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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descritto qui è un metodo per la delezione genica mirata e senza marcatori nella chlamydia trachomatis utilizzando la mutagenesi di scambio letale delle cassette scambiate, FLAEM.

Abstract

La chlamydia trachomatis è un patogeno intracellulare obbligatorio che è stato storicamente difficile da manipolare geneticamente. Il progresso definitivo nel chiarire i meccanismi che C. trachomatis utilizza per creare e mantenere una nicchia intracellulare privilegiata è stato limitato a causa della mancanza di strumenti genetici. Fortunatamente, di recente ci sono stati diversi nuovi progressi nelle tecniche di manipolazione genetica. Tra questi vi è lo sviluppo della mutagenesi dello scambio allelico segnalato dalla fluorescenza (FRAEM). Questo metodo consente la delezione mirata del gene accoppiato con l'inserimento di una cassetta di selezione codifica resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP). La dipendenza da questa strategia può essere complicata quando si prendono di mira i geni all'interno di operoni polcistronici a causa del potenziale di effetti polari sui geni a valle. La mutagenesi allelica dello scambio di cassette flosche (FLAEM), il cui protocollo è descritto qui, è stato sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti da cassette. FLAEM utilizza l'editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione dopo la cancellazione mirata per scambio allelico. I ceppi risultanti contengono delezioni geniche senza marcatori di una o più sequenze di codifica. Questa tecnica facilita la valutazione diretta della funzione genica ed espande il repertorio di strumenti per la manipolazione genetica in C. tracommata.

Introduzione

La clamidia transamata è la principale causa di malattie batteriche sessualmente trasmissibili e rappresenta un onere significativo per la salute umana. Oltre 100 milioni di persone sono infettate ogni anno da C. trachomatis1. Circa il 70% delle infezioni nelle donne sono asintomatiche nonostante gli effetti dannosi sulla salute riproduttiva, come la malattia infiammatoria pelvica, la gravidanza ectopica e/o l'infertilità. Il sequela della malattia è direttamente correlato all'immunopatologia iniziata da C. infezione da tracommatide 2. Un vaccino efficace deve ancora essere sviluppato; pertanto, comprendere la funzione dei fattori di virulenza batterica e di altri prodotti genici batterici è una questione di ricerca importante e urgente.

Come batteri intracellulari, l'invasione delle cellule ospiti, la replicazione intracellulare, il rilascio di progenie e l'evasione delle risposte immunologiche ospiti sono processi critici. C. tracommatide forma una membrana parassofosa legata vacuole, chiamato inclusione, per lo sviluppo intracellulare. L'istituzione dell'inclusione e di molti altri processi critici si ottiene mediante la secrezione di proteine efsiate tramite un sistema di secrezione di tipo III (T3SS)3. Chiarire le funzioni di questi efficaci secreti è stato limitato per molti anni a causa dell'intrattabilità genetica di C. tracomatis. A differenza di E. coli, molte tecniche di clonazione classiche non sono applicabili alla clamidia. Alcune limitazioni principali riguardano l'efficienza della trasformazione, la mancanza di controselezione dei reporter come sacB e la manutenzione del plasmide. Mentre i plasmidi E. coli possono generalmente essere mantenuti a tempo indeterminato con un'origine di replicazione e di adeguata pressione selettiva, C. trachomatis plasmis richiede altri otto frame di lettura aperti (pgp1-8) per la manutenzione che si trovano sul plasmide nativo di pL2 all'interno del sierovarL2 4.

