Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

Riepilogo

All'interfaccia di solventi organici e acquosi, proteine arofhiliche elastine su misura si assemblano in complesse strutture supramolecolari come vescicoli, fibre e coacervate innescate da parametri ambientali. I protocolli di assemblaggio descritti producono compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) con proprietà regolabili, consentendo l'incapsulamento di vari carichi.

Abstract

Gli elementi costituti recanti in modo proteico su misura sono candidati versatili per l'assemblaggio di strutture sopramolecolari come cellule minime, veicoli per la consegna di farmaci e scaffold enzimatici. A causa della loro biocompatibilità e sintonabilità a livello genetico, le proteine simili a Elastin (ELP) sono elementi costitutivi ideali per applicazioni biotecnologiche e biomediche. Tuttavia, l'assemblaggio di strutture sopramolecolari basate su proteine con proprietà fisiochimiche distinte e un buon potenziale di incapsulamento rimane impegnativo.

Qui forniamo due protocolli efficienti per l'autoassemblaggio guidato di ELP anfifile in architetture proteiche supramolecolari come coacervates sferiche, fibre e vescicole stabili. I protocolli di assemblaggio presentati generano compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) basati su ELP con proprietà fisico adattabili. I PMBC dimostrano il comportamento della separazione di fase e rivelano la fusione della membrana dipendente dal metodo e sono in grado di incapsulare molecole di carico fluorescenti chimicamente diverse. I PNG risultanti hanno un alto potenziale applicativo come piattaforma di formulazione e somministrazione di farmaci, cellule artificiali e spazio di reazione compartimentato.

Introduzione

L'assemblaggio di strutture sovramolecolari per applicazioni biotecnologiche sta diventando sempre più importante^1,2,3,4,5. Per l'assemblaggio di architetture funzionali come coacervate, vescicoli e fibre con proprietà fisico desiderate è importante comprendere e controllare le proprietà fisicochimiche e conformazionali dei componenti. A causa della precisione molecolare delle molecole presenti in natura, i mattoni per le strutture sopramolecolari sono sempre più basati su lipidi, acidi nucleici o proteine. Rispetto ai polimeri sintetici, gli elementi costitutivi proteici consentono un controllo preciso sulle strutture sopramolecolari emergenti⁶ a livello genetico. La sequenza primaria di amminoacidi (aa) dei singoli blocchi di costruzione proteica codifica intrinsecamente le informazioni per il loro potenziale di assemblaggio dalla molecola fino al livello macroscopico, nonché la forma tridimensionale e le proprietà fisiche della struttura sopramolecolare finale⁷.

