Metodi standardizzati per misurare l'induzione della risposta agli urti di calore in Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Qui, vengono presentati protocolli standardizzati per valutare l'induzione della risposta agli shock termici (HSR) in Caenorhabditis elegans utilizzando RT-qPCR a livello molecolare, reporter fluorescenti a livello cellulare e termorecupero a livello di organismo.

Abstract

La risposta allo shock termico (HSR) è una risposta allo stress cellulare indotta da misfolding di proteine citosoliche che funziona per ripristinare l'omeostasi pieghevole delle proteine, o proteostasi. Caenorhabditis elegans occupa una nicchia unica e potente per la ricerca HSR perché l'HSR può essere valutato a livello molecolare, cellulare e dell'organismo. Pertanto, i cambiamenti a livello molecolare possono essere visualizzati a livello cellulare e il loro impatto sulla fisiologia può essere quantificato a livello dell'organismo. Mentre i test per misurare l'HSR sono semplici, le variazioni nella tempistica, nella temperatura e nella metodologia descritte nella letteratura rendono difficile confrontare i risultati tra gli studi. Inoltre, questi problemi fungono da barriera per chiunque cerchi di incorporare l'analisi HSR nella loro ricerca. Qui, viene presentata una serie di protocolli per misurare l'induzione dell'HSR in modo robusto e riproducibile con RT-qPCR, giornalisti fluorescenti e un test di termorecupero a effetto organismo. Inoltre, mostriamo che un saggio di termotolleranza ampiamente usato non dipende dal regolatore principale ben consolidato dell'HSR, HSF-1, e quindi non deve essere utilizzato per la ricerca HSR. Infine, vengono discusse le variazioni di questi saggi presenti nella letteratura e vengono proposte le migliori pratiche per aiutare a standardizzare i risultati in tutto il settore, facilitando in ultima analisi la ricerca sulle malattie neurodegenerative, sull'invecchiamento e sull'HSR.

Introduzione

La risposta di shock termico (HSR) è una risposta universale allo stress cellulare indotta da un misfolding delle proteine citosoliche causato da aumenti di temperatura e altri stress proteotossici. L'attivazione dell'HSR in Caenorhabditis elegans porta alla regolazione trascrizionale dei geni shock termici come hsp-70 e hsp-16.2. Molte proteine da shock termico (HSP) funzionano come chaperones molecolari che ripristinano l'omeostasi pieghevole delle proteine, o proteostasi, interagendo direttamente con proteine piegate in modo non corretto o danneggiate. Il regolatore principale dell'HSR è il fattore di trascrizione Heat Shock Factor 1 (HSF-1), la cui attivazione è elegantemente controllata tramite più meccanismi¹.

Il ruolo di HSF-1 non è limitato allo stress. HSF-1 è necessario per la crescita normale e lo sviluppo, come la delezione di hsf-1 porta all'arresto larvale². HSF-1 è importante anche durante l'invecchiamento e le malattie neurodegenerative legate all'età caratterizzate dall'accumulo di aggregati proteici e dall'incapacità di mantenere la proteostasi. La caduta di hsf-1 causa l'accumulo di aggregati proteici e una durata ridotta, mentre la sovraespressione di hsf-1 riduce l'aggregazione delle proteine e prolunga la durata della vita^3,4. Pertanto, la regolazione dell'HSF-1 a livello molecolare ha ampie implicazioni per la fisiologia e la malattia dell'organismo.

C. elegans è un potente organismo modello per la ricerca HSR perché l'HSR può essere misurato ai livelli molecolari, cellulari e dell'organismo^4,5,6. Evidenziando la potenza di questo modello, sono stati scoperti i progressi chiave nel delineare il percorso HSR, come le differenze specifiche dei tessuti nella regolazione HSR, in C. elegans^7,8. Inoltre, C. elegans è ampiamente utilizzato per la ricerca sull'invecchiamento ed è un sistema emergente per la modellazione di malattie legate all'interruzione della proteostasi.

Anche se gli esperimenti di shock termico con C. elegans possono essere rapidi e riproducibili, ci sono diverse domande da considerare prima di iniziare. Ad esempio, quale temperatura deve essere utilizzata per l'induzione dell'HSR e per quanto tempo devono essere esposti i vermi? È meglio usare un'incubatrice asciutta o un bagno d'acqua? Quale fase di sviluppo deve essere utilizzata? Sfortunatamente, le metodologie utilizzate per studiare l'HSR variano ampiamente da laboratorio a laboratorio, causando confusione nella scelta delle migliori metodologie e rendendo difficile confrontare i risultati in tutto il campo.