Negli ultimi anni sono stati generati diversi strumenti genetici che ospitano la biologia unica della clamidia, eppure ci sono ancora limitazioni5,6,7. La mutagenesi chimica mediante trattamento con metanoesolino etilico (EMS) può introdurre mutazioni di fracivi o (meno frequentemente) può provocare transizioni nucleotidiche che introducono un codone di arresto prematuro per produrre una mutazione senza senso8. L'inserimento di trasposoni è efficiente per la disgregazione genica, ma la tecnologia attuale nella ricerca della clamidia è laboriosa e richiede moltotempo. Sia il trattamento EMS che le tecniche di mutagenesi trasposoni generano mutazioni casuali e richiedono rigorosi metodi di screening per isolare i ceppi mutanti. Un metodo per interrompere i geni mediante l'inserimento di introni di gruppo II (ad esempio, TargeTron) consente la mutagenesi diretta; tuttavia, questo metodo è limitato dall'efficienza e il sito di inserimento non è sempre previsto correttamente10.

La mutagenesi di scambio allelico segnalata dalla fluorescenza (FRAEM) è una strategia utilizzata per la cancellazione genica mirata accoppiata con l'inserimento di una cassetta di selezione che fornisce resistenza agli antibiotici e un reporter a fluorescenza11. Tuttavia, il FRAEM è complicato dal potenziale degli effetti polari indotti da cassette sui geni a valle, specialmente quando si prendono di mira i geni all'interno degli operoni polcistronici. La mutagenesi allelica allocante a cassette flosche (FLAEM) è un nuovo approccio genetico sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti dalla cassetta precedentemente osservati con la cassetta di selezione FRAEM12. FLAEM utilizza l'editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione e ripristinare l'espressione dei geni a valle. La cassetta di selezione contenente resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP) è riprogettata con siti loxP di fianco. Questi siti loxP possono ricombinarsi in presenza di Cre ricombinase e provocare l'escissione della cassetta dal genoma13. Questa strategia ha dimostrato di alleviare gli effetti polari indotti in cassetta quando si mira tmeA perl'eliminazione 12,14.

Entrambi i metodi FRAEM e FLAEM utilizzano lo stesso vettore di suicidio, pSUmC 4.0, che può essere mantenuto in modo condizionale attraverso l'espressione inducibile di pgp6. L'espressione di pgp6 è stata precedentemente dimostrata necessaria per la ritenzione plasmide ed è quindi sfruttata per controllare la manutenzione del plasmide11,15. Quando C. trachomatis viene coltivato in media integrati con tetraciclina anidisca (aTc) per indurre l'espressione pgp6, il vettore viene mantenuto. In assenza di aTc, il vettore viene perso. La cancellazione mirata del gene si ottiene attraverso lo scambio allelico del gene per la cassetta di selezione. Le regioni da 3 kb direttamente a monte e a valle del gene bersaglio fungono da bracci di omologia per la ricombinazione. Questi bracci sono clonati nel vettore pSUmC 4.0 che fiancheggia la cassetta di selezione. Gli eventi di trasformazione e ricombinazione C. trachomatis di successo sono osservati attraverso la segnalazione della fluorescenza. L'espressione di mCherry sulla spina dorsale vettoriale e gfp all'interno della cassetta di selezione produce inclusioni fluorescenti rosse e verdi. Una volta che l'aTc viene rimosso dai mezzi di coltura, le inclusioni solo verdi indicano eventi di ricombinazione riusciti con la perdita del vettore suicida e l'integrazione della cassetta di selezione nel genoma batterico.

FLAEM rappresenta un'estensione del FRAEM attraverso la successiva trasformazione di un vettore che esprime Cre ricombinase, pSU-Cre, nel ceppo mutante appena creato. Cre ricombinase facilita la ricombinazione tra i siti loxP e l'escissione della cassetta di selezione. Gli eventi di ricombinazione sono indicati tramite segnalazione di fluorescenza. Il vettore pSU-Cre codifica mCherry; pertanto, la trasformazione riuscita è indicata dall'aggiunta di fluorescenza rossa alle inclusioni che esprimono gfp. La coltivazione in assenza di pressione selettiva per la cassetta comporta una ricombinazione mediata in Cre nei siti loxP, e la perdita della cassetta è indicata da inclusioni solo rosse. Come per pSUmC-4.0, l'espressione inducibile di pgp6 viene utilizzata per mantenere in modo condizionale pSU-Cre. Una volta rimossa la selezione aTc e antibiotica, il plasmide viene curato e il conseguente ceppo di delezione senza marcatore non è fluorescente. Questo metodo affronta la questione degli effetti polari indotti da cassette.

