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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo utilizzato un protocollo di campionamento geologico (coring) per procurare campioni ossei corticali di dimensioni uniformi per esperimenti SRμCT dall'aspetto anteriore della femora umana. Questo metodo è minimamente distruttivo, efficiente, si traduce in campioni cilindrici che riducono al minimo gli artefatti di imaging da forme campione irregolari e migliorano la visualizzazione e l'analisi microarchitettonica.

Abstract

L'osso è un tessuto dinamico e meccanicamente attivo che cambia struttura nel corso della vita umana. I prodotti del processo di rimodellamento osseo sono stati studiati sostanzialmente utilizzando tecniche bidimensionali tradizionali. I recenti progressi nella tecnologia di imaging a raggi X attraverso la tomografia micro-computerizzata desktop (μCT) e la tomografia micro-computerizzata a radiazione di sincrotrone (SRμCT) hanno permesso l'acquisizione di scansioni tridimensionali (3D) ad alta risoluzione di un campo visivo più ampio (FOV) rispetto ad altre tecniche di imaging 3D (ad esempio, SEM) fornendo un quadro più completo delle strutture microscopiche all'interno dell'osso corticale umano. Il campione deve essere centrato accuratamente all'interno del FOV, tuttavia, per limitare la comparsa di artefatti striati noti per influire sull'analisi dei dati. Studi precedenti hanno riportato l'approvvigionamento di blocchi ossei rettilinei di forma irregolare che si traducono in artefatti di imaging dovuti a bordi irregolari o troncamento dell'immagine. Abbiamo applicato un protocollo di campionamento geologico (coring) per procurare campioni di nucleo osseo corticale di dimensioni costanti per esperimenti SRμCT dall'aspetto anteriore della femora umana. Questo metodo di coring è efficiente e minimamente distruttivo per i tessuti. Crea campioni cilindrici uniformi che riducono gli artefatti di imaging per natura di essere isometrici durante la rotazione e forniscono una lunghezza uniforme del percorso per i raggi X durante la scansione. L'elaborazione delle immagini dei dati tomografici a raggi X di campioni cored e di forma irregolare conferma il potenziale della tecnica per migliorare la visualizzazione e l'analisi della microarchitettura ossea corticale. Un obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo affidabile e ripetibile per l'estrazione di nuclei ossei corticali adattabili per vari tipi di esperimenti di imaging osseo ad alta risoluzione. Un obiettivo generale del lavoro è quello di creare un approvvigionamento osseo corticale standardizzato per SRμCT che sia conveniente, coerente e diretto. Questa procedura può essere ulteriormente adattata dai ricercatori in campi correlati che comunemente valutano materiali compositi duri come in antropologia biologica, geoscienze o scienze dei materiali.

Introduzione

Con i recenti progressi nella tecnologia di imaging, è ora possibile acquisire dati di imaging a raggi X con una risoluzione molto elevata. I sistemi micro-CT desktop (μCT) sono lo standard attuale per l'imaging dell'osso cancello a causa della loro natura non distruttiva1. Quando si imagingno caratteristiche microstrutturali dell'osso corticale, tuttavia, l'uso di μCT è stato più limitato. A causa di vincoli di risoluzione, i sistemi desktop non possono raggiungere la risoluzione richiesta per l'immagine di caratteristiche microstrutturali più piccole dei pori corticali, come le lacune osteocite. Per questa applicazione, SRμCT è ideale grazie alla maggiore risoluzione di questi sistemi1. Ad esempio, esperimenti presso la Canadian Light Source (CLS) sulle linee di fascio BMIT (BioMedical Imaging and Therapy)2 hanno prodotto immagini con voxel di dimensioni fino a 0,9 μm. Studi precedenti1,3,4,5 hanno utilizzato questa risoluzione per acquisire proiezioni e successivi rendering tridimensionali (3D) da campioni ossei corticali da ossa lunghe umane ( Figura1) per quantificare la densità lacunare degli osteociti4,6,7,8,9 e la variazione della forma lacunare e della dimensione3 nella durata della vita umana e tra i sessi. Ulteriori studi hanno dimostrato la presenza di bande osteoniche nell'uomo10, un fenomeno precedentemente riconosciuto come associato solo a mammiferi non umani nella letteratura antropologica forense.

