Creazione in Situ Circuito Chiuso Perfusione di Organi Addominali Inferiori e Arti Hind in Topi

Riepilogo

Un protocollo è descritto per la perfusione in situ del corpo inferiore del topo, tra cui la vescica, la prostata, gli organi sessuali, l'osso, il muscolo e la pelle del piede.

Abstract

La perfusione ex vivo è un importante strumento fisiologico per studiare la funzione degli organi isolati (ad es. fegato, reni). Allo stesso tempo, a causa delle piccole dimensioni degli organi di topo, la perfusione ex vivo di ossa, vescica, pelle, prostata e organi riproduttivi è impegnativa o non fattibile. Qui, riportiamo per la prima volta un circuito di perfusione in situ inferiore del corpo nei topi che include i tessuti di cui sopra, ma bypassa i principali organi di clearance (rene, fegato e milza). Il circuito è stabilito cannulando l'aorta addominale e vena cava inferiore sopra l'arteria iliac e la vena e cauterizzare i vasi sanguigni periferici. La perfusione viene eseguita tramite una pompa peritale con flusso di perfnone mantenuto fino a 2 h. La colorazione in situ con lectina fluorescente e la soluzione Hoechst hanno confermato che la microvaslatura è stata perfusa con successo. Questo modello murino può essere uno strumento molto utile per studiare i processi patologici, nonché i meccanismi di somministrazione di farmaci, la migrazione/metastasi delle cellule tumorali circolanti in/dal tumore e le interazioni del sistema immunitario con organi e tessuti perfusi.

Introduzione

La perfusione di organi isolati è stata originariamente sviluppata per studiare la fisiologia degli organi per il trapianto^1,2,3e ha permesso di comprendere le funzioni degli organi senza interferenze da altri sistemi corporei. Ad esempio, la perfusione isolata di reni e cardiaci è stata immensamente utile per comprendere i principi di base dell'emodinamica e degli effetti degli agenti vasoattivi, mentre la perfusione epatica era importante per comprendere la funzione metabolica, compreso il metabolismo dei farmaci nel tessuto sano e malato^4,5,6,7. Inoltre, gli studi di perfusione sono stati fondamentali per comprendere la vitalità e la funzione degli organi destinati al trapianto. In Cancer Researchearch, la perfusione tumorale isolata è stata descritta da diversi gruppi utilizzando topo, ratto e tessuti umani appena resezionati^8,9. In qualche perfusione tumorale isolato, il tumore è stato impiantato nel tampone di grasso ovarico per forzare la crescita del tumore che fornisce vasi sanguigni dall'arteria mesenteria¹⁰. Il gruppo giainista ha eseguito studi pionieristici utilizzando perfusione isolata di adenocarcinomi del colon per comprendere l'emodinamica tumorale^8,11,12,13. Altre innovative configurazioni ex vivo ingegnerizzate includono un dispositivo di perfusione a base di piastra 96 per colture le cellule primarie del mieloma multiplo umano¹⁴ e una camera di flusso modulare per l'architettura del midollo osseo e la ricerca sulle funzioni¹⁵.

Oltre agli studi di fisiologia e patologia, la perfusione di organi è stata utilizzata per studiare i principi di base della somministrazione di farmaci. Così, un gruppo ha descritto la perfusione isolata degli arti di ratto e ha studiato l'accumulo di liposomi nei sarcomi impiantati¹⁶, mentre un altro gruppo ha eseguito la perfusione renale umana per studiare il targeting endoteliale delle nanoparticelle¹⁷. Ternullo et al. utilizzato un lembo della pelle umana perfuso isolato come un modello di penetrazione dei farmaci per la pelle vicino a in vivo¹⁸.