Vi presentiamo protocolli robusti e standardizzati per l'utilizzo di RT-qPCR, giornalisti fluorescenti e termorecovery per misurare l'HSR. Sebbene questi tre approcci siano complementari, ognuno di essi presenta vantaggi e svantaggi unici. Ad esempio, RT-qPCR è la misurazione più diretta e quantitativa dell'HSR, e questo test può essere facilmente ampliato per includere molti diversi geni inducibili da shock termico. Tuttavia, RT-qPCR è il più costoso, può essere tecnicamente difficile e richiede l'uso di attrezzature specializzate. Al contrario, i reporter fluorescenti hanno il vantaggio di misurare le differenze specifiche dei tessuti nell'induzione dell'HSR. Tuttavia, sono difficili da quantificare con precisione, possono misurare solo l'induzione al di sopra di una certa soglia e richiedono l'uso di un microscopio a fluorescenza. Inoltre, i ceppi di reporter qui descritti sono in ritardo dello sviluppo rispetto al ceppo N2 standard. Anche se sono disponibili ceppi di reporter più recenti contenenti transgeni a copia singola, non sono stati testati qui⁹. Il terzo saggio, thermorecovery, ha il vantaggio di fornire una lettura fisiologicamente rilevante a livello di organismo. Tuttavia, questo saggio è probabilmente il meno sensibile e più indiretto. Infine, discutiamo di alcune variazioni comuni trovate in questi saggi e proponiamo una serie di migliori pratiche per facilitare la ricerca in questo campo.

Protocollo

1. Manutenzione e sincronizzazione di C. elegans

1. Mantenere i vermi a 20 gradi centigradi sulle piastre Nematode Growth Medium (NGM) seminata con op50 Escherichia coli batteri dal trasferire diversi adulti a piastre fresche circa 2x a settimana¹⁰. Occorre prestare attenzione per evitare che i vermi esauriscano il cibo, perché questo può influenzare la loro fisiologia¹¹.
   1. Preparazione di piastre NGM.
      1. Mescolare 3 g di NaCl, 2,5 g di Bacto-peptone, 20 g di agar, e deionizzato (DI) H₂O fino a 1 L in un flacone.
      2. Autoclave la miscela per la sterilizzazione.
      3. Lasciar raffreddare la miscela fino a 50 gradi centigradi.
      4. Aggiungere 25 mL di 1 M KH₂PO₄ (pH e 6), 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO₄e 1 mL di colesterolo (5 mg/mL nel 100% di etanolo).
      5. Utilizzando la tecnica sterile, versare la miscela in piastre di 6 cm per produrre circa 100 piastre. Versare piastre è più facile se la miscela viene prima trasferita a un becher sterile da 300 mL.
      6. Lasciare solidificarsi di 1 giorno a temperatura ambiente (RT) prima di sedare con batteri o conservarli a 4 gradi centigradi.
   2. Seeding di batteri OP50 su piastre NGM.
      1. Coltivare una coltura batterica OP50 satura durante la notte in LB a 30 o 37 gradi centigradi.
      2. Collocare circa 300 - l della coltura al centro di una piastra NGM di 6 cm.
      3. Lasciare asciugare le piastre a RT per 1-3 giorni, se necessario, affinché il prato batterico aderisca alla piastra. Le piastre possono quindi essere utilizzate o conservate a 4 gradi centigradi.
2. Far crescere i vermi in modo sincrono isolando le uova appena deposte (descritte qui) o in alternativa raccogliendo le uova dopo aver sciolto i vermi con la candeggina.
   1. Trasferire circa 10 vermi adulti gravid su una piastra fresca utilizzando un plettro di filo di platino. La sincronizzazione della posa di uova funziona meglio se gli adulti sono nel primo giorno di età adulta.
   2. Dopo circa 1 h, rimuovere i vermi dalla piastra. Questo dovrebbe portare a 40-60 uova per piatto, a seconda delle condizioni e del ceppo.