Per ottenere una risoluzione eccezionale, il fascio di raggi X deve essere finemente focalizzato all'interno del campo visivo (FOV), che spesso limita la dimensione massima del campione a pochi millimetri di diametro. Attualmente, non ci sono state procedure complete e standardizzate descritte nella letteratura che delineano l'approvvigionamento di campioni ossei che soddisfano queste restrizioni. Centrare i campioni all'interno del FOV è fondamentale per garantire che 1) il campione rimanga centrato mentre ruota di 180 ° durante l'imaging e 2) gli artefatti di scansione siano limitati poiché non vi è troncamento dell'immagine. In altre parole, nessuna porzione del campione al di fuori del FOV interferisce con il fascio che entra nel suo punto focale all'interno del FOV. In questo caso, l'algoritmo di ricostruzione viene privato di alcuni dei dati di attenuazione necessari per una ricostruzione completamente corretta. Vale inoltre la pena notare che le scansioni a 360° (rotazione completa) riducono al minimo gli effetti dell'indurimento del fascio ma aumentano gli artefatti causati dal disallineamento e dal movimento del campione durante l'imaging. Pertanto, mentre una scansione a 360 ° genererà in genere dati più puliti, il tempo di imaging viene raddoppiato e quindi è necessario affrontare un compromesso tra costi sperimentali e qualità dei dati.

Un aspetto importante e spesso trascurato degli esperimenti di imaging osseo è la tecnica accurata e replicabile di preparazione dei campioni eseguita prima della scansione. Gli studi che incorporano metodi SRμCT nei loro esperimenti menzionano brevemente il loro protocollo di campionamento, ma gli autori forniscono pochi o nessun dettaglio riguardo alla particolare metodologia utilizzata per raccogliere i loro campioni. Molti di questi studi menzionano il taglio di blocchi ossei rettilinei di dimensioni arbitrarie, ma generalmente non forniscono ulteriori informazioni sugli utensili o sui materiali di incorporamentoutilizzati 3,4,10,11,12,13,14. Alcuni ricercatori usano comunemente strumenti rotativi portatili (ad esempio, Dremel) per rimuovere blocchi rettilinei di osso da una regione di interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Questo metodo si traduce in campioni di dimensioni non uniforme che possono essere più grandi del FOV, aumentando la probabilità di artefatti di scansione e troncamento delle immagini. Tali campioni spesso richiedono un'ulteriore raffinazione utilizzando una sega a wafer di diamante di precisione (ad esempio, Buehler Isomet). L'approvvigionamento di campioni con dimensioni coerenti (fino ai due centesimi/mm) è fondamentale per garantire che i set di dati acquisiti siano della massima qualità e che i risultati successivi siano replicabili.

La segnalazione limitata della metodologia di approvvigionamento del campione aggiunge un ulteriore livello di difficoltà quando si tenta di utilizzare e/o convalidare metodi eseguiti in uno studio precedente. Attualmente, i ricercatori devono contattare direttamente gli autori per ulteriori dettagli sulle loro procedure di campionamento. Il protocollo qui dettagliato fornisce ai ricercatori biomedici una tecnica di campionamento accuratamente documentata, replicabile ed economica. L'obiettivo principale di questo articolo è quello di fornire un tutorial completo su come procurarsi campioni di nucleo osseo corticale di dimensioni costanti utilizzando una pressa per fresatura e una punta di coring a diamante per la visualizzazione accurata e l'estrazione di dati microarchitettotechi. Questo metodo viene modificato dalle procedure utilizzate per raccogliere regolarmente cilindri uniformi di piccolo diametro (1-5 mm) da blocchi di materiali duri in meccanica delle rocce adalta pressione 15,16,17,18,19.