Nonostante questi progressi nella perfusione di grandi organi e tessuti, non ci sono state segnalazioni su modelli di perfusione in situ nei topi che: a) bypassare organi di gioco come fegato, milza e reni; b) includere organi pelvici, pelle, muscoli, organi riproduttivi (nel maschio), vescica, prostata e midollo osseo. A causa delle piccole dimensioni di questi organi e della vascolatura di fornitura, la cannulazione ex vivo e la creazione di un circuito di perfusione non è stato fattibile. Il topo è il modello animale più importante nella ricerca sul cancro e sull'immunologia e nella somministrazione di farmaci. La capacità di perfusire piccoli organi di topi consentirebbe di rispondere a interessanti domande riguardanti la somministrazione di farmaci a questi organi, compresi i tumori impiantati nel bacino (vescica, prostata, ovaia, midollo osseo), nonché studi sulla fisiologia di base e l'immunologia delle malattie di questi organi. Per affrontare questa carenza, abbiamo sviluppato un circuito di perfusione in situ nei topi che può potenzialmente evitare lesioni tissutali ed è molto più adatto per la ricerca funzionale rispetto alla perfusione di organi isolati.

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Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado.

1. Preriscaldare il sistema di perfusione

1. Preparare il sistema di perfusione prima dell'intervento chirurgico avviando un bagno d'acqua circolante di 37 gradi centigradi per tutti i componenti con rivestimenti ad acqua (serbatoio perfusati, camera umida e coperchio) come mostrato in una configurazione personalizzata nella Figura 1A. Assicurarsi che il tubo sia pulito e sostituire se necessario. Per limitare il volume del perfusate, utilizzare una trappola a bolle all'interno di una camera umida come serbatoio di perfusate (Figura 1B-6).

2. Cateterizzazione vascolare

1. Indurre l'anestesia in un topo BALB/c di 8-10 settimane utilizzando una macchina di anestesia veterinaria isoflurana con 3-5% di isoflurane e portata di ossigeno a 0,3 L/min. In alternativa, utilizzare chetamina/xylazina o qualsiasi altro tipo di anestesia intraperitoneale. Valutare la profondità dell'anestesia con 2 metodi: dita dei pelli e riflesso corneale.
2. Preparare una sutura di seta 4-0 con ago in acqua a doppia distillazione.
3. Posizionare il topo anestetico in una posizione supina su una scheda di polistirolo con la testa rivolta al chirurgo e immobilizzare gli arti anteriori e gli arti posteriori con del nastro adesivo. Pulire l'addome con l'alcol isopropile e tagliare l'addome lungo la linea mediana a forma di "T" con le forbici. Interrompere il sanguinamento intorno al bordo dell'incisione mediante elettrocoagulazione (cauterizzazione).
4. Spingere lo stomaco, il jejunum e il colon sul lato destro dell'addome per rivelare l'aorta addominale, vena cava e le arterie e le vene iliache e iliolumbar comuni.
5. Sotto un microscopio di dissezione, trovare e ligare l'arteria/vena iliolumbar nel maschio, e l'arteria/vena ovarica e l'arteria/vena iliospano nella femmina utilizzando suture di seta 4-0(Figura 2 linee gialle).
6. Sotto un microscopio di dissezione, loop due suture di seta 4-0 sotto l'aorta addominale e vena cava inferiore (circa 1 cm sopra l'arteria iliac e la vena, 1 mm di distanza, Figura 2), e fare un nodo sciolto nella sutura più vicina ai vasi iliaci (Figura 2, linea tratteggiata bianca). In alternativa, per questo nodo è possibile utilizzare una sutura di seta 6-0.
7. Al microscopio di dissezione, allineare e allungare orizzontalmente sia la vena cava inferiore che l'aorta addominale con porte-aiguille. Utilizzare un catetere I.V. schermato alato da 24 G per forare l'aorta addominale, premere il pulsante per ritrarre il nucleo dell'ago e inserire il catetere di circa 5 mm nella nave.
   1. Ripetere la stessa procedura con la vena cava inferiore e legare i nodi di entrambe le suture intorno ai vasi cateterizzati.
      NOTA: L'ago può facilmente forare attraverso il vaso sanguigno; quindi, mantenere i vasi allungati e l'ago parallelamente al vaso. Ritirare il nucleo dell'ago non appena l'ago penetra circa 1 mm nel vaso. L'aorta addominale è sotto la vena cava inferiore e molto più sottile e più elastica a causa di essere racchiuso nel tessuto connettivo. Pertanto, l'aorta può "tenere" al catetere, e deve quindi essere cateterizzata prima della vena cava per ridurre la probabilità che il catetere scivoli fuori.
8. Applicare la colla istantanea per immobilizzare i cateteri alle spina erettore, sostituire gli organi addominali e terminare l'intervento chirurgico mantenendo l'anestesia.
   NOTA: Gli organi che non possono essere completamente sostituiti nella cavità addominale dovranno essere periodicamente inumiditi con mezzo di perfusione durante il processo di perfusione.