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Protocollo

1. Progettazione e assemblaggio di pSUmC-4.0 con armi homologia specifiche per il gene di interesse

  1. Identificare le regioni da 3 kb direttamente a monte e a valle del gene oggetto di delezione per fungere da braccia omologhe da 5' e 3' per la ricombinazione omologa (Figura 1).
  2. Progettare i primer PCR a 1) amplificare il braccio homology da 3 kb 5' dal DNA genomico micoldiale e 2) contenere una sporgenza di 15-30 bp specifica per il pSUmC-4.0 quando viene digerita nel sito dell'enzima di restrizione Sall. Assicurarsi che le regioni di primer sovrapposte al pSUmC-4.0 abbiano temperature di fusione pari a 55 gradi centigradi e che le temperature di fusione dei tornanti per l'intero primer siano <35 .
  3. Progettare i primer PCR a 1) amplificare il braccio homology da 3 kb 3' dal DNA genomico minomico e 2) contenere una sporgenza di 15-30 bp specifica per il pSUmC-4.0 quando viene digerita nel sito dell'enzima di restrizione SbfI. Assicurarsi che le regioni di primer sovrapposte al pSUmC-4.0 abbiano temperature di fusione pari a 55 gradi centigradi e che le temperature di fusione dei tornanti per l'intero primer siano <35 .
  4. Progettare primer di screening PCR che amplificheranno l'inserimento di ogni braccio di omologia nel vettore pSUmC-4.0 dopo una reazione di assemblaggio del DNA16. Progettare questi primi che anneal 500 bp al di fuori dei siti di restrizione per consentire una facile visualizzazione di un prodotto PCR anche se l'inserimento non è riuscito (Figura 1).
  5. Amplifica i bracci di omologia 3 kb 5' e 3' dal DNA genomico clamidiale appena estratto dalla PCR in una o due reazioni per produrre abbastanza frammento per un successivo assemblaggio del DNA. Seguire il protocollo del produttore di polimerasi del DNA per una specifica configurazione di reazione e condizioni di ciclismo.
  6. Verificare che entrambi i prodotti PCR siano della dimensione corretta e che le reazioni non contengano bande contaminanti. Eseguire 5 l di ogni reazione PCR su un 1% DI gel di agarose di DNA.
  7. Purificare e concentrare i frammenti di PCR mediante estrazione fenolo/cloroformio e precipitazioni etanolo.
    1. Raggruppa tutte le reazioni PCR da 3' insieme in un tubo da 1,5 mL e porta ad un volume finale di 200 -L con H2O. Priva di nuclenonnontà per le reazioni PCR.
    2. Aggiungete 200 l di fenolo ad ogni tubo e vortice per 30-60 s. Ruotare ogni tubo in una microcentrifuga a >21.000 x g per 20 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Trasferire lo strato superiore di fase acquoso di ogni tubo in un nuovo tubo da 1,5 mL, aggiungere un decimo del volume di acetato di sodio 3 M ad ogni tubo, quindi scorrere per mescolare.
    4. Aggiungere 3 volumi di etanolo al 100% ad ogni tubo e scorrere per mescolare. Incubare entrambi i tubi a -80 gradi centigradi per 20 min.
    5. Pellet il DNA ruotando ogni tubo a >21,000 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante.
    6. Lavare il pellet di DNA con 100 o lun di 70 % di etanolo. Girare ogni tubo a >21,000 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante.
    7. Lavare di nuovo il pellet di DNA con 100 l l di 100% di etanolo. Girare ogni tubo a >21,000 per 5 min a RT. Scartare il supernatante.
    8. Lasciare asciugare completamente il pellet all'aria, quindi risospendere delicatamente il DNA in 12 gradi di H2O senza nuclesiera facendo scorrere per mescolare.