Protocollo

Tutti gli esemplari provengono da donatori cadaverici imbalsamato presso l'Università di Toledo, il College of Medicine and Life Sciences e la Northeast Ohio Medical University (NEOMED), con il consenso informato del donatore stesso o dei parenti prossimi del donatore. L'University of Akron Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects (IRB) ha ritenuto questi esemplari esenti dalla revisione completa dell'IRB in quanto non sono stati acquistati da individui viventi. Informazioni demografiche tra cui età, sesso e causa di morte erano disponibili per tutti i donatori. Gli individui selezionati non hanno documentato condizioni che influiscono sulle ossa né esposizione a regimi di trattamento che potrebbero aver influito sul rimodellamento osseo al momento del decesso. Campioni ossei corticali sono stati ottenuti da femora di maschi e femmine moderni cadaverici con età compresa tra 19 e 101 anni (media = 73,9 anni). L'albero medio femorale è stato ampiamente studiato includendo esami di variazione della porosità corticale20,21,22,23,24 e densità del materiale del tessutoosseo 25,26,27, ed è quindi diventato un sito comunemente usato per le analisi microstrutturali.

1. Approvvigionamento e macerazione dei tessuti

  1. Utilizzare una sega oscillante dotata di una lama in carburo da taglio a tuffo (per materiali compositi) per procurarsi blocchi ossei di ~ 7,5 cm dalle diafisi medie della femora sinistra.
  2. Immergere i blocchi femorali in un piatto di vetro sicuro per il forno riempito con un enzima proteasi in polvere e una soluzione di acqua del rubinetto per 1 h in un'incubatrice impostata a 45 °C.
  3. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura tutti i tessuti molli rimanenti e il periostio utilizzando dissezione smussata o strumenti dentali.
    NOTA: Evitare l'uso di strumenti affilati (ad esempio bisturi) per rimuovere i tessuti molli. Tali strumenti possono causare danni all'osso rilevabili nelle scansioni μCT, influenzando la conservazione del campione e la qualità dei dati di scansione.
  4. Rimuovere detriti o occlusione nella cavità midollare posizionando i blocchi ossei in un pulitore ad ultrasuoni per 5-10 minuti con acqua del rubinetto a 20:1 parti per la soluzione di pulizia (vedi Tabella dei materiali)o utilizzando un filo interdentale portatile (ad esempio, Waterpik).
  5. Immergere il blocco osseo in una tazza di campione e riempire con il 70% di etanolo. Lasciare in ammollo l'osso per almeno 24 ore per rimuovere i lipidi.
    NOTA: Gli xileni possono anche essere usati per rimuovere i lipidi. L'immersione prolungata negli xileni, tuttavia, può rendere l'osso fragile o gessoso in quanto è un emulsionante.
  6. Dopo 24 ore, rimuovere i blocchi ossei dall'etanolo e lasciare asciugare all'aria a temperatura ambiente per 24-48 ore.
    NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui.