2. Imaging fluorescente dei giornalisti HSR

1. Sincronizzare i vermi (sezione 1.2) e mantenere a 20 gradi centigradi fino alla fase di sviluppo desiderata. Per i ceppi di reporter fluorescenti AM446 (hsp-70p::gfp) e CL2070 (hsp-16.2p::gfp),i vermi giovani adulti che non hanno ancora raggiunto la maturità riproduttiva vengono generati 64 h dopo la sincronizzazione della deposizione delle uova.
   NOTA: I tempi di sviluppo variano a seconda del ceppo e della temperatura con cui vengono sollevati i vermi. Entrambi i ceppi di reporter HSR presentano un leggero ritardo di sviluppo rispetto a N2. È importante sottolineare che la grandezza dell'induzione dell'HSR diminuisce di circa 2-4 volte dopo l'inizio della maturità riproduttiva (vedi Discussione).
2. Riscaldare i vermi avvolgendo le piastre con pellicola di paraffina e immergersi in un bagno d'acqua circolante a 33 gradi centigradi per 1 h. Una sottile striscia di pellicola di paraffina deve essere avvolta 2 volte intorno alla piastra per sigillare i bordi. Non coprire il fondo della piastra o potrebbe interferire con il trasferimento di calore. Immergere le piastre a testa in giù utilizzando un rack provetta e un peso di piombo. Ricordarsi di includere un campione di controllo negativo (nessun shock termico) se necessario.
   NOTA: Se la pellicola di paraffina non è sicura, l'acqua entrerà nella piastra e la piastra non deve essere utilizzata per la raccolta dei dati.
3. Recuperare i vermi rimuovendo le piastre dal bagno d'acqua e asciugandoconi con un tovagliolo di carta. Rimuovere la pellicola di paraffina e incubare i vermi a 20 gradi centigradi per 6-24 h. Questo periodo di recupero consente un tempo sufficiente per la sintesi e la riduzione GFP prima dell'imaging.
4. Preparare i vetrini per l'imaging. Le diapositive devono essere preparate fresche per ogni uso.
   1. Fare una soluzione di agarose 3% in acqua e calore utilizzando un forno a microonde fino a quando l'agarose è sciolto.
   2. Posizionare un vetrino per l'imaging tra altri due vetrini del microscopio che hanno una striscia di nastro da laboratorio su di essi per creare un distanziale per il pad agarose.
   3. Utilizzando una pipetta da 1.000 luna, collocare una goccia (150 dollaril) del 3% riscaldato agarose al centro del vetrino del microscopio.
   4. Coprire immediatamente il vetrino del microscopio con un vetrino vuoto perpendicolare alla prima diapositiva in modo che il vetrino superiore poggia sul nastro di laboratorio sui vetrini adiacenti. Questo si diffonde la goccia di agarose per creare un pad di larghezza uniforme.
   5. Rimuovere con attenzione la diapositiva superiore.
5. Immobilizzare i vermi utilizzando una pipetta da 200 luna per aggiungere una piccola goccia di 1 mM levamisole in tampone M9 al centro del cuscinetto agarose. Quindi trasferire 10 vermi nella goccia di levamisole utilizzando un plettro di filo di platino. Coprire con una copertina. Sigillare il coperchio non è necessario per un microscopio verticale. Facoltativamente, i vermi possono essere allineati quando diventano paralizzati diffondendo la levamisole fuori, all'esterno del pad agarose e allineando i vermi con un plettro di filo di platino. In alternativa, il levamisole può essere imbevuto utilizzando una salvietta di laboratorio.
   NOTA: Immagine il più presto possibile, perché l'incubazione prolungata in levamisole potrebbe alterare la fluorescenza.
6. Immaginare i vermi utilizzando un microscopio a fluorescenza. I dettagli dell'acquisizione delle immagini variano in base al microscopio e al software.
   NOTA: per confrontare direttamente le intensità dell'immagine, utilizzare impostazioni del microscopio identiche in una sessione di imaging. Evitare di sovrasaturare l'immagine.