I metodi segnalati per l'assemblaggio di diverse strutture sopramolecolari spesso coinvolgono proteine anfifile come le proteine di elastina sensibili alla temperatura (ELP)^5,8,9, oleosina ricombinante¹⁰e proteine artificiali anfifili¹¹. I metodi innescati dalla temperatura hanno portato all'assemblaggio di micelle^4,10,12Fibre¹³Fogli¹⁴e vesciche^9,15,16. Sono stati applicati metodi che coinvolgono solventi organici per la formazione di vesciche dinamiche a base di proteine^8,11,14. Finora, i protocolli applicati per la formazione delle vesciche spesso non hanno il controllo dell'assemblaggio su assiemi di dimensioni micrometriche^16,17o hanno un rendimento di assemblaggio limitato⁵. Inoltre, alcune vesciche a base di ELP segnalate hanno compromesso il potenziale di incapsulamento¹²stabilità limitata nel tempo⁹. Affrontando questi inconvenienti, i protocolli presentati consentono l'autoassemblaggio di strutture sovramolecolari di dimensioni micrometriche e sub micrometriche con proprietà fisiologiche distinte, buon potenziale di incapsulamento e stabilità a lungo termine. Gli ELP anfifile su misura si assemblano in strutture supramolecolari, spaziando dalla gamma di coacervates sferiche e fasci di fibre contorte altamente ordinati alle vescicole unilamellar a seconda del protocollo applicato e delle condizioni ambientali associate. Grandi compartimenti vescicolari a base di membrana (PMBC) rivelano tutti i principali fenotipi come la fusione della membrana e il comportamento di separazione di fase analogo ai liposomi. I PMCC incapsulano in modo efficiente molecole di carico fluorescenti chimicamente diverse che possono essere monitorate utilizzando una semplice microscopia a epifluorescenza. I domini ELP ripetitivi utilizzati in questo studio sono interessanti elementi costitutivi per architetture sovramolecolari basate su proteine¹⁸. L'unità di ripetizione pentapeptide ELP (VPGVG) è nota per tollerare diverse aa oltre alla prolina alla quarta posizione (valine, V), pur conservando le sue proprietà strutturali e funzionali¹⁹. Il design di ELP anfifili contenenti domini idrofili e idrofobici distintivi è stato realizzato inserendo residui di aa guest (X) nella ripetizione VPGXG con distinta idifobicità, polarità e carica²⁰. I domini anfifili di ELP in cui sono dotati di fenilalanina idrofobica (F) o isoleuina (I) mentre il dominio idrofilo conteneva acido glutamico caricato (E) o arginina (R) come residui ospiti. Un elenco di costrutti ELP anfilici idonei e sequenze aa corrispondenti può essere trovato nelle informazioni supplementari e nei riferimenti^8,21. Tutti i mattoni dove dotati di piccoli coloranti fluorescenti o proteine fluorescenti per la visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza. mEGFP e altre proteine fluorescenti sono state fuse N-terminalemente ai domini idrofili degli anfifili ELP . I coloranti organici sono stati coniugati attraverso ceppo privo di rame promosso cicloaddition alkyne-azide (SPAAC) a un aminoacido innaturale introdotto in modo co-traduzionale (UAA). L'incorporazione co-traduzionale dell'UAApara-azidophenylalanine (pAzF)²²permette la modifica n-terminale del dominio eLP idrofilo. In questo modo il coloranti verde fluorescente BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) o qualsiasi piccola molecola fluorescente con un ciclooctyne teso può essere utilizzato come sonda fluorescente. L'incorporazione di successo dell'UAA pAzF e la cicloaddition del colorante tramite SPAAC possono essere facilmente confermate tramite LC-MS/MS a causa di un'efficiente ionizzazione dei corrispondenti peptidi triptici⁸. Questo piccolo tincolo organico è stato applicato per ampliare la scelta del solvente per i protocolli di assemblaggio, poiché le proteine fluorescenti sono incompatibili con la maggior parte dei solventi organici. I due protocolli di assemblaggio più efficienti per le strutture sopramolecolari sviluppati nel nostro laboratorio sono descritti di seguito. Il metodo di gonfiore THF è compatibile solo con il tinri organico modificato ELP anfilico. Al contrario, il metodo di estrusione 1-butanol (BuOH) è compatibile con molte proteine come sonda fluorescente ad esempio mEGFP, poiché il metodo descritto conserva completamente la fluorescenza di queste proteine di fusione. Inoltre, l'incapsulamento di piccole molecole e il comportamento di fusione vescicolare funzionano meglio impiegando il metodo di estrusione BuOH.