2. Sessatura dei tessuti

  1. Posizionare uno scivolo al microscopio in vetro da 75 x 25 mm su una piastra calda impostata su 140 °C. Sciogliere una generosa quantità di resina epossidica termica (vedi Tabella dei materiali)al centro dello scivolo.
    1. Se si preparano sezioni sottili aggiuntive per la microscopia (<50 μm), potrebbe essere necessario che il blocco osseo sia incorporato in un epossidico in due parti per preservare le trabecole. Inoltre, quando si implementa questo protocollo per campioni fragili (ad esempio, ossa diagenetiche o campioni altamente trabecolari) è necessario incorporare campioni in un epossidico.
      NOTA: I campioni ossei utilizzati in questo protocollo sono stati recuperati da campioni cadaverici imbalsami. Se campioni freschi vengono raccolti all'autopsia o da un caso chirurgico per esaminare le strutture dei tessuti molli (ad esempio, la vascucolatura) tramite SRμCT, l'impregnazione con epossidico può indurre danni a tali tessuti. In questi casi, si consiglia un adesivo alternativo o un mezzo di montaggio (ad esempio, nastro a doppia parte, argilla modellante).
  2. Premere l'aspetto inferiore del blocco osseo nella resina epossidica termica sullo scivolo del microscopio, con la lunghezza dell'osso perpendicolare allo scivolo. Spostare il campione avanti e indietro per rivestire la parte inferiore dell'osso e garantire un'adesione sicura allo scivolo.
  3. Lasciare riposare il campione montato sulla piastra calda per ~ 5 minuti per consentire all'epossidico termico di assorbirsi in pori e / o crepe.
    NOTA: L'epossidico sullo scivolo deve essere privo di bolle per la migliore adesione. Per rimuovere le bolle, spostate il campione avanti e indietro nella diapositiva. Le bolle si formano spesso a causa dell'acqua e/o dell'etanolo intrappolati all'interno dell'osso che fuorievengono ed evaporano.
  4. Rimuovere lo scivolo con il campione montato dalla piastra calda utilizzando forcette smussate e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per ~ 10 minuti. Rimuovere eventuali epossidici dal bordo dello scivolo utilizzando una lama di rasoio per assicurarsi che il mandrino afferra adeguatamente lo scivolo.
  5. Attaccare lo scivolo con il campione aderente a un mandrino scorrevole di vetro e montare il mandrino sul braccio girevole di una sega segheria a bassa velocità (vedere Tabella dei materiali, Figura 2).
    NOTA: Mentre una sega Buehler IsoMet è stata utilizzata in questo protocollo, sono disponibili altre seghe di sesatura di precisione che potrebbero essere utilizzate al posto dell'IsoMet (ad esempio, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
  6. Regolare il braccio girevole utilizzando il quadrante di posizionamento per assicurarsi che la lama contatti e trasmetta il campione. Posizionare il campione in modo che una sezione trasversale dell'osso venga tagliata perpendicolarmente alla sua lunghezza.
  7. Aggiungere pesi sul lato opposto del braccio di taglio per contrastare il peso del braccio.
    NOTA: Se viene utilizzato un contrappeso insufficiente, il campione può cadere sulla lama e causare la frattura della lama.
  8. Aggiungere il fluido di taglio (20:1 parti di acqua al fluido da taglio) al contenitore del fluido della sega.
  9. Fissare saldamente la lama del wafer di diamante e assicurarsi che il livello del fluido sommergi la porzione di taglio della lama. Impostare la velocità su 200 RPM e abbassare lentamente il campione sulla lama (Figura 3).
  10. Assicurarsi che la lama e il mandrino non traballino e/o rimbalzino. Se si nota un movimento eccessivo, arrestare immediatamente la sega e stringere la lama e/o il gruppo del braccio del mandrino prima di riprendere il taglio. Aggiungere contrappesi aggiuntivi se il mandrino si muove aggressivamente su e giù. Un movimento eccessivo, incluso il movimento visibile da un lato all'altro, può causare la frattura della lama.
  11. La prima sezione spessa è un "taglio dei rifiuti" per fornire una superficie ben definita parallela ad ogni taglio aggiuntivo. Dopo il taglio iniziale dei rifiuti, sollevare il braccio girevole e spostare il mandrino verso la lama di 5 mm utilizzando il quadrante di posizionamento. Ulteriori sezioni spesse (~1 mm) per microscopia possono essere ulteriormente raccolte con questo metodo.
    NOTA: Per risparmiare tessuto prezioso, il taglio dei rifiuti può essere omesso. Quando si sessetta un campione con uno spigolo irregolare, tuttavia, è fondamentale che il picco del campione sia allineato tangenzialmente allo spigolo della punta del trapano di coring.
    1. Assicurarsi di tenere conto del kerf della lama durante la sessatura. Ad esempio, per ottenere una sezione di 5 mm da una lama con un kerf di 0,5 mm, spostare il campione e mandare di 5,5 mm verso la lama.
  12. Al termine della sessatura, posizionare lo scivolo di vetro con il campione montato su una piastra calda per sciogliere l'epossidico termico. Ciò consente una rapida rimozione dei blocchi ossei dallo scivolo.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. Coring del campione