  8. Digerire 500 ng di vettore pSUmC-4.0 in una reazione di 20 gradi con 1 unità di Sall e 1 unità di SbfI secondo il protocollo della manifattura. Incubare la reazione per circa 3 h o durante la notte per garantire la digestione completa del vettore.
  9. Purificare e concentrare la spina dorsale digerita mediante estrazione fenolo/cloroformio e precipitazioni etanolo come descritto in precedenza (passaggio 1.7.1–1.7.9).
  10. Combinare insieme il vettore pSUmC-4.0 digerito con i prodotti PCR braccio homologia 5' e 3' a un rapporto di 0,01 pmol pSUmC-4.0 a 0,09 pmol per ogni braccio di omologia. Assemblare i frammenti in una reazione di assemblaggio del DNA secondo il protocollo della manifattura.
  11. Trasformare 50 -L di E. coli elettrocompetente con 1 l di reazione all'assemblaggio del DNA. Placcare le piastre trasformate di E. coli su l'agar LB contenenti 100 g/mL di spettronomica spargendo 150 L per piastra. Incubare le piastre a 37 gradi durante la notte.
  12. Il giorno successivo, le colonie di schermo per la fluorescenza verde e rossa utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza. È previsto un totale di 5-30 colonie per piastra di agar.
  13. Scegliete 5-10 colonie per inoculare 4 mL di brodo LB integrate con 100 spectinomycin.g/mL. Incubare le colture a 37 gradi durante la notte con l'agitazione a 250 giri/min.
  14. Utilizzando le colture E. coli notturne, eseguire la purificazione del DNA su piccola scala. Eluire il DNA con 50 gradi di Nuclease-free H2O.
  15. Confermare l'inserimento di ciascun braccio di omologia nel vettore pSUmC-4.0 utilizzando i primer di screening PCR (progettati nel passaggio 1.4) per amplificare ogni inserimento. Se l'assemblaggio del DNA ha esito positivo, un prodotto PCR da 4 kb deve essere osservato in un gel di agarose di DNA dell'1% per entrambe le regioni 5' e 3' del braccio. Un prodotto PCR da 1 KB indica una mancanza di inserimento.
    NOTA: Se l'inserimento dei bracci di omologia non riesce in una reazione di assemblaggio a doppio frammento, eseguire due reazioni di assemblaggio per inserire il braccio 5' e il braccio 3', singolarmente. Digerire il vettore con solo Sall prima di assemblare con il braccio 5', quindi digerire il vettore con SbfI per assemblare il braccio 3'.
  16. Trasformare la diga-/dcm- competente E. coli con 200 ng di pSUmc-4.0 assemblati con entrambi i bracci di omologia. Placcare i batteri trasformati su piastre di agar LB contenenti 100 g/mL spettronomino diffondendo 25 L per piastra. Incubare le piastre a 37 gradi durante la notte. Si prevede un totale di 20-200 colonie.
  17. Schermare le piastre per le colonie fluorescenti rosse e verdi come descritto al punto 1.13.
  18. Creare una coltura per una purificazione del DNA su larga scala inoculando 100 mL di brodo LB contenente 100 spettronomici con colonie rosse e verdi. Incubare la coltura a 37 gradi durante la notte con l'agitazione a 250 giri/min.
  19. Raccogliere la coltura e purificare il DNA utilizzando una purificazione del DNA su larga scala.
    1. Risospendere il DNA plasmide purificato in 100 gradi L di NF-H2O. Una resa totale del DNA di almeno 2 g/l è ideale per la trasformazione di C. trachomatis.
    2. Sequenziare le regioni del braccio di omologia 5' e 3' per garantire il corretto assemblaggio in pSUmC-4.0 prima di trasformare C. trachomatis.

