Ottimizzazione della cultura organoide e organipica renale per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging di microscopia migliorato

Riepilogo

Questo lavoro descrive due metodi per studiare lo sviluppo degli organi, una migliore impostazione dello xenotrapianto sulla membrana corioallantoica (CAM) dagli embrioni aviari che consente la vascolarizzazione di organi embrionali e organoidi coltivati e una nuova direzione z fissa metodo di coltura dell'organo con condizioni sperimentali modificate che consente l'imaging confocale time-lapse ad alta risoluzione.

Abstract

Le colture organotiche renali embrionali, e in particolare gli organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti, sono strumenti eccellenti per seguire i processi di sviluppo e modellare la malattia renale. Tuttavia, i modelli sono limitati dalla mancanza di vascolarizzazione e funzionalità. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un protocollo migliorato per il metodo di xenotrapianto di cellule e tessuti alla membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario per ottenere la vascolarizzazione e il ripristino del flusso sanguigno. Gli innesti sono sovrapposti a minicarri su misura che fissano i campioni al CAM e forniscono loro un mezzo di coltura che protegge gli innesti dall'essiccazione. Il metodo di coltura migliorato consente agli xenograforti di crescere fino a 9 giorni. Il manoscritto descrive anche come fornire condizioni ottimali per l'imaging confocale a lungo termine di organoidi renali e colture organotipiche utilizzando il metodo di direzione fissa (Fi-D) pubblicato in precedenza. Questo metodo comprime delicatamente un organo embrionale o organoide tra un coperchio di vetro e la membrana in una grande quantità di mezzo e fornisce ottime condizioni per l'imaging per un massimo di 12 giorni. Insieme, questi metodi consentono la vascolarizzazione e il flusso sanguigno agli organoidi renali e alle colture renali organotipiche con una migliore imaging confocale. I metodi qui descritti sono molto utili per studiare le funzioni fondamentali e applicate dei reni ex vivo. Entrambi i metodi sono applicabili a vari tipi di tessuti e organoidi.

Introduzione

La coltura organotipica dei reni embrionali è diventata un modello importante per studiare la nefrogenesi decenni fa^1,2,3. Gli organoidi renali rappresentano un sistema modello avanzato per studiare lo sviluppo di reni sani e malati⁴. Lo svantaggio principale per entrambi i metodi, tuttavia, è che nessuno dei due metodi riassume la funzione principale del rene: la filtrazione del sangue. Nefrosci e vascolatura renale si sviluppano in organoidi renali e culture organotipiche in modo simile alla fase iniziale nello sviluppo vivo; tuttavia, i glomeruli formati in vitro rimangono avascolari⁵. La vascolarizzazione dei reni embrionali e degli organoidi renali ex vivo è stata precedentemente dimostrata negli esperimenti di trapianto solo in condizioni di vivo. Ad esempio, il trapianto di organoidi renali derivati da cellule staminali pluripotenti umane sotto una capsula renale di topo consente lo sviluppo dei nefrodi nell'organoid e uno stadio funzionale⁶.

Un approccio intermedio tra le colture puramente in vitro e i metodi di trapianto in vivo è lo xenotrapianto alla CAM degli embrioni aviari. La vascolarizzazione della primardia renale di topo intatta è stata dimostrata in precedenza utilizzando questo sistema^7,8. Tuttavia, è stato anche dimostrato che la vascolatura renale nel rene murino xenotrapiantato è stata derivata dall'endotelio ospite, non l'innesto⁹. Questa osservazione ha ridotto significativamente il potenziale dei modelli chimerici (aviari-mammiferi) del rene embrionale per studiare lo sviluppo della vascolatura renale, perché le condizioni sperimentali non erano permissive per la sopravvivenza delle cellule endoteliali derivate dai donatori.

Presentato nella prima parte di questo protocollo è un metodo migliorato per la coltivazione di reni embrionali di topo sul CAM di uova aviarie, combinando condizioni microambientali di coltura organotipica e xenotrapianto. Il principale miglioramento dei metodi precedenti è che invece di posizionare i reni embrionali del topo e gli organoidi renali direttamente sul CAM, l'area di impianto è sovrapposta a miniserbatoi permeabili pieni di mezzo di coltura che forniscono il tessuto trapiantato che fornisce il tessuto trapiantato con sostanze nutritive e proteggerlo dall'essiccazione. Il tasso di successo degli esperimenti aumenta in modo significativo e le condizioni per lo sviluppo della vascolatura derivata dal donatore migliorano. L'applicazione di questo metodo alle colture xenotrapianto comporta lo sviluppo della vascolatura glomerare composta da cellule endogene endogene dei reni donatrici.