  1. Montare sezioni ossee da 5 mm sul fondo di uno stagno di alluminio poco profondo (~8 cm di diametro) utilizzando la tecnica di incollaggio epossidico termico come descritto nei passaggi 2.2-2.4.
  2. Posizionare lo stagno su un tavolo macchina XY della pressa per fresatura (vedere Tabella dei materiali) e stringere a mano i morsetti di fissaggio ( Figura4).
  3. Inserire la punta di perforazione a punta di diamante del gioielliere ad albero cavo di 2 mm di diametro interno (vedere Tabella dei materiali)nel mandrino del trapano del mulino. Regolare il limitatore di profondità per evitare di coring attraverso lo stagno (Figura 5).
  4. Allineare l'aspetto anteriore centrale del campione osseo sotto la punta del trapano evitando uno stretto contatto con il periostio, l'endosteo o le aree altamente trabecolari.
    NOTA: La selezione automatizzata delle cortici femorali medio-anteriori non è fattibile in quanto lo spessore corticale varia tra gli individui, specialmente con l'aumentare dell'età.
  5. Riempire lo stagno con acqua distillata per coprire completamente il campione. Ciò impedisce l'accumulo di calore, la combustione del campione e/o danni alla punta del trapano durante la coring.
    NOTA: Per valutare la possibilità di danni da calore causati dalla coring, è stato utilizzato un termometro a infrarossi per ottenere letture della temperatura dall'acqua distillata mentre la parte di coring penetrava per la prima volta nella superficie delle ossa. La temperatura variava di 1 °C, da 22,9 a 23,9 °C tra i dieci campioni cored per questo test. Pertanto, sosteniamo che i danni indotti dal calore sono trascurabili.
  6. Per i primi casi di contatto tra la parte del nucleo e l'osso, applicare una pressione delicata per indossare un anello sulla superficie superiore dell'osso. Ciò impedisce la deflessione della punta di perforazione all'inizio del processo di coring e garantisce il corretto posizionamento del bit.
  7. Durante il coring, sollevare la punta del trapano in uscita dal campione mantenendo la punta del bit sotto la superficie dell'acqua. Continuare questa tecnica ogni pochi secondi per eliminare la polvere ossea intrappolata e assicurarsi che i detriti non occluso la punta del trapano.
    NOTA: Se il nucleo sta formando una forma conica, è probabile che sia dovuto a 1) che non consente tempo sufficiente per sciacquare la polvere ossea dalla parte di coring e 2) il coring si sta verificando troppo rapidamente. L'aumento della velocità può spezzare pezzi di grandi dimensioni dal campione e polverizzare l'aspetto superiore.
  8. Una volta completata la coring, il nucleo osseo risultante può essere depositato nella punta di perforazione a gambo cavo (Figura 6). Utilizzare una coppia di flessione a punta fine o una piccola chiave Allen per spodesare il nucleo dal bit (Figura 2).
  9. Conservare il campione cored in un tubo di microcentrifugo marcato in un luogo fresco e asciutto fino all'imaging.