2. Trasformazione di C. tracommata con pSUmC 4.0 - Armi di homologia per la cancellazione genica da parte di Allelic Exchange

  1. Cellule McCoy di semi, fibroblasti murini standardmente utilizzati per coltivare la clamidia, in due 6 piastre di pozzo (1 x 106 cellule / bene) con mezzi di crescita #1. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 fino a quando il monostrato non è confluente (circa 24 h).
  2. In un tubo da 1,5 mL, aggiungere un volume di C. trachomatis WT serovar L2 corpi elementari (EB) che è sufficiente per infettare 12 pozzi di una piastra 6 pozzo a un MOI di 2. Pellet gli EB a >20,000 x g per 30 min, quindi scartare il supernatante.
  3. Avviare la trasformazione della clamydiale risuspendendo delicatamente gli EB in 600, l'l di CaCl2 tampone, quindi aggiungere 24 g di pSUmC-4.0 - bracci omologia al tubo. Mescolare delicatamente la soluzione sfogliando. Incubare il tubo a RTfor 30 min e scorrere per mescolare ogni 10 min.
  4. Aggiungere la soluzione di trasformazione a 24 mL di soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBSS) e mescolare pipettando delicatamente. Trasferire 2 mL di inoculum in ogni pozzo di cellule McCoy confluenti nelle 6 placche del pozzo e infettare con centrifugazione a 900 x g per 1 h a 20 .
  5. Rimuovere l'inoculum e sostituirlo con 2 mL/well RPMI growth media #2. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
  6. Dopo un minimo di 7 h, ma non più di 12 h, sostituire il supporto con 2 mL/pozzetto di supporto di selezione #1. Proseguire l'incubazione a 37 gradi centigradi per 48 h dal momento dell'infezione.
  7. Raccogliere e passare i batteri su un monostrato fresco di cellule McCoy.
    1. Utilizzando un raschietto per cellulari, raschiare delicatamente il monostrato McCoy per sollevare le cellule nel supporto. Trasferire il materiale da ogni pozzo in un tubo da 2 mL. Pellet il materiale cellulare a >20,000 x g in una microcentrifuga per 30 min a 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere e scartare il super-natante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di HBSS con il pipettaggio delicatamente.
    3. Pellet i detriti delle cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante su un pozzo fresco di cellule confluenti McCoy. Aggiungere altri 1 mL di HBSS ad ogni pozzo per un volume totale di 2 mL/pozzo.
    4. Infettare con centricità a 900 x g per 1 h a 20 gradi centigradi. Sostituire l'inoculum con i supporti di selezione #1 immediatamente successivi all'infezione.
  8. Continuare a passare i batteri su un monostrato fresco di cellule McCoy (sezione 2.7) ogni 48 h per tre o più passaggi fino a quando non vengono rilevate inclusioni rosse e verdi utilizzando un microscopio invertito di epifluorescenza 24 h post-infezione (24 hpi).
  9. Una volta rilevate le inclusioni rosse e verdi, continuare a passare il monostrato (sezione 2.7) utilizzando i #2 dei supporti di selezione.
  10. Continuare a passare il monostrato fino a quando non vengono rilevate inclusioni solo verdi 24 hpi (passaggio #3 o versioni successive), il che indica la perdita del vettore pSUmC-4.0 e l'incorporazione della cassetta di selezione loxP nel genoma.
  11. Scegli un pozzo di inclusioni solo verdi per arricchire passando. Raccogliere e congelare eventuali altri pozzi che contengono anche inclusioni solo verde nel buffer di saccarosio-fosfato-glutammato (SPG).
    1. Per arricchire le inclusioni solo verdi, trasferire il monostrato da un pozzo di un 6 pozzo come fatto nel passaggio 2.7, ma dopo aver spinto i detriti delle cellule (passaggio 2.7.3), trasferire il super-ataltuo in un conico con 12 mL di HBSS. Utilizzare questo inoculum per infettare due 6 piastre di pozzo aggiungendo 2 mL per bene, quindi girare le piastre a 900 x g per 60 min a 20 gradi centigradi.
    2. Per congelare ulteriori pozzi, raccogliere il monostrato come al punto 2.7.1, ma risospendere i pellet in 1 mL di SPG invece di HBSS. Pellet i detriti cellulari (passaggio 2.7.3) e trasferire il supernatante in un criotubo di 1,5 ml. Congelare il materiale a -80 gradi centigradi.
  12. Dopo aver arricchito le inclusioni verdi a un MOI di 0,5–1,0 (uno o due passaggi dopo il rilevamento), raccogli i monostrati in SPG come descritto al punto 2.11.2. Ottenere aliquote di 50 gradi in tubi da 1,5 mL e congelare a -80 gradi centigradi.
  13. Batteri titro solo verde per determinare l'inclusione, formando unità /L, secondo un protocollo di titorazione standard17.