3. Misurazione dell'espressione genica HSR con RT-qPCR

1. Sincronizzare i vermi (sezione 1.2) e mantenere a 20 gradi centigradi fino alla fase di sviluppo desiderata. Per i vermi N2, i vermi giovani adulti che non hanno ancora raggiunto la maturità riproduttiva vengono generati 60 h dopo la sincronizzazione della deposizione delle uova.
   NOTA: I tempi di sviluppo variano a seconda del ceppo e della temperatura con cui vengono sollevati i vermi. È importante sottolineare che la grandezza dell'induzione dell'HSR diminuisce di circa 2-4 volte dopo l'inizio della maturità riproduttiva (vedi Discussione).
2. I vermi d'urto di calore come descritto al punto 2.2.
3. Togliere i piatti dal bagno d'acqua, rimuovere la pellicola di paraffina e raccogliere immediatamente i vermi. I vermi possono essere raccolti lavando delicatamente le piastre con 1 mL di M9, raccogliendo il liquido in un tubo di microcentrifuga, e quindi rimuovendo l'M9 dopo la centrifuga a 400 x g per 1 min.
4. Lyse i vermi e purificare l'RNA utilizzando l'estrazione organica.
   1. Aggiungete 250 l di reagente di isolamento dell'RNA (vedere Tabella dei materiali).
   2. Tubi Vortex a mano per 30 s.
   3. Tubi di vortice per 20 min a 4 gradi centigradi utilizzando un attacco del tubo di microcentrifuga (vedere Tabella dei materiali).
   4. Aggiungere 50 - L di cloroformio.
   5. Vortice per 30 s.
   6. Incubare i campioni a RT per 3 min.
   7. Centrifuga a 14.000 dollari x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
   8. Trasferire lo strato acquoso (cioè lo strato superiore, 125 dollari l) in un nuovo tubo di microcentrismo.
      NOTA: Evitare lo strato organico e il materiale nell'interfaccia.
   9. Aggiungere 50 - L di cloroformio.
   10. Vortice per 30 s.
   11. Incubare i campioni a RT per 3 min.
   12. Centrifuga a 14.000 dollari x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   13. Trasferire lo strato acquoso (100 dollari l) in un nuovo tubo di microcentrifuga.
       NOTA: Evitare lo strato organico e il materiale nell'interfaccia.
   14. RNA precipitato con un volume uguale (cioè 100 l) di isopropanolo.
   15. Incubare a -20 gradi centigradi per almeno 30 min, ma preferibilmente durante la notte.
       NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui e l'RNA può essere conservato a -20 gradi centigradi.
   16. Pellet l'RNA per centrifugazione a 14.000 dollari x g per 30 dollari a 4 gradi centigradi.
   17. Rimuovere la maggior parte del supernatante possibile senza disturbare il pellet.
       NOTA: il pellet sarà piccolo e potrebbe non essere visibile. Il pellet potrebbe non aderire saldamente al lato del tubo, quindi è necessario prestare attenzione per evitare di slato.
   18. Lavare il pellet con un valore di etanolo a freddo ghiaccio del 70% realizzato con H₂O senza RNase.
   19. Centrifuga a 14.000 dollari x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   20. Rimuovere il maggior numero possibile di supernatali senza disturbare il pellet.
   21. Eseguire un giro rapido a RT per rimuovere il 70% di etanolo rimanente.
   22. Asciugare il pellet lasciando i tubi aperti a RT per tutto il tempo necessario; in genere almeno 20 min. Tubi possono essere coperti con un tessuto privo di lafo o un foglio di alluminio per evitare la contaminazione.
   23. Risospendere il pellet in 20.L di H₂O senza RNase.
   24. Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro di piccolo volume (2 l).
       NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui e l'RNA può essere temporaneamente immagazzinato a o al di sotto di -20 gradi centigradi.
5. Rimuovere il DNA residuo incubando con DNase I. Si consiglia di utilizzare un kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) e di seguire le istruzioni del produttore.
   1. Con questo kit, preparate una reazione di 20 gradi con 500 ng di RNA e 1 L di DNase I in un bagno d'acqua a 37 gradi per 30 min.
   2. Aggiungere 2,5 lofoni di reagente di inattivazione DNase (incluso nel kit) ad ogni campione e incubare a RT per 5 min con occasionali sfarfallio/vortice.
   3. Girare verso il basso a 14.000 x g per 2 min.
   4. Senza disturbare il pellet bianco, trasferire 15 gradi l di super-natant in un microtubo fresco per la sintesi cDNA.
6. Condurre sintesi cDNA. Si consiglia di utilizzare un kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) e di seguire le istruzioni del produttore.
   1. Con il kit, preparate una reazione di 20 l con 15 gradi di RNA Trattato d'Uomo di DNase dal passo precedente e 1 -L di trascrizione inversa.
   2. Utilizzare il seguente programma per la sintesi cDNA: 25 gradi centigradi per 5 min, 46 gradi centigradi per 20 min, 95 gradi centigradi per 1 min, 4 gradi centigradi.
   3. Diluire il cDNA aggiungendo 80 -L di RNase-free H₂O direttamente al campione.
   4. Vortice brevemente, poi girare verso il basso e conservare a -20 gradi centigradi fino a quando necessario.
7. Eseguire qPCR. Si consiglia di utilizzare un kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) e di seguire le istruzioni del produttore.
   1. Con il kit, preparate una reazione di 25 L contenente 2 gradi di cDNA e 200 nM (ciascuno) di primer in avanti e indietro in un pozzo di una piastra di 96 pozzetti.
   2. Le sequenze primer per la misurazione dei geni dello shock termico, hsp-70 e hsp-16.2e 18S rRNA (per un controllo di normalizzazione) sono elencate nella Tabella dei Materiali. È possibile utilizzare più controlli di normalizzazione come desiderato.
   3. Campioni cDNA diluiti 50x prima della misurazione di 18S per garantire che il saggio sia nella gamma lineare. Le condizioni qPCR appropriate variano a seconda del kit e dei primer utilizzati (vedere Risultati rappresentativi).
   4. Utilizzare un sistema di rilevamento PCR in tempo reale (vedere Tabella dei materiali) per qPCR con 40 cicli di 95 s per la denaturazione a 5 s, 58 gradi centigradi per l'annessione 30 e 72 gradi per l'estensione di 30 s.
      NOTA: Le temperature ottimali di annealing possono variare in base ai primer e alle condizioni.
   5. Quantifica utilizzando il metodo di curva tura standard¹².