4. Routine di elaborazione delle immagini per la valutazione dei parametri microarchitettotechi ossei da nuclei ossei corticali

  1. Ricostruzione delle immagini μCT
    1. Scaricare e installare l'ultima versione di NRecon https://www.bruker.com/products/microtomography.html per la ricostruzione delle immagini di proiezione SRμCT.
    2. Selezionare il collegamento NRecon sul desktop e verrà visualizzato il GPUReconServer associato.
    3. Aprire il set di dati desiderato nella finestra popup. Se la finestra non viene visualizzata, selezionare l'icona della cartella nell'angolo superiore sinistro della finestra del visualizzatore dati.
    4. Selezionate la prima proiezione dall'acquisizione di SRμCT. In Outputrimuovere le selezioni per Use ROI e Scales ON.
    5. Scegliere la destinazione del file di ricostruzione. Selezionare Sfoglia e creare una nuova cartella denominata Ricognitore. Il formato di file selezionato deve essere BMP(8).
    6. Controllare la compensazione del disallineamento.
      NOTA: Questa stima è spesso vicina alla correzione. Il rendering 3D approssimativo può essere regolato manualmente spostando le frecce su e giù per spostare le immagini sovrapposte in modo che i bordi destro e sinistro si allineino il più vicino possibile.
    7. In Impostazioniscegliere le selezioni desiderate per applicare gli algoritmi Smoothing, Beam Hardening, CS Rotation, Object Larger than FOVe Ring Artifacts .
    8. Regolare l'istogramma in Output selezionando Auto.
      NOTA: l'immagine risultante potrebbe essere fioca.
    9. Selezionare Avvia per iniziare l'elaborazione della ricostruzione.
    10. Utilizzare la nomenclatura standard per gli indici lacunari canali/osteociti28. Questi possono includere: volume totale di tessuto VOI (TV), volume del canale (Ca.V), numero totale di canali (Ca.N), diametro medio del canale (Ca.Dm), porosità corticale (Ca.V/TV), dato in percentuale, numero totale di lacune (N.Lc) e volume lacunare medio (Lc.V), tra gli altri. Per determinare la densità lacunare per mm3 (N.Lc/BV), il volume osseo (BV) è calcolato come volume totale meno il volume del canale (TV-Ca.V).
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
  2. Raccolta di dati microarchitettotechi da immagini ricostruite
    1. Scaricare e installare l'ultima versione di CTAnalyser presso https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html per l'analisi dei parametri microarchitettonali.
      NOTA: la versione gratuita di CTAnalyser è limitata nella funzionalità. Pertanto, si consiglia di acquistare una licenza completa per eseguire analisi più dettagliate.
    2. In Immagine | Proprietà | Modificare le dimensionidei pixel , assicurarsi che la dimensione dei pixel corrisponda a quella del protocollo di imaging μCT applicato.
      NOTA: se si modificano immagini in ImageJ o in un programma simile, si noti che al momento del salvataggio, l'intestazione incorporata nel file TIFF verrà modificata e il software di analisi modificherà le dimensioni dei pixel durante l'importazione del set di dati.
    3. Selezionare Elaborazione personalizzata Per creare un elenco attività (vedere Materiali supplementari) per analizzare la microarchitettura ossea dal set di dati di scansione. Un protocollo generale per i parametri di rete lacunari osteociti che utilizzano plugin proprietari di CTAnalyser segue qui:
      NOTA: l'elenco delle attività del plug-in funziona bene per i set di dati in cui l'esempio è l'unico soggetto visibile nel FOV. Se lo spazio vuoto circonda il campione, è necessaria l'applicazione di un ROI. In caso contrario, i valori raccolti nell'analisi 3D e nell'analisi dei singoli oggetti verranno ridotti artificialmente.
      1. Ricaricare le immagini per reimpostare e/o regolare eventuali modifiche (ad esempio, dalla modifica in ImageJ o simili) prima di aprire il menu Elaborazione personalizzata nel software di analisi.
      2. Per ridurre il rumore nelle immagini, applicate un filtro passa-basso gaussiano nello spazio 3D con un kernel rotondo e un raggio di 2-3.