3. Isolamento clonale di verde C. trachomatis Eliminazione MutantE Contenente la cassetta di selezione fiancheggiata loxP limitando la diluizione

  1. Semina una piastra di 384 pozzetto con 50 celle McCoy a 2.000 cellule/pozzo nei media di crescita #1. Incubare a 37 gradi centigradi con 5 % di CO2 per 24 ore o fino a confluente.
  2. Diluire una aliquota di batteri solo verdi in HBSS per ottenere 50 EB per 20 mL. Trasferire l'inoculum diluito in un vassoio serbatoio.
    1. Rimuovere il supporto dalla piastra 384 facendo scorrere saldamente l'intera piastra a testa in giù in un contenitore di rifiuti. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 -L di C. trachomatis inoculum ad ogni pozzo. Infettare con centricità a 900 x g per 1 h a 20 gradi centigradi.
      NOTA: Essere consapevoli di non sfogliare così forte che il monostrato si stacca. Se le cellule sono troppo confluenti, si staccheranno più facilmente.
  3. Rimuovere l'inoculum sfogliando e sostituire con un #2 media di crescita di 50 l/pozzo. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
    NOTA: In questa fase, l'integrazione della cassetta di selezione nel genoma è stabile, quindi la selezione degli antibiotici con la spettronomicina non è più necessaria.
  4. Dopo aver incubato la piastra per 5-12 giorni, identificare i singoli pozzi con inclusioni fluorescenti verdi utilizzando un microscopio invertito dell'epifluorescenza o una piattaforma di screening ad alto contenuto.
  5. Raccogliere pozzi con inclusioni solo verdi raschiando il monostrato con una punta p-10 e trasferendo l'intero contenuto del pozzo in un tubo contenente 2 mL di HBSS. Mescolare delicatamente e applicare i 2 mL di inoculo a un nuovo monostrato McCoy confluente in un pozzo 6 per l'infezione.
    NOTA: quando si identificano singoli pozzi con inclusioni, le inclusioni saranno in un cluster a causa dell'espansione dall'inclusione iniziale. Se un pozzo ha più cluster, è probabile che più di un EB inizialmente infettato che bene. Questi pozzi non dovrebbero essere raccolti, e in alcuni casi, possono essere necessari più cicli di isolamento clonale per diluizione seriale.
  6. Infettare la piastra 6 di pozzo con centrifugazione a 900 x g per 1 h a 20 gradi centigradi. Sostituire l'inoculum con 2 mL/well growth media #2. Incubare a 37 gradi centigradi con 5 % DI CO2 per 48 h.
  7. Ripetere i passaggi da 2.11 a 2.13 per arricchire, congelare e titer clonare le popolazioni.
  8. Confermare l'eliminazione di geni mirati da tracomamatide C. clonalmente isolata utilizzando qPCR come descritto in precedenza12.

