Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule

Riepilogo

Qui, abbiamo sviluppato una nuova strategia modificata multistrato per bioinks a forma di liquido (gelatina methacryloyl con bassa viscosità) per prevenire la sedimentazione di cellule incapsulate.

Abstract

Durante il processo di biostampa tridimensionale basato sull'estrusione, bioink simili a liquidi con bassa viscosità possono proteggere le cellule dai danni alla membrana indotti dallo stress da taglio e migliorare la sopravvivenza delle cellule incapsulate. Tuttavia, la rapida sedimentazione cellulare guidata dalla gravità nel serbatoio potrebbe portare a una distribuzione cellulare inomogenea in strutture biostampate e quindi ostacolare l'applicazione di bioinchi a forma di liquido. Qui, abbiamo sviluppato una nuova strategia modificata multistrato per bioinks simili a liquidi (ad esempio, la gelatina methacryloyl con bassa viscosità) per prevenire la sedimentazione di cellule incapsulate. Più interfacce liquide sono state manipolate nel bioink multistrato per fornire ritenzione interfacciale. Di conseguenza, l'azione di sedimentazione cellulare che attraversa strati adiacenti nel sistema multistrato è stata ritardata nel serbatoio del bioink. Si è scoperto che la ritenzione interfacciale era molto superiore all'attrazione sedimentale delle cellule, dimostrando un ruolo critico della ritenzione interfacciale nella prevenzione della sedimentazione cellulare e nel promuovere una dispersione più omogenea delle cellule nel bioink multistrato.

Introduzione

La biostampa tridimensionale (3D) è stato un metodo promettente per produrre complesse repliche architettoniche e funzionali dei tessuti nativi nella biofabbricazione e nella medicina rigenerativa^1,2,3. Le strategie comuni di biostampa, tra cui la stampa a getto d'inchiostro, estrusione e stereolitografia, hanno pro e contro da diverse prospettive⁴. Tra queste tecniche, la procedura di estrusione è più comunemente utilizzata a causa della sua efficacia in termini di costi. Bioink svolge un ruolo chiave nella stabilità del processo di biostampa dell'estrusione. Il bioink carico di cellule ideale non deve essere solo biocompatibile, ma anche adatto per le proprietà meccaniche⁵. I bioink con bassa viscosità sono tipicamente presentati come uno stato liquido. Questi bioinks possono essere facilmente e rapidamente depositati ed evitare danni alla membrana cellulare indotti da un alto stress da taglio durante l'estrusione. Tuttavia, in casi complessi che richiedono periodi di stampa a lungo termine, la bassa viscosità spesso dà origine all'inevitabile sedimentazione delle cellule incapsulate nel serbatoio di bioinchiostro, che di solito è guidato dalla gravità e porta ad una dispersione cellulare inomogenea nel bioink^6,7. Di conseguenza, un bioink con dispersione cellulare inomogenea ostacola la biostampa in vitro di un costrutto di tessuto funzionale.

Diversi studi recenti incentrati sui bioinks hanno segnalato la promozione della dispersione omogenea delle cellule incapsulate. Un bioinchiostro algerato modificato basato sul crosslinking a due stadi è stato utilizzato per la biostampa dell'estrusione⁸. Un polimero algerato è stato modificato con peptidi e proteine in questo studio. Le cellule presentavano una distribuzione più omogenea in questo alginato modificato rispetto all'alginato comunemente usato a causa dei siti di fissaggio forniti dai peptidi e dalle proteine. In alternativa, i bioink miscelati sono stati utilizzati per risolvere la sedimentazione delle cellule nel bioink. Un bioinchiostro miscelato contenente glicole di polietilene (PEG) e methacryloyl gelatina o gelatina (GelMA) con una maggiore robustezza meccanica è stato utilizzato in un altro studio⁹. Le cellule incapsulate presentavano una distribuzione omogenea principalmente perché la viscosità del bioinchiostro miscelato era migliorata. In generale, ci sono diversi fattori che influenzano la dispersione delle cellule incapsulate nel bioink, come la viscosità del bioink, la gravità delle cellule, la densità delle cellule e la durata del periodo di lavoro. Tra questi fattori, la gravità delle cellule svolge un ruolo fondamentale nel promuovere la sedimentazione. La galleggiabilità e l'attrito forniti dal bioink viscoso sono stati studiati come le principali forze contro la gravità fino ad oggi¹⁰.