3. Impostare il sistema di perfusione

1. Trasferire il mouse nella camera umida con giacca d'acqua preriscaldata a 37 gradi su un cuscinetto di silicio e immobilizzare le ali del catetere sul pad con 19 G aghi.
2. Riempire l'estremità del catetere arterioso (inserizione) con un buffer di perfusione preriscaldato (soluzione di lattato di Ringer integrata con 5% BSA), quindi collegare l'estremità del catetere con il tubo di perfusione insematola utilizzando un connettore a vite(Figura 1B, freccia rossa).
   NOTA: Tenere il connettore con pinze emostatiche e immobilizzare il tubo con nastro adesivo per evitare di spostare i cateteri.
3. Regolare la portata peristale a 0,6 mL/min e mantenere aperto il deflusso di perfusione(Figura 1B, freccia blu) aperto per 5-10 min per lavare il sangue attraverso il catetere venoso. Ci saranno alcuni coaguli nel catetere di uscita; svuotare i coaguli con buffer perfusate prima di chiudere il circuito di perfusione.
4. Collegare l'estremità del catetere venoso con il tubo di uscita utilizzando un connettore a vite per chiudere il circuito (Figura 1B). A questo punto, eseguire l'eutanasia gas₂ CO e verificare con la puntura toracica o qualsiasi altro metodo.
5. Coprire la camera umida con il coperchio riscaldato. Controllare periodicamente il livello di perfusate e aggiungerne altri, se necessario. La perfusione può essere eseguita per un massimo di 2 ore.
   NOTA: saranno necessari 5 mL di perfusate per impostare il sistema di perfusione chiuso. Se non ci sono perdite o edema, il volume di perfusate diminuirà di meno di 1 mL e non sarà necessario buffer aggiuntivo. Per evitare l'edema indotto dal trombo circolante periferico, il tampone di perfusione contenente 0,002% di eparina può essere utilizzato nei primi 10 minuti di perfusione, ma deve essere modificato per tamponare senza eparina per evitare perdite sul bordo delle incisioni.
6. Se necessario, aggiungere un reagente di scelta nel serbatoio di perfusione o alla porta di iniezione in qualsiasi momento (Figura 1B-5). Ad esempio, è possibile aggiungere 10 L di 10 mg/mL di Hoechst33342 nel perfusate per macchiare i nuclei cellulari 2 h prima della fine della perfusione, o 50 L di 1 mg/mL DyLight 649-lectin per macchiare le cellule endoteliali vascolari 30 min prima della fine della perfusione.
   NOTA: Se si tenta di macchiare il midollo osseo con la soluzione Hoechst, i topi dovranno essere pre-iniettati 30 minuti prima dell'intervento chirurgico.
7. Dopo la perfusione con reagenti fluorescenti, lavare con buffer perfusione per altri 10 minuti per ridurre al minimo la fluorescenza di fondo.