4. Valutazione termorecovery per misurare l'HSR a livello di organismo

1. Sincronizzare i vermi (sezione 1.2) e mantenere a 20 gradi centigradi fino alla fase di sviluppo desiderata. Per i vermi N2, i vermi giovani adulti che non hanno ancora raggiunto la maturità riproduttiva vengono generati 60 h dopo la sincronizzazione della deposizione delle uova.
   NOTA: I tempi di sviluppo variano a seconda del ceppo e della temperatura con cui vengono sollevati i vermi. È importante sottolineare che la grandezza dell'induzione dell'HSR diminuisce di circa 2-4 volte dopo l'inizio della maturità riproduttiva (vedi Discussione).
2. Il calore scuote i vermi come descritto al punto 2.2 per 6 h.
3. Togliere le piastre dal bagno d'acqua, rimuovere la pellicola di paraffina e lasciare che i vermi si riprendano per incubazione a 20 gradi centigradi per 48 h.
4. Contare il numero di vermi che possono strisciare immediatamente via dopo la stimolazione meccanica senza movimento a scatti o paralisi.
   NOTA: L'incubazione da 6 h è ottimale per esaminare le condizioni che riducono il termorecupero, ma potrebbero essere necessari tempi di esposizione più lunghi per cercare condizioni che migliorano il termorecupero.

Risultati

Utilizzando i protocolli descritti in questo manoscritto, l'induzione hSR è stata misurata utilizzando reporter fluorescenti, RT-qPCR e saggi termorecovery. In ogni caso, la procedura nella sezione 1.2 è stata utilizzata per generare vermi di giovani adulti sincronizzati che non avevano raggiunto la maturità riproduttiva.

Per visualizzare l'induzione HSR a livello cellulare, sono stati analizzati i ceppi di reporter fluorescenti AM446 (hsp-70p::gfp) e CL2070 (hsp-16.2p::gfp) dopo la sezione 2 del protocollo. Nei campioni di controllo negativi senza shock termico, il reporter hsp-16.2 mostrava solo la normale autofluorescenza, ma il reporter hsp-70 aveva fluorescenza coniugale nel muscolo depressore anale come precedentemente riportato⁴ (Figura 1A). Dopo 1 h di scossa di calore a 33 gradi centigradi, è stata osservata una forte fluorescenza in entrambi i reporter; tuttavia, il modello di espressione era distinto a seconda di quale reporter è stato utilizzato (Figura 1B). Il reporter hsp-70 era più luminoso nell'intestino e nella spermatheca, mentre il reporter hsp-16.2 era più luminoso nella pharynx. Inoltre, il reporter hsp-16.2 aveva un alto grado di variabilità worm-to-worm nella quantità di induzione come descritto in precedenza, ma il reporter hsp-70 non ha¹³.