L'analisi dettagliata della morfogenesi cellulare è un'altra importante applicazione dei modelli di coltura renale. I metodi precedentemente segnalati per l'acquisizione dell'immagine time-lapse delle colture renali sono sufficienti solo per l'analisi della morfologia complessiva e la modellazione del rene embrionale, ma non per tracciare singole cellule¹⁰. Recentemente, è stato descritto un nuovo metodo di risoluzione della direzione a z (Fi-D) destinato all'imaging time-lapse 3D confocale ad alta risoluzione di organoidi renali e colture organotipiche¹¹. In questo metodo, gli organoidi e gli organi embrionali sono delicatamente compressi tra un coperchio di vetro e una membrana permeabile di un inserto transwell in una piastra progettata su misura fino a quando lo spessore del campione raggiunge 70 m, fornendo condizioni ottiche ottimali per l'imaging. Nella seconda parte dei metodi, viene descritto un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piastra su misura e la configurazione di esperimenti Fi-D per l'imaging organoid a lungo termine.

Protocollo

La cura e le procedure sugli animali erano conformi alla legislazione nazionale finlandese per l'uso di animali da laboratorio, alla Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e di altro tipo (ETS 123) e alla direttiva 86/609/CEE dell'UE.

1. Fabbricazione di miniserbatoi per la coltivazione di reni embrionali di topo e organoidi renali su CAM di pollo e creazione di esperimenti di xenotrapianto

1. Utilizzare inserti di coltura cellulare transwell progettati per 6 pozze o 12 piastre di pozzo.
   NOTA: a seconda dell'esperimento specifico, è possibile utilizzare miniserbatoi grandi o piccoli. È meglio utilizzare piccoli miniserbatoi per lo xenotrapianto fino a otto reni embrionali o quando diversi miniserbatoi saranno posizionati sullo stesso embrione di pollo (ad esempio, campioni di esperimento e controllo sullo stesso CAM di pollo).
2. Tagliare i lati degli inserti utilizzando un multitool rotante con una lama a sega circolare o una sega a mano per creare un anello di plastica alto 2 mm con una membrana permeabile attaccata ad esso.
3. Polacco i bordi di questi minireservoirs con un bisturi o un coltello affilato.
4. Sterilizzare i miniserbatoi nel 70% di etanolo per almeno 1 h.
5. Lavare i miniserbatoi in acqua a doppia distillazione automatica e lasciarli asciugare in un cappuccio laminare.
6. Risciacquare i miniserbatoi in PBS e mezzi di coltura (10% FBS/1% penicillina-streptomica).
7. Collocare il serbatoio in una piastra Petri, sopra una goccia (600 l/400 l) di mezzo di coltura con la membrana rivolta verso l'alto.
8. Disporre sezionati i reni embrionali ex vivo o gli organoidi renali uniformemente sulla membrana con l'aiuto di una pipetta o di un tubo capillare di vetro. Evitare di lasciare un sacco di liquido intorno ai reni.
9. Lasciare che i campioni si attacchino alla membrana per 2-24 h in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 e 5% di CO₂.
   NOTA: Fino a otto reni di topo embrionali E11,5 o organoidi renali possono essere disposti sul piccolo inserto. L'inserto di grandi dimensioni è raccomandato se saranno utilizzati pezzi più grandi di tessuto embrionale per xenotrapianto o una miscela di idrogel cellulare su un'area più ampia della CAM.
10. Prendere polli embrionali coltivati ex ovo di 8 giorni preparati secondo metodi pubblicati in precedenza dall'incubatore di coltura cellulare^12,13.
11. Trasferire i miniserbatoi al CAM in modo che gli innesti siano rivolti verso il CAM e la membrana li sovrapponga. Posizionare i miniserbatoi nella periferia del CAM, in modo che non coprano l'embrione di pollo.
    NOTA: Quando si utilizzano i miniserbatoi più piccoli fabbricati da inserti transwell per 12 pozze, è possibile posizionare fino a tre miniserbatoi su un CAM.
12. Aggiungete ai minicarri 500 l (6 ben inserti) o 300 l (12 pozzetto) di coltura medio.
13. Coltivare i campioni su pollo CAM per un massimo di 9 giorni. Sostituire il supporto di coltura nei miniserbatoi ogni giorno.
    NOTA: La vascolarizzazione dei campioni può essere osservata non appena 24–48 h dopo il trapianto.