In questo contesto, abbiamo sviluppato una nuova strategia per promuovere la dispersione omogenea delle cellule incapsulate nel bioink manipolando più interfacce liquide nel serbatoio di bioink. Queste interfacce liquide create dalla modifica multistrato del bioink possono non solo fornire ritenzione interfacciale, che ritarda la sedimentazione delle cellule, ma mantiene anche una compatibilità adeguata e il comportamento reologico del bioink. In pratica, abbiamo modificato la soluzione GelMA acquosa (5%, w/v) con fibroina di seta (SF) in modo multistrato per produrre longitudinalmente quattro interfacce, fornendo tensioni interfacciali nel bioink miscelato. Di conseguenza, il carico di gravità sulle cellule è stato compensato dalla tensione interfacciale artificiale, e una dispersione quasi omogenea delle cellule incapsulate nel bioink è stata ottenuta a causa di una minore sedimentazione attraverso gli strati adiacenti di cellule. Finora non è stato riportato alcun protocollo simile per rallentare la sedimentazione delle cellule incapsulate manipolando la ritenzione interfacciale nei bioinks liquidi. Vi presentiamo il nostro protocollo qui per dimostrare un nuovo modo di risolvere la sedimentazione cellulare in biostampa.

Protocollo

1. Preparazione di SF-GelMA carico di cellule

1. Sterilizzare tutti i materiali utilizzando unità filtranti per siringhe 0,22 m. Eseguire tutte le fasi in un armadietto di sicurezza biologica.
2. Scaldare 1x PBS a 50 gradi centigradi, e sciogliere la gelatina nel 1x PBS riscaldato mescolando. La concentrazione finale di gelatina in PBS dovrebbe essere del 10% (w/v).
3. Aggiungere l'anidride methacrlica nella soluzione di gelatina (rapporto di peso dell'idordride methacritil a gelatina da 0,6 a 1) lentamente mescolando, e mescolare il complesso per almeno 1 h (50 ) . Tipicamente, preparare 200 mL di 10% soluzione di gelatina con 12 g di anurdride methacritil; il volume dipende dalle esigenze dello studio.
4. Trasferire la soluzione mista contenente gelatina e anidride methacrlica in un tubo sterile da 50 mL.
5. Centrifugare la soluzione mista a 3.500 x g. Di solito ci vogliono 3-5 min per ottenere due strati. Raccogliere lo strato superiore (GelMA) e scartare lo strato inferiore (anduride methacrlicnonnon non reagita).
6. Diluire la soluzione di strato superiore ottenuta al punto 1.5 con due volumi di acqua deionizzata (40-50 gradi centigradi).
7. Dialisi la soluzione ottenuta al punto 1.6 con una membrana di dialisi tagliata a peso molecolare da 12-14 kDa contro l'acqua deionizzata per 5-7 giorni. Cambiare l'acqua due volte al giorno.
8. Raccogliere e congelare la soluzione GelMA a 80 gradi centigradi durante la notte.
9. Lyophilize la soluzione GelMA per 3/5 giorni in un'asciugatrice congelata con la temperatura impostata a -45 gradi centigradi e la pressione impostata su 0,2 mbar.
10. Sciogliere il GelMA lofilfato (grado di sostituzione di circa il 75%) in 1x PBS contenente 10% FBS (siero bovino fetale, v/v), 25 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulfonic acid), e fotoinitiator (0,5%, w/v) per ottenere la preparazione del bioink GelMA.
    NOTA: Il grado di sostituzione di GelMA può essere calcolato con un saggio ninhydrin³.
11. Mescolare la soluzione GelMA (10%, w/v) con diversi volumi di soluzione SF iniziale (5%, w/v) e diversi volumi di 1x PBS per ottenere bioink SF-GelMA con diverse concentrazioni di SF. La proporzione per 1 mL di soluzione GelMA e SF nei diversi bioinks è presentata nella Tabella 1.
    NOTA: tutti i bioink devono contenere una concentrazione finale del 5% (w/v) GelMA, ma la concentrazione di SF varia: 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 e 1,5% (w/v) nei diversi bioink SF-GelMA. Utilizzare SF-M-Layered-GelMA per terminificare il bioink GelMA modificato con SF in modo strato per strato. Utilizzare SF-X-GelMA per ripartire GelMA modificati con SF in modo omogeneo (ad esempio, GelMA con modifica dell'1% SF è stato definito SF-1-GelMA).
12. Sonicare tutti i bioinks per 10-20 min.
13. Coltivare celle NIH3T3 utilizzando il DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) contenente il 10% Di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina in un'incubatrice (37 gradi centigradi con 5% di CO_2). Passare le celle a un rapporto di 1:3 quando la densità raggiunge 80%.
14. Centrifugare la sospensione delle cellule NIH3T3 a 1500 giri/mm per 5 min. Rimuovere il supernatante con aspirazione e risospendere il pellet cellulare con soluzione bioinchiostro fresco in un tubo sterile da 15 ml.
    NOTA: la concentrazione delle cellule incapsulate nel bioink deve essere di 1 x 10⁶ cellule/mL e la concentrazione deve essere calcolata con un citometro.
15. Utilizzare 2 mL di diversi bioinks SF-GelMA per sospendere i pellet cellulari per ottenere vari bioinks carichi di cellule.