Una variante comunemente utilizzata della sezione 2 è quella di eseguire lo shock termico in un'incubatrice secca invece di un bagno d'acqua circolante. Pertanto, è stata anche testata la differenza tra le due metodologie. Si è scoperto che entrambi i protocolli hanno portato a una robusta induzione dei due reporter fluorescenti utilizzando le nostre condizioni, anche se un bagno d'acqua circolante è raccomandato come best practice (vedi Discussione) (Figura 1B).

Per testare la dipendenza dei reporter dal fattore di trascrizione HSF-1, l'RNAi di alimentazione è stato utilizzato per abbattere hsf-1 prima che l'induzione del reporter fosse misurata. Si è constatato che la fluorescenza di entrambi i ceppi è stata gravemente ridotta al momento del knockdown HSF-1, indicando che questi giornalisti sono dipendenti dall'HSF-1 come descritto nella letteratura⁴ (Figura 2). Tuttavia, è stato anche osservato che la fluorescenza faringea leale persisteva in entrambi i giornalisti al knockdown di hsf-1, il che è coerente con i rapporti precedenti che il muscolo fantasmangeale è resistente all'RNAi alimentando¹⁴.

Per quantificare l'induzione dell'HSR a livello molecolare, due HSP endogeni sono stati misurati con RT-qPCR utilizzando la sezione 3 del protocollo. I campioni sono stati misurati in triplice copia, è stata generata una curva standard per ciascuno dei primer ed è stata analizzata una curva di fusione per ogni campione per il controllo di qualità. Si è scoperto che uno shock termico di 33 gradi centigradi per 1 h ha provocato un aumento di oltre 2.000 volte nell'espressione relativa per due geni dello shock termico, hsp-70 e hsp-16.2 (Figura 3). Questi risultati mostrano che entrambi i geni endogeni sono adatti per misurare l'induzione di HSR e che uno shock termico di 33 gradi centigradi per 1 h è sufficiente a generare una risposta sostanziale. Tuttavia, è necessario prestare attenzione nell'interpretare il grado assoluto di induzione degli urti di calore, perché i livelli di mRNA in assenza di shock termico sono molto bassi.

Per analizzare una risposta fisiologica allo shock termico, è stato testato un test del termorecupero dell'organismo utilizzando la sezione 4 del protocollo. Si è scoperto che l'esposizione dei vermi a uno shock termico di 6 h a 33 gradi centigradi ha portato a una diminuzione del 20% dei vermi con movimento normale dopo un recupero di 48 h (Figura 4A). La dipendenza di questo test dal fattore di trascrizione HSF-1 è stata testata usando l'alimentazione di RNAi per abbattere hsf-1 prima di esporre i vermi allo stress. Si è scoperto che l'abbattimento di hsf-1 ha causato una drastica diminuzione del movimento normale, con >95% dei vermi che mostrano movimento a scatti o paralisi dopo essere stati spinti con un plettro di filo di platino.

Abbiamo confrontato questo saggio di termorecupero con un saggio organismo alternativo ampiamente usato comunemente indicato come termotolleranza. Nel saggio di termotolleranza, i vermi sono esposti a una temperatura continua di 35 gradi centigradi utilizzando un'incubatrice secca, e la percentuale di vermi vivi viene misurata in vari momenti. Utilizzando questo saggio, si è constatato che i vermi di controllo continuamente esposti a 35 gradi centigradi sono morti dopo circa 8 h di esposizione (Figura 4B). Tuttavia, quando la dipendenza di questo saggio su HSF-1 è stata testata utilizzando IL knockdown DI RNAi, si è scoperto che l'inibizione dell'hsf-1 non causava una diminuzione della termotolleranza. Risultati simili sono stati precedentemente mostrati utilizzando mutazioni HSF-1 (vedi Discussione). Pertanto, l'uso del saggio di termotolleranza per misurare l'HSR non è raccomandato, e il termorecupero è il metodo preferito per esaminare l'HSR a livello di organismo.