4. Analisi degli organi perfusi

1. Raccogliere organi tra cui testicoli, prostata, vescica, femore, muscoli e pelle (ad esempio, piedi). Accisa un pezzo d'organo di circa 1 mm³ e appiattisci tra due vetrini di vetro.
   1. Studio condotto al microscopio confocale fluorescente invertito utilizzando filtri di eccitazione ed emissione DAPI/Cy5 (laser di eccitazione : DAPI, 405 nm; Cy5.640 nm). Utilizzare almeno 200x obiettivo di ingrandimento con un'apertura numerica 0.45.
   2. In alternativa, fissare gli organi con 4% soluzione di formaldeide per 24 h ed eseguire la colorazione ematossilina-eosin^{a 19}.
2. Per creare una finestra ossea per l'osservazione intatta del midollo osseo, immobilizzare entrambe le estremità del femore o della tibia e raschiare via l'osso corticale con il bordo laterale di un ago da 19 G per esporre il periosteo; fare attenzione a mantenere un sottile strato di osso residuo. Posizionare l'osso su uno slittamento di copertura con la finestra di fronte al vetro e l'immagine con microscopio confocale fluorescente invertito utilizzando i canali DAPI e Cy5 come descritto sopra. Le cellule e la rete vascolare nella cavità del midollo osseo possono essere facilmente osservate.

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Risultati

Abbiamo creato un sistema di perfusione a circuito chiuso attraverso la canonazione dell'aorta addominale e la vena cava inferiore di 8-10 settimane di topi anziani, mantenendo il volume di buffer perfusione inferiore a 10 mL. La figura 3A mostra le immagini confocali dopo aver perfuso i tessuti con la soluzione di Ringer contenente Hoechst 33342 e DyLight 649-lectin. Muscolo, midollo osseo, testicoli, vescica, prostata, e la pelle del piede mostrano efficiente colorazione nucleare e vascola...

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Discussione

Il circuito descritto può essere utilizzato per sondare varie domande di ricerca, ad esempio il ruolo di diversi componenti del siero e barriere tissutali nella somministrazione di farmaci o nel traffico di cellule immunitarie e staminali. Diversi sistemi di somministrazione di farmaci (ad esempio, liposomi e nanoparticelle) possono essere aggiunti al perfusate per comprendere il ruolo dei fattori fisiologici e biochimici nella consegna. La durata della perfusione può variare, a seconda del tessuto studiato, degli obie...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light	Amscope	SKU: SM-3BZ-80S
Carbon dioxide, USP	Airgas healthcare	19087-5283
Confocal microscope	NIKON	ECLIPSE Ti2
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp	FIAB	F7244
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733692	Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1)	Harvard Apparatus	733524	keep the chamber's temperature
Moist chamber with metal tube heat exchanger	Harvard Apparatus	732901	Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters	Fine Science Tools (FST)	125014
Oxygen compressed, USP	Airgas healthcare	C2649150AE06
Roller pump (part 4 in Figure 1)	Harvard Apparatus	730113	deliver perfusate to cannula in the moist chamber
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1)	Harvard Apparatus	732806	control the purfusion speed
Silicone pad	Harvard Apparatus
Silicone tubing set (arrows in Figure 1)	Harvard Apparatus (TYGON)	733456
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools (FST)	91100-12
Surgical Scissors	Fine Science Tools (FST)	14001-14
Table for moist chamber	Harvard Apparatus	734198
Thermocirculator (part 2 in Figure 1)	Harvard Apparatus	724927	circulating water bath for all water-jacketed components
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1)	Cole-Palmer	30600-02
Veterinary anesthesia machine	Highland	HME109
Materials
19-G BD PrecisionGlide needle	BD	305186	For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone
4-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427411
6-0 silk sutures	Keebomed-Hopemedical	427401
Filter (0.2 µm)	ThermoFisher	42225-CA	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Permanent marker	Staedtler	342-9
Syringe (10 mL)	Fisher Scientific	14-823-2E
Syringe (60 mL)	BD	309653	Filter for 5% BSA-RINGER’S
Reagents
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5)	Sigma	314-13-6
10% buffered formalin	velleyvet	36692
BALB/c mice ( 8-10 weeks old )	Charles River
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution	EMRN Medical Supplies Inc.	JB2324
Bovine serum albumin	Thermo Fisher	11021-037
Cyanoacrylate glue	Krazy Glue
DyLight-649-lectin	Vector Laboratories,Inc.	ZB1214
Ethanol (70% (vol/vol))	Pharmco	111000190
Hoechst33342	Life Technologies	H3570
Isoflurane	Piramal Enterprises Limited	66794-017-25
Phosphate buffered saline	Gibco	10010023