2. Caricamento, riscaldamento e biostampa della SF-M-Layered-GelMA

1. Caricare 0,4 mL di SF-0.5-GelMA carico di cellule nello strato inferiore della siringa.
   NOTA: Utilizzare una siringa da 2 mL come serbatoio di bioinchiostro in questo studio. Caricare diversi bioinks SF-GelMA nella siringa in modo strato per strato.
2. Collocare la siringa nel bagno d'acqua ghiacciata (0 gradi centigradi) per 5 min per far sì che il bioinchiostro dello strato inferiore si trasformi in uno stato gel.
3. Caricare 0,4 mL di bioinchiostro SF-0.75-GelMA carico di cellule sopra lo strato inferiore.
4. Posizionare la siringa con i due strati di bioinks in un bagno d'acqua ghiacciata (0 gradi centigradi) per 5 min per causare la trasformazione dei due strati di bioinks in uno stato gel.
5. Scorrere le fasi di carico e raffreddamento altre 3 volte con i restanti 3 tipi di bioinks (SF-1-GelMA, SF-1.25-GelMA, SF-1.5-GelMA) per ottenere un sistema di bioink multistrato con diverse concentrazioni di SF nei diversi strati. Il volume utilizzato per il caricamento di tutti i bioinks deve essere di 0,4 mL.
6. Riscaldare il bioinchiostro multistrato mettendo la siringa in un'incubatrice (37 gradi centigradi) per 30 minuti prima della biostampa.
7. Utilizzare una siringa da 2 mL come serbatoio di bioinchiostro con un ugello di stampa da 27 G. Impostare la velocità di flusso a 50 gradi/min, la velocità di movimento dell'ugello a 2 mm/s e l'altezza dell'ugello a 1 mm. Eseguire la procedura di biostampa a temperatura ambiente (circa 20 gradi centigradi).
   1. Stampare il costrutto di tessuto in modo estrusivo utilizzando un biostampante su misura sotto i parametri adattati dai nostri studi precedenti^11,12.
8. Utilizzare la luce ultravioletta (365 nm, 800 mW) per 40 s per incrociare il costrutto di tessuto biostampato.
9. Cultura del costrutto di tessuto incrociato in DMEM (mezzo Aquila modificato di Dulbecco) contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomica in un'incubatrice (37 gradi centigradi con 5% di CO_2). Il mezzo è stato cambiato ogni 8 h durante i primi 2 giorni e ogni 2-3 giorni successivi.

Risultati

Uno schema della preparazione di bioinks carichi di cellule è illustrato nella Figura 1. Dopo la preparazione dei diversi bioinks, il carico, il riscaldamento e la biostampa sono stati eseguiti (Figura 2). Per valutare la distribuzione delle cellule incapsulate nel serbatoio di bioink, è stata eseguita una procedura di biostampa utilizzando tre diversi bioink carichi di cellule in tre piastre di 96 pozze(Figura 3A). Due gruppi di ...

Discussione

La stabilità del sistema a più livelli è un punto chiave per eseguire correttamente questo protocollo. Abbiamo teoricamente calcolato la diffusione delle molecole SF nella soluzione GelMA sulla base dello studio di Nauman¹³. Si è scoperto che la diffusione delle proteine in soluzione era correlata al loro peso molecolare. Il peso molecolare medio (MW) dell'albumina del siero bovino (BSA) è di 66,5 kDa, e il suo coefficiente di diffusione è 64-72 m²/s. L'MW medio di fibrinogeno è ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959)	TCI	M64BK-QD
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630080
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	10569044
fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10091
Gelatin	Sigma-Aldrich	V900863MSDS
Methacrylic anhydride (MA)	Sigma-Aldrich	276685MSDS
Penicillin–streptomycin antibiotics	Gibco	15140163
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010049
Silk fibroin	Advanced BioMatrix	5154