Figura 1: induzione HSR misurata con reporter fluorescenti. (A) L'espressione basale e(B)inducibile dal calore di hsp-70p::gfp e hsp-16.2p::gfp reporter ceppi dopo 1 h di shock termico a 33 gradi centigradi in un bagno d'acqua o incubatrice. I vermi sono stati allevati sui batteri OP50 per 64 h, riscaldati dal calore, e poi recuperati a 20 gradi centigradi per 8 h prima dell'imaging. Per riferimento, i vermi non di shock termico in (A) sono stati rinormalizzati in (B) in modo che corrispondano alla gamma e alla saturazione dei vermi riscaldati. Vengono mostrate immagini rappresentative di due repliche sperimentali. Barra di scala 250 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: l'induzione dell'HSR misurata con i reporter fluorescenti dipende dall'HSF-1. Le cinghie contenenti i reporter hsp-70p::gfp e hsp-16.2p::gfp sono stati sollevati a controllo (l4440 vettore vuoto) o piastre rnsf-1 RNAi per 64 h, esposte a uno shock termico di 1 h a 33 gradi centigradi in un bagno d'acqua, e poi recuperate a 20 gradi centigradi per 8 h prima dell'imaging. Vengono mostrate immagini rappresentative di due repliche sperimentali. Barra di scala 250 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: induzione HSR misurata con RT-qPCR. I vermi N2 sono stati allevati sui batteri HT115 per 60 h e poi il calore ha scioccato per 1 h in un bagno d'acqua a 33 gradi centigradi. I livelli relativi di mRNA di hsp-70 (C12C8.1) e hsp-16.2 sono mostrati normalizzati al controllo senza shock termico. I valori tracciati sono la media di quattro repliche biologiche e le barre di errore rappresentano : SEM. La rilevanza statistica è stata calcolata utilizzando un test t di Student non accoppiato. < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: La termorecovery, ma non la termotolleranza, dipende dall'HSF-1. I vermi N2 sono stati allevati sulle piastre di controllo (L4440) o hsf-1 rUM per 60 h e poi spostati su uno dei due: (A) A 33S C bagnodum d'acqua per 6 h e recuperati a 20 gradi centigradi per 48 h prima di segnare per il movimento normale (termorecupero), o (B) A 35 gradi secco incubatore e rimosso ogni 2 h fino a morto (termotolleranza). Ogni saggio è stato fatto con n - 30 individui su 2 giorni indipendenti. Viene visualizzata la media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Nella letteratura sono state utilizzate un'ampia varietà di temperature, tempi e attrezzature per testare l'HSR, che ha introdotto inutili avvertimenti e ha portato a difficoltà nel confrontare i risultati tra i laboratori. Ad esempio, sono state utilizzate temperature che vanno da 32-37 gradi centigradi e sono state utilizzate temperature che vanno da 32-37 gradi centigradi e sono state utilizzate temperature che vanno da 32-37 gradi centigradi e sono state utilizzate temperature che vanno da 32-37 gradi centigradi e tempi da 15 minuti a diverse ore sono state utilizzate per indurre l'HSR¹⁵. Tuttavia, si dice che la letalità si verifica già 3 h a 37 gradi centigradi per tutte le fasi e 1,5 h per il giorno 1 adulti¹⁵. Inoltre, dimostriamo che l'esposizione dei vermi a 35 gradi centigradi causa letalità che non dipende dall'HSF-1, rendendo queste condizioni poco adatte per l'analisi dell'HSR. Al contrario, uno shock termico di 33 gradi centigradi per 1 h è abbastanza robusto da provocare una forte induzione di geni da shock termico, ma abbastanza delicato da non influenzare la vitalità del verme. Infatti, l'esposizione a 33 gradi centigradi fino a 6 h provoca solo il 20% dei vermi per mostrare un movimento anormale. Pertanto, proponiamo di utilizzare una temperatura di 33 gradi centigradi e un tempo di 1 h come condizione standardizzata per RT-qPCR e saggi reporter fluorescenti.

Recenti esperimenti hanno rivelato che la messa in scena dello sviluppo di vermi per esperimenti HSR è particolarmente importante. È stato recentemente dimostrato che in C. elegans l'inducibilità della HSR diminuisce (cioè collassa) di >50% quando gli ermafroditi iniziano la deposizione delle uova⁵. Mettere correttamente in scena i vermi è fondamentale perché ci sono spesso differenze nei tempi di sviluppo nei ceppi che trasportano mutazioni. Se vengono utilizzati mutanti sensibili alla temperatura, questo avrà anche un impatto sui risultati se non sono sincronizzati con la loro età riproduttiva. Pertanto, si raccomanda di misurare attentamente l'insorgenza della deposizione delle uova per ogni ceppo per determinare quando si verifica il crollo. La finestra di tempo dopo la muta L4 e prima dell'inizio della maturità riproduttiva è stretta; pertanto, è necessario prestare attenzione affinche il collasso dell'HSR non causi inavvertitamente la variabilità nei risultati.