Protocollo

1. Progettazione e clonazione di proteine anficani che assomigliano all'elastina (ELP)

1. Clonare e progettare i costrutti come descritto altrove^8,20. Plasmidi sono disponibili su richiesta.

2. Espressione proteica, purificazione e preparazione

1. Espressione di F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry
   1. Inoculare la cultura dell'espressione principale dalla pre-cultura notturna a un OD₆₀₀ di 0,3. Incubare a 37 oC, 200 giri/m in sterile mezzo LB 400 mL integrato con antibiotici appropriati in una fiaschetta 2 L.
   2. Preparare la soluzione stock IPTG (1 M) per l'induzione della coltura dell'espressione in acqua ultrapura.
   3. Quando si raggiunge OD₆₀₀ 0,5–0,8, aggiungere IPTG alla coltura dell'espressione a una concentrazione finale di 1 mM e ridurre la temperatura di incubazione a 20 gradi centigradi. Lasciare l'espressione a 20 gradi centigradi per circa 20 h a 200 rpm.
2. Espressione di ELP anfifile contenente UAA pAzF
   1. Inoculare la cultura dell'espressione principale dalla pre-coltura egli coli durante la notte contenente i due plasmidi pEVOL pAzF e ad esempio pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his a un OD₆₀₀ di 0,3 (vedere informazioni supplementari per le sequenze di amminoacidi). Incubare a 37 , 200 rpm in sterile 400 mL medio LB integrato con kanamicina e cloramramhenicol in un flacone 2 L.
   2. Preparare una soluzione di riserva da 100 mM pAzF in acqua ultrapura. Per 10 mL di soluzione di magazzino pAzF, pesare 206,2 mg pAzF e respenderlo in 8 mL di acqua ultrapura. Per sciogliere il pAzF sollevare il pH della soluzione con 3 M NaOH e mescolare vigorosamente. Quando pAzF è sciolto, abbassare con attenzione il pH a 10,5 e aggiungere acqua ultrapura ad un volume finale di 10 mL. Utilizzare un filtro sterile (0,22 m) e l'aliquota della soluzione in tubi di reazione da 2 mL.
   3. Preparare 1 M soluzione di stock IPTG in acqua ultrapura e 20% soluzione di stock arabinose in acqua ultrapura.
   4. Quando si raggiunge OD₆₀₀ 0,5–0,8, aggiungere pAzF alla cultura dell'espressione a una concentrazione finale di 2 mM. Incubare la coltura per 10 min, 37 c, 200 rpm per consentire l'assorbimento di pAzF.
   5. Indurre l'espressione della proteina bersaglio e l'espressione della necessaria sintetasi tRNA/t-RNA t attraverso l'aggiunta simultanea di IPTG (1 mM) e arabinose (2%) e ridurre la temperatura di incubazione a 20 gradi centigradi.
   6. Lasciare l'espressione a 20 gradi centigradi per circa 20 h a 200 rpm. Cultura dell'espressione di raccolta per centrifugazione a 4 gradi centigradi, 4000 x g,40 min.
3. Lisi cellulare e purificazione delle proteine
   1. Risospendere il pellet E. coli nel buffer di lisi (10 mL per litro di coltura; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0.25% Triton X-100) contenente lysozyme (0,1 mg/mL) e PMSF (0,1 mM). Incubare per 30 min sul ghiaccio e congelare e scongelare due volte successivamente immergendo il campione in azoto liquido.
   2. Sonicare la sospensione (30%, 15 volte, 30 s: 10 s pausa) e cancellare il lisato tramite centrifugazione (4 , 10,000 x g per 40 min).
   3. Purificare la proteina utilizzando la cromatografia di affinità (ad esempio su una colonna di nichel da 1 mL utilizzando un sistema FPLC collegato a un collettore frazionario; vedi Tabella dei materiali). Elusore la proteina con tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M di urea, 250-500 mM di imidazolo) e conservare a 4 mM fino a un'ulteriore elaborazione.
   4. Analizzare l'efficienza di purificazione tramite SDS-PAGE.

3. Modifica delle tinri degli ELP tramite SPAAC

1. Stimare approssimativamente la concentrazione della soluzione ELP.  Un_{assorbimento di 280} per la valutazione della concentrazione non è utile poiché la sequenza pAzF-R40F20 è priva di amminoacidi che assorbono nella gamma UV. Pertanto, un anfifilo ELP precedentemente lofilfato e ponderato può essere utilizzato come riferimento per il confronto delle bande SDS PAGE. Confrontando l'intesità del valore grigio sommato delle bande SDS PAGE da soluzioni ELP con concentrazioni note e il campione può essere stimato la concentrazione approssimativa del campione.
2. Aggiungere 1 -L l di colorante fluorescente BDP-FL-PEG4-DBCO (soluzione di 10 mM di stock; 20 M di concentrazione finale) a 500 -L della soluzione ELP (20 M). Incubare la reazione per circa 10 h a 15 , scuotendo e protetto dalla luce.
3. Per un ulteriore uso, dialze la reazione per rimuovere eccessivo BDP.
   1. E' una membrana di dialisi equilibrate (ad esempio 12 kDa cutoff) in acqua ultrapura per 10 min. Per fissare la membrana di dialisi nell'apertura, posizionare un coperchio del tubo di reazione con nucleo perforato sull'apertura, chiudendo così il tubo.
   2. Posizionare il tubo di reazione a testa in giù nel buffer scelto. Scambiare il buffer (2-5 L) due volte dopo la dialisi per almeno 3 h ogni volta. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra la membrana di dialisi e il tampone per garantire il successo della dialisi.