        NOTA: Queste impostazioni sono state applicate ai set di dati degli esperimenti SRμCT segnalati attraverso test di tentativi ed errori. L'obiettivo era quello di ottenere ricostruzioni della migliore qualità per i dati. Regola le impostazioni di ricostruzione in base a ogni configurazione sperimentale unica.
      3. Applicare una soglia globale in scala di grigi alle immagini selezionando valori bassi e alti per evidenziare i canali vascolari. Le sezioni ricostruite viste nelle figure 8B e 8D rappresentano una soglia di esempio di 0-155.
        NOTA: Analogamente al passaggio 4.2.3.2, le impostazioni di soglia applicate qui sono state scelte tramite tentativi ed errori estesi. La soglia deve essere regolata per ogni set-up sperimentale e per ogni sistema di imaging μCT utilizzato.
      4. Despeckle (denoise) per rimuovere le macchie bianche nello spazio 3D che si trovano all'interno dell'intervallo di dimensioni dei pixel volumetrici (voxel) delle lacune osteociti al fine di isolare solo i canali.
        NOTA: Per una scansione SRμCT dell'osso corticale umano presa a 0,9 μm di dimensione in pixel, il limite inferiore per le lacune osteociti è di 13 voxel.
      5. Despeckle per rimuovere eventuali macchie nere nello spazio 2D per rimuovere gli artefatti nei canali. Questi possono essere abbastanza grandi in 2D, quindi rimuovere le funzionalità che sono <15.000 pixel.
      6. Dilatare i pori nello spazio 3D utilizzando la funzione di funzionamento morfologico con un nucleo rotondo di raggio 2 o 3, a seconda della qualità delle immagini, al fine di isolare eventuali tessuti molli intrappolati nei canali.
      7. Eseguire una funzione Despeckle aggiuntiva utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 4.2.3.5. al fine di rimuovere i tessuti molli isolati all'interno dei canali.
      8. Erodere la dilatazione dal passo 4.2.3.6. utilizzando una funzione di funzionamento morfologico usando un kernel rotondo con raggio 2 o 3. Il raggio per questo passaggio deve corrispondere al raggio utilizzato nella procedura 4.2.3.6.
      9. Eseguire analisi 3D e selezionare i parametri da calcolare per il volume dei canali vascolari. In generale, i valori di base forniranno informazioni sufficienti.
      10. Salvare le immagini elaborate con Salva bitmap in una sottocartella personalizzata nella directory.
        NOTA: Se si crea un'immagine di ricostruzione 3D dalle immagini elaborate utilizzando un programma come Amira / Avizo, Dragonfly, Drishti, ecc., si consiglia di salvare le immagini in bianco e nero (1 bit).
      11. Calcolare il numero di canali vascolari e descriverne le dimensioni, la forma e l'orientamento utilizzando la funzione Analisi singoli oggetti.
      12. Ripetere i passaggi da 4.2.3.1 a 4.2.3.3. per resettare l'immagine per l'analisi lacunare degli osteociti.
      13. Rimuovere le macchie bianche nello spazio 3D utilizzando la funzione Despeckle, assicurando che tali artefatti siano più piccoli del limite inferiore delle dimensioni lacunari. Questo passaggio rimuove il rumore dalla scansione che può sembrare pori corticali, preservando al contempo le vere lacune osteocitiche. Per scansioni umane SRμCT di dimensioni di 0,9 μm pixel, questo limite inferiore è di 13 voxel.
      14. Despeckle ancora una volta per rimuovere le macchie bianche che sono più grandi del limite superiore di dimensione lacunare. Per i set di dati SRμCT umani con le impostazioni elencate nel passaggio 4.2.3.13, questo limite è di 2743 voxel.
      15. Eseguire analisi 3D per estrarre informazioni microstrutturali relative specificamente alle lacune osteociti.
      16. Selezionare Salva bitmap per salvare le immagini elaborate per isolare le lacune dell'osteocita.
      17. Eseguire l'analisi dei singoli oggetti per calcolare il numero di osteociti in 3D all'interno del Volume di interesse (VOI) selezionato.
        NOTA: Una volta che l'elenco delle attività è stato stabilito e testato, CTAnalyser ha una funzione di batch manager (BatMan) che può essere utilizzata per accelerare l'estrazione dei dati e garantire un'elaborazione uniforme delle immagini. Elenco attività con impostazioni di esempio per la procedura 4.2.3. può essere trovato nei materiali supplementari.