Oltre alla tempistica dello sviluppo, variazioni di temperatura sorprendentemente piccole, appena 1 gradi centigradi, possono avere effetti sostanziali sull'HSR. Ad esempio, i neuroni termosensoriici in C. elegans sono sensibili ai cambiamenti di temperatura fino a 0,05 c¹⁶. Pertanto, è imperativo utilizzare un termometro in grado di misurare con precisione la temperatura. Pertanto, proponiamo come migliore pratica l'uso di un dispositivo calibrato per la misurazione della temperatura che sia sufficientemente preciso da misurare le temperature entro 0,1 gradi centigradi. Inoltre, un termometro con una funzionalità di registrazione dei dati dovrebbe essere utilizzato per misurare le variazioni di temperatura nel tempo. Molti incubatori sono specificati per avere variazioni termiche superiori a 1 sC in diverse parti dell'incubatrice e nel tempo, che possono avere effetti significativi sugli esperimenti HSR. Come procedura consigliata, si consiglia di utilizzare incubatori che dispongono di isolamento e circolazione sufficienti per ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura. Per condurre esperimenti di shock termico, proponiamo una best practice per un bagno d'acqua circolante. Il tempo necessario per una piastra di agar per raggiungere una temperatura desiderata è di circa 6-7 min in un bagno d'acqua, ma molto più a lungo in un'incubatrice secca^15,17. Tuttavia, se non è disponibile un bagno d'acqua circolante, abbiamo dimostrato che la robusta induzione di HSR si verifica anche in un'incubatrice secca utilizzando le nostre condizioni. Se si utilizza un'incubatrice asciutta, l'apertura dell'incubatrice per la durata dello stress deve essere ridotta al minimo.

È noto che l'induzione dei geni dello shock termico dipende dal regolatore principale dell'HSR, HSF-1. Qui, presentiamo la prova che i due saggi più indiretti, reporter fluorescenti e termorecovery, dipendono anche da HSF-1. Significativamente, abbiamo scoperto che un saggio organismole alternativo comunemente usato, la termotolleranza, non è dipendente da HSF-1 utilizzando hsf-1 RNAi (Figura 4). Risultati simili sono stati precedentemente riportati utilizzando un mutante hsf-1 o un mutante ttx-3, che blocca l'HSR^18,19,20. Insieme, questi risultati indicano che l'esempio di termotolleranza non deve essere utilizzato per la ricerca HSR. Inoltre, ciò suggerisce che una best practice è quella di testare la dipendenza da HSF-1 per qualsiasi saggio utilizzato per misurare l'HSR.

Nel loro insieme, presentiamo una serie di protocolli standardizzati e best practice per la misurazione robusta e riproducibile dell'induzione HSR in C. elegans. Ci auguriamo che queste metodologie riducano la variabilità negli esperimenti HSR e aumentino la riproducibilità. Facilitare il confronto diretto della ricerca HSR tra laboratori servirà ad accelerare la ricerca nel campo dell'HSR. Inoltre, la standardizzazione andrà a beneficio della ricerca sull'invecchiamento e sulle malattie neurodegenerative con cui l'HSR è intimamente associata.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18S-forward primer			TTGCGTCAACTGTGGTCGTG
18S-reverse primer			CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))]	Morimoto lab	http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/
C12C8.1-forward primer			GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT
C12C8.1-reverse primer			ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855200
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	https://cgc.umn.edu/
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD	Lascar	EL-USB-TP-LCD
Greenough Stereo Microscope S9i Series	Leica
Hard Shell 96 Well PCR Plates	Bio Rad	HSS9601
hsp-16.2-forward primer			ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC
hsp-16.2-reverse primer			CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio Rad	1708891
iTaq Universal Sybr Green Super Mix	Bio Rad	1725121
Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	Eclipse 90i
MultiGene OptiMax Thermo Cycler	Labnet	TC9610
N2 (WT)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	https://cgc.umn.edu/
Nanodrop Lite Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-LITE
Parafilm M Roll	Bemis	5259-04LC
RapidOut DNA Removal Kit	Thermo Scientific	K2981
Recirculating Heated Water Bath	Lauda Brinkmann	RE-206
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer	Fisher Scientific	15-081-103
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026	RNA isolation reagent
TurboMix Attachment	Scientific Industries	SI-0564
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236