4. Protocollo di gonfiore THF

1. Diallyze soluzione ELP omogenea contro fosfato o tris buffer (10 mM) con pH stabile 7.5 per rimuovere sali e composti rimanenti dalla purificazione del suo tag.
2. Preparare il liofilizzatore e raffreddare fino alla temperatura di partenza per l'essiccazione.
3. La soluzione proteica dialzata in tubi di reazione da 1,5 mL (50-500 l per tubo) e il congelamento degli urti in azoto liquido. Per evitare la miscelazione indesiderata di diverse soluzioni proteiche durante l'essiccazione, i tappi con un piccolo foro possono essere messi sopra il tubo di reazione per sigillarlo parzialmente.
4. Togliere i campioni di proteine congelate dall'azoto liquido e metterli immediatamente nel liofilizzatore per iniziare l'essiccazione congelata. L'essiccazione del congelamento è terminata quando il campione è completamente asciutto (circa 24-48 h). Successivamente, ventilare gli ELP anfifili liofilizzati con N₂secco , quindi chiudere immediatamente i coperchi del tubo di reazione per evitare il contatto con l'umidità dell'aria.
5. Aggiungere la THF pura ai campioni di lofilde (ELP, 5-10 M) e posizionare la soluzione in un sonicatore del bagno d'acqua contenente acqua ghiacciata per 15 min per consentire il gonfiore dell'ELP in THF.
6. Preriscaldare un termociclore a 30-60 gradi centigradi per la formazione di vescicolari o fino a 90 gradi centigradi per la formazione di fibre e preparare nuovi tubi di reazione contenenti acqua ultrapura o tampone (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 5–13). I coacervates sferici si assemblano prevalentemente a 20 gradi centigradi entro il pH 9–13. La formazione delle vesciche è favorita a 50-60 gradi centigradi tra il pH 7 e il 9. La formazione di fibre è predominentemente indotta al di sopra dei 60 gradi centigradi tra pH 5 e 12.
7. Dopo la fase di sonicazione, posizionare la soluzione ELP/THF, nonché la soluzione di acqua o tampone ultrapura preparata nel termociclore e riscaldare fino alla temperatura desiderata per 5 minuti. Quando si raggiunge la temperatura, la soluzione ELP/THF preriscaldata deve essere accuratamente stratificata in cima all'acqua ultrapura preriscaldata o alla soluzione tampone. Dovrebbe essere visibile una netta separazione delle due fasi con un'interfaccia distinta.
8. Mettere nuovamente la miscela nel termociclore e incubare per 20 min per consentire la formazione di vescicle o fibre all'interfaccia. Successivamente, lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 10 min prima dell'analisi tramite microscopia a fluorescenza o dialisi.
9. Soluzione di dialyze contenente le strutture sopramolecolari contro acqua ultrapura o tampone (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 7–10).

5. Protocollo di estrusione BuOH

1. Preparare una soluzione ELP da 1 a 50 m in acqua ultrapura o tampone (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, può contenere fino a 4 M di urea). La concentrazione della soluzione anficana ELP F20R20-mEGFP e F20R20-mCherry può essere determinata utilizzando i coefficienti di estinzione molare (F20R20-mEG FPA₂₈₀ - 22015 M^-1 cm^-1 e F20R20-mCherry A₂₈₀ x 34380 M^-1 cm^-1) (vedere informazioni supplementari per le sequenze aa).
2. Aggiungere 10%–20% (v/v) 1 butanol e mescolare immediatamente la soluzione pipetting su e giù o disegnando attraverso una siringa più volte. Può essere applicata una pipetta da 100 - o una siringa Hamilton dotata di ago da 0,25 x 25 mm. La torbidità della soluzione durante la miscelazione dovrebbe aumentare, indicando la formazione di vescicoli. 1-octanol 5%–15% (v/v) può essere utilizzato anche per l'estrusione vescica invece di 1-butanol.
3. Al fine di ottenere una distribuzione di dimensioni ridotte, estrudere vesciche utilizzando un mini estrusore attraverso una membrana con una dimensione del poro di 1 m a temperatura ambiente. La dimensione della membrana utilizzata per l'estrusione determina il taglio di dimensioni superiori delle vesciche.
4. Diallyze le vesciche come descritto sopra (passaggio 3.3) per rimuovere i residui 1-butanol.

6. Incapsulamento della tinrizione con il protocollo di estrusione BuOH

1. Mescolare circa 40 soluzione ELP in 10 mM Tris-HCl, pH 8 con 1 Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL concentrazione finale).
2. Aggiungere 10 l'l di BuOH alla soluzione ed estrudere 5-10 volte attraverso una siringa dotata di un ago da 0,25 x 25 mm.