2. Fabbricazione di lastre progettate su misura e impostazione di colture Fi

1. Forare fori di 20 mm di diametro nella parte inferiore di una piastra di 6 pozzetti.
   NOTA: per gli esperimenti di Fi-D, utilizzare 6 piastre di pozzo con una profondità di 16 mm (specificata in Table of Materials).
2. Polacco i cerchi dei fori (soprattutto sul lato superiore) utilizzando un trapano elettrico con una punta di perforazione controsinkttrice, un bisturi, o un coltello affilato.
3. Sterilizzare le piastre nel 70% di etanolo per almeno 1 h.
4. Lavare le piastre in acqua a due distillati ad autoclave e lasciarle asciugare in condizioni sterili.
5. Lavare accuratamente il vetro da 22 mm x 22 mm copre le labbra con il 70% di etanolo o pulirle secondo il protocollo pubblicato da Saarela et al.¹¹.
6. Incollare i copricapi sul lato superiore dei fori in 6 piastre di pozzo utilizzando una colla di tessuto non tossico. Applicare la colla intorno al foro e posizionare delicatamente il coperchio per coprirlo. Lasciare asciugare la colla.
7. Ispezionare le piastre sotto uno stereomicroscopio e rimuovere la colla essiccata in eccesso dalla superficie dei coprinti, se necessario.
   NOTA: Verificare che non vi sia alcuna colla sopra il coperchio per garantire una compressione uniforme dei campioni.
8. Mescolare le perline di polistirolo (dimensione delle particelle di 70 m) con un volume uguale di idrogel. È sufficiente un volume di 50-100 l per pozzo.
   NOTA: Mantenere la miscela di perline di idrogel e polistirolo sul ghiaccio.
9. Posizionare un inserto transwell sotto un microscopio dissetante con la membrana verso l'alto.
10. Disporre i campioni (ad esempio, reni embrionali ex vivo o organoidi renali) in modo uniforme sulla membrana.
11. Aggiungere con attenzione la miscela di perline di idrogel/polistirolo accanto ai campioni per evitare danni ai tessuti fragili.
12. Capovolgere l'inserto transwell in modo che la membrana con i campioni assemblati su di esso sia rivolta verso il basso.
13. Posizionare delicatamente l'inserto in un pozzo della piastra del pozzo modificato 6 e premere delicatamente verso il basso in modo che i campioni sono compressi al livello delle perline.
    NOTA: Seguire l'avanzamento della compressione utilizzando un microscopio.
14. Tenere l'inserto leggermente premuto al pozzo con una mano e fissarlo alla piastra fondendo la plastica con un ferro da saldatura in tre punti alla periferia dell'inserto.
15. Quando l'inserto è fissato alla piastra, aggiungere 2 mL di mezzo di coltura (DMEM/10% FBS/1% penicillina-streptomycin) al pozzo e continuare ad assemblare i pozzi rimanenti nella piastra nello stesso modo.
16. Trasferire la piastra finita su un'incubatrice in scena di un microscopio invertito per l'imaging time-lapse.
17. Eseguire l'imaging time-lapse dei campioni utilizzando le impostazioni sperimentali appropriate.
    NOTA: La modifica del supporto di coltura nei pozzetti della piastra durante gli esperimenti time-lapse non è necessaria, ma può essere facilmente eseguita attraverso i fori sui lati dell'inserto.

Risultati

Il protocollo di coltura CAM qui presentato ha permesso una vascolarizzazione altamente efficiente degli organoidi renali e dei reni embrionali come risultato dello xenotrapianto su CAM di pollo(Figura 1, Film 1). I minicarri contenenti mezzi di coltura fornivano nutrienti al tessuto donatore e lo proteggevano dall'essiccazione durante il periodo di tempo precedente a una corretta vascolarizzazione. Questo metodo ha fornito condizioni permissive per la crescita delle cellule...

Discussione

Vengono presentati due protocolli dettagliati che perfezionano il metodo classico della coltura organotipica renale e consentono la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging 4D ottimale (ad esempio, immagine e tempo 3D) di reni embrionali e organoidi ex vivo. In questa sezione vengono evidenziati i passaggi critici dei metodi e vengono illustrati i problemi.

La differenza significativa tra altri metodi di coltura CAM e questo metodo di coltura CAM del pollo migliorato è l'uso di minis...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610