Risultati

Il metodo descritto di campionamento di base si è rivelato altamente efficace ed efficiente. I campioni di coring che utilizzano questo protocollo hanno permesso l'approvvigionamento di campioni di dimensioni costanti >300 per esperimenti sulla beamline CLS BMIT-BM2, con un FOV di ~ 2 mm a 1,49 μm di dimensione voxel. Per convalidare la consistenza del diametro del nucleo, sono state effettuate tre misurazioni lungo la lunghezza (superiore, centrale, inferiore) di un sottoinsieme di nuclei femor...

Discussione

Non esiste un protocollo completo e standardizzato per l'acquisto di campioni di nucleo osseo corticale uniforme e cilindrico per l'imaging SRμCT ad alta risoluzione con configurazioni FOV limitate. Il protocollo qui dettagliato riempie quel vuoto fornendo un tutorial completo su come procurarsi campioni di nucleo osseo corticale di dimensioni costanti per l'imaging SRμCT e la successiva visualizzazione accurata e l'estrazione di dati microarchitettotechi. Abbiamo dimostrato che il nostro protocollo fornisce un metodo ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

La ricerca descritta in questo documento è stata eseguita presso la struttura BMIT presso la Canadian Light Source, che è supportata dal Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dall'Università del Saskatchewan, dal Governo del Saskatchewan, dalla Western Economic Diversification Canada, dal National Research Council Canada e dal Canadian Institutes of Health Research. Gli autori ringraziano gli scienziati beamline presso la Canadian Light Source, in particolare Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov e Ning Zu per l'assistenza nella configurazione e risoluzione dei problemi dei sistemi di microscopio SkyScan SRμCT e white beam. Desideriamo anche ringraziare Beth Dalzell dell'University of Toledo College of Medicine and Life Sciences e il Dr. Jeffrey Wenstrup della Northeast Ohio Medical University per l'accesso a campioni cadaverici per questo studio. JM Andronowski è supportato attraverso fondi di ricerca di start-up forniti dall'Università di Akron e da una sovvenzione del National Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes (2018-DU-BX-0188). RA Davis è supportato da un assistente di laurea fornito dall'Università di Akron. Le attrezzature e le forniture utilizzate per il coring e la segatura sono state acquistate con fondi di start-up forniti dall'Università di Akron e la sovvenzione NSF EAR-1624242 a CW Holyoke.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1-1/8" plunge cutting carbide for compositesWarrior6181228.6mm plunge
70% EthanolFisher ScientificBP82015003.8 Liters
Blunt-tipped forcepsFisher Scientific10-300
Centrifuge tubesThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxyTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool KitAmazon787269885110
Diamond wafering saw blade for composite materialBuehler#11-4247
Drill PressJet Mill/Drill350017Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem
Fine-tipped forcepsFisher Scientific22-327379
Fixturing clamps for XY machine table for mill/drillMSC Industrial Supply#04804571
Glass microscope slidesTed Pella2600575x50mm slides, 1mm thick
Glass slide chuckBuehler#112488Large enough to hold 75x50mm glass slides
Hot plate capable of reaching 140 °CThermoScientificHP88850105
IncubatorNAPCOModel 4200
Isocut FluidBuehler111193032Lubricant; 30mL
Jeweler's diamond coring drill bitOtto Frei#119.0502mm inner diameter hollow stem coring bit
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Riferimenti

  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
  3. Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
  4. Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
  5. Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
  6. Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
  7. Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
  8. Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
  9. Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
  10. Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
  11. Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
  12. Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
  13. Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
  14. Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
  15. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
  16. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
  17. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
  18. Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
  19. Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
  20. Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
  21. Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
  22. Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
  23. Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
  24. Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
  25. Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
  26. De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
  27. Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
  28. Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
  29. Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
  30. Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
  31. Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
  32. . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
  33. Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
  34. Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).

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