7. Analisi delle strutture sovramolecolari mediante microscopia a fluorescenza

1. Posizionare un anello di rinforzo su uno scivolo di vetro e premere saldamente il lato adesivo al vetro.
2. Aggiungere 5 ll l del campione all'interno dell'anello di rinforzo e posizionare uno slittadio di copertura sulla parte superiore.
3. Sigillare il campione con smalto ai bordi dello slittamento di copertura per evitare l'evaporazione del campione durante l'analisi.
4. Eseguire la microscopia a fluorescenza come descritto in precedenza⁸.

Risultati

Sviluppo di protocolli per la produzione di vescicoli
Figura 1 delinea i due diversi metodi di preparazione vescicano. Il metodo di gonfiore THF sul lato sinistro è composto da tre fasi successive e si traduce in diversi assemblaggi sopramolecolari dell'ELP a seconda della temperatura. Nella figura 1A le immagini di microscopia epifluorescenza mostrano vescicoli assemblati da BDP-R20F20 e strutture fibrillari ass...

Discussione

Un difetto mentre seguii i protocolli descritti per l'assemblaggio di strutture sopramolecolari definite porta principalmente alla formazione di aggregati non specifici (Figura 2, IV) o ad anfifili ELP distribuiti omogeneamente. I passaggi critici del protocollo sono descritti di seguito:

Per l'alta resa dell'alta espressione dell'ELP anfipotico, una temperatura relativamente bassa di 20 gradi centigradi è ottimale. Per una purificazione basata sull'affinità di ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 µm and 0.2 µm Steril Filter	VWR
1,4-Dithiothreitol	Merck
1-butanol. >99.5% p.a.	Roth
2log DNA ladder	NEB
2-Mercaptoethanol	Roth
50 mL Falcon tubes	VWR
79249 Alkyne Mega Stokes dye	Sigma Aldrich
Acetic acid glacial	VWR
Acetonitrile, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich
Ampicillin sodium-salt, 99%	Roth
BDP-FL-PEG4-DBCO	Jena Bioscience
Biofuge	Heraeus
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm)	Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)	Roth
BspQI	NEB
Camera DS Qi1	Nikon
Centrifuge 5417r	Eppendorf
Centrifuge 5810r	Eppendorf
CF-400-Cu square mesh copper grid	EMS
Chloramphenicol	Roth
CompactStar CS 4	VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral	Life Technologies
Digital sonifier	Branson
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Applichem
Dnase I	Applichem
EarI	NEB
EcoRI-HF	NEB
Environmental shaker incubator ES-20	Biosan
Ethanol absolute	Roth
Ethidium bromide solution	Roth
Filter supports	Avanti
Glass plates	Bio-Rad
Glycerol Proteomics Grade	Amresco
Glycin	Applichem
H4-Azido-Phe-OH	Bachhem
Heat plate MR HeiTec	Heidolph
HindIII	NEB
HisTrap FF crude column	GE Life Sciences		Nickel column
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a.	Merck
Illuminator ix 20	INTAS
Illuminator LAS-4000	Fujifilm
Imidazole	Merck
Immersions oil for microscopy	Merck
Incubators shakers Unimax 1010	Heidolph
Inkubator 1000	Heidolph
IPTG, >99%	Roth
Kanamycinsulfate	Roth
L(+)-Arabinose	Roth
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE	Sartorius
LB-Medium	Roth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC	Christ
Lysozyme, 20000 U/mg	Roth
Microscope CM 100	Philips
Microscope Eclipse TS 100	Nikon
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm)	VWR
Microscopy slides	VWR
Microwave	Studio
Mini-Extruder Set	Avanti Polar Lipids
NaCl, >99.5%, p.a.	Roth
Natriumhydroxid pellets	Roth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro	5 Prime
Nucleopore Track-Etch Membrane	Avanti
PH meter 766 calimatic	Knick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)	Roth
Polypropylene Columns (1 mL)	Qiagen
PowerPac basic	BioRad
Propanol-2-ol	Emplura
Protein ladder 10-250 kDa	NEB
Recirculating cooler F12	Julabo
Reinforcement rings	Herma
SacI HF	NEB
SDS Pellets	Roth
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4	VWR
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate	VWR
T4 DNA Ligase	NEB
TEMED	Roth
TexasRed Dextran-Conjugate	MolecularProbes
Thermomix comfort	Eppendorf
THF, >99.5% p.a.	Acros
Triton X 100	Roth
Trypton/Pepton from Casein	Roth
Ultrasonic cleaner	VWR
Urea p.a.	Roth
Vacuum pump 2.5	Vacuubrand
XbaI	NEB
XhoI	NEB
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)	Roth