche se solo i trombi arteriosi cardiogenici sono stati macchiati, in teoria questo protocollo potrebbe essere utilizzato per altri tipi di trombi e in altre specie veterinarie. L'identificazione di NET all'interno del trombbi arterioso felino suggerisce che i NET possono svolgere un ruolo nella trombosi nei gatti.

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Lo studio è stato sostenuto da fondi dell'Università della California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Gli autori vorrebbero riconoscere il Dr. Kevin Woolard per l'uso del microscopio a fluorescenza.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugateThermoFisher ScientificCatalog # S11227
Anti-citrullinated histone H3 antibodyAbcamAb5103
EVOS FL Cell Imaging SystemThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging System Objective 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm
EVOS Imaging System Objective 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0.40, WD 6.8 mm
EVOS Imaging System Objective 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0.75, WD 0.72 mm
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisher ScientificCatalog # A32723
Goat serumJackson Immuno Research LabsCatalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121
Neutrophil elastase antibodyBioss AntibodiesBs-6982R-BiotinRabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated
NP40PierceProduct # 28324. Lot # EJ64292
Positive charged microscope slidesThomas ScientificManufacturer No. 1354W-72
Rabbit serumLife TechnologyCatalog # 10510
Target Retrieval SolutionAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluorescence Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400

Riferimenti

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