4. Trasformazione di C. trachomatis FRAEM Mutant con pSU-Cre per avviare la rimozione di loxP Flanked Selection Cassette

  1. Ripetere il processo di trasformazione in una piastra di 6 piani come descritto in precedenza (passaggi 2.1–2.8) utilizzando il mutante C. trachomatis FRAEM isolato clonalmente, vettore pSU-Cre e supporti di selezione #3.
    NOTA: Una trasformazione riuscita è indicata da inclusioni che sono fluorescenti rosse e verdi.
    1. Passaggio del monostrato fino a quando le inclusioni solo rosse vengono rilevate utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza, che indica la perdita della cassetta di selezione (da due a tre passaggi). Continuare a passare il monostrato fino a quando le inclusioni solo rosso sono arricchite a un MOI di 0,5 dollari.
  2. Isolare clonalmente le inclusioni solo rosse limitando la diluizione in una piastra 384 come descritto in precedenza (passaggi da 3.1 a 3,8); tuttavia, utilizzare i #3 multimediali di selezione per tutti i passaggi.
  3. popolazioni clonali arricchenti passando fino a un MOI di 0.1. Una volta arricchito, sostituire i media di sezione con i media di crescita #2 per avviare la perdita del vettore pSU-Cre (circa tre o quattro passaggi).
  4. Isolare clonalmente i batteri non fluorescenti (passaggi da 3.1 a 3,8); tuttavia, eseguire manualmente la scansione della piastra con un microscopio a campo luminoso per rilevare le inclusioni. Arricchire e congelare i batteri (passaggio 2.11–2.12).
  5. Schermo per il ceppo mutante utilizzando PCR quantitativo in tempo reale, gonfiore occidentale, e sequenziamento del DNA dell'intero genoma come descritto in precedenza12.

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Risultati

Il metodo per la delezione del gene senza marcatori in C. trachomatis utilizzando FLAEM si basa su accurate tecniche di clonazione e trasformazione. Il successo della ricombinazione allelica è un primo passo essenziale e richiede l'identificazione e l'inserimento di bracci di omologia nel vettore di clonazione pSUmC-4.0 (Figura 1). Un secondo passo essenziale per la delezione genica senza marcatori è la rimozione del reporter di fluorescenza e cassetta di selezione antibiotica med...

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Discussione

Il protocollo descritto qui per la generazione di delezioni di geni markerless in C. trachomatis da FLAEM consente la delezione mirata di geni non essenziali ed elimina gli effetti polari indotti da cassette. Il protocollo si basa su un'attenta progettazione di bracci di omologia 5' e 3' inseriti nel vettore suicida pSUmC 4.0, da una trasformazione efficiente della tracomatide DiC e da un attento screening di ceppi mutanti isolati. Il successo dell'ingegneria genomica tramite questo metodo produce batte...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Servizio Sanitario Pubblico del National Institute of Health, NIAID (concede A1065530 e Al124649), a K.A. Fields.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseKSE ScientificBMK-A1705Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochlorideACROS Organics233131000
CaCl2 Buffer10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride DihydrateSigmaC7902-500GSuitable for cell culture
CycloheximideSigma7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coliNew England BioLabsC2925H
DMSOATCC4-XSterile filtered cell culture tested
Glutamic acidSigmaG8415-100GL-Glutamic acid
Growth Media #1RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)Gibco24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS)GibcoA38402-02
McCoy CellsATCCCRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BioLabsT1010SSmall scale DNA purification
NaH2PO4SigmaS3139-250GSodium phosphate monobasic
Na2HPO4SigmaS5136-500GSodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli CellsNew England BioLabsC3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning KitNew England BioLabsE5520SGibson Assembly Kit
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MUBioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12162Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabsM0515Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x)Gibco11875-093Containing 2mM L-glutamine
Sall-HFNew England BioLabsR3138S
Sbfl-HFNew England BioLabsR3642S
Selection Media #1RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer SolutionSigmaS7899-100ML3M
SOC Outgrowth MediumNew England BioLabsB9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture GradeAlfa AesarJ61820
SucroseSigmaS1888-1KGBioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG)37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
TrisAMRESCO0497-5KGUltrapure grade
Trypsin-EDTA (1x)Gibco25200-0560.25%
WaterSigmaW3500-500MLSterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

Riferimenti

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