Utilizzo della magnetometria per monitorare l'incorporazione cellulare e la successiva biodegradazione delle nanoparticelle di ossido di ferro sintetizzate chimicamente

Riepilogo

Le nanoparticelle di ossido di ferro sono sintetizzati tramite una procedura sol gel non acquosa e rivestiti con molecole corte anioniche o polimeri. L'uso della magnetometria per monitorare l'incorporazione e le biotrasformazioni di nanoparticelle magnetiche all'interno delle cellule staminali umane è dimostrato utilizzando un magnetometro a campione vibrante (VSM).

Abstract

Le nanoparticelle magnetiche, fatte di ossido di ferro, presentano un interesse particolare per una vasta gamma di applicazioni biomediche per le quali sono spesso interiorizzate nelle cellule e poi lasciate all'interno. Una sfida è valutare il loro destino nell'ambiente intracellulare con metodologie affidabili e precise. Qui, introduciamo l'uso del magnetometro a campione vibrante (VSM) per quantificare con precisione l'integrità delle nanoparticelle magnetiche all'interno delle cellule misurando il loro momento magnetico. Le cellule staminali sono prima etichettate con due tipi di nanoparticelle magnetiche; le nanoparticelle hanno lo stesso nucleo prodotto attraverso una sintesi di sol gel non acquosa a base di microonde veloce ed efficiente e differiscono nel loro rivestimento: la molecola di acido citrico comunemente usata viene confrontata con l'acido poliacrilico. La formazione di sferoidi cellulari 3D viene quindi ottenuta tramite centrifugazione e il momento magnetico di questi sferoidi viene misurato in momenti diversi con il VSM. Il momento ottenuto è un'impronta digitale diretta dell'integrità delle nanoparticelle, con valori decrescenti indicativi di una degradazione delle nanoparticelle. Per entrambe le nanoparticelle, il momento magnetico diminuisce nel tempo della coltura rivelandone la biodegradazione. Viene mostrato anche un effetto protettivo del rivestimento in acido poliacrilico, rispetto all'acido citrico.

Introduzione

C'è un maggiore interesse per le caratteristiche magnetiche delle nanoparticelle di ossido di ferro per una vasta gamma di applicazioni biomediche. La loro risposta alla risonanza magnetica li rende agenti di contrasto affidabili per la risonanza magnetica (MRI), un vantaggio nella medicina rigenerativa in cui le cellule etichettate con nanoparticelle magnetiche possono essere tracciate in vivo dopo l'impianto¹. Usando campi magnetici, le cellule possono anche essere guidate a distanza; in questo modo, gli sferoidi cellulari^{2,3,anelli 4}o fogli^{5 possono} essere progettati magneticamente e anche da remoto^{stimolati 6,}una risorsa nello sviluppo di tessuti senza impalcature. La gamma di possibilità per queste nanoparticelle comprende anche i sistemi di somministrazione dei farmaci^7,8 e il trattamento ipertermico magnetico e fotoindotto per uccidere le cellule cancerose^9,10,11. Per tutte queste applicazioni, le nanoparticelle sono integrate nell'ambiente biologico mediante iniezione endovenosa o per internalizzazione diretta nelle cellule e vengono quindi lasciate all'interno, il che mette in discussione il loro destino intracellulare.

Le analisi in vivo hanno trasmesso una comprensione generale del destino delle nanoparticelle nell'organismo: dopo l'iniezione nel flusso sanguigno, vengono prima catturate principalmente dai macrofagi del fegato (cellule di Kupffer), milza e midollo osseo, vengono progressivamente degradate e si uniscono alla pozza di^{ferro dell'organismo 12,13,14,15,16,17,18,19}. Osservazioni qualitative sono possibili solo a causa della circolazione delle nanoparticelle in tutto l'organismo. Tipicamente, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) può essere utilizzata per osservare direttamente le nanoparticelle e la presenza di ferro negli organi può essere determinata tramite dosaggio. Più recentemente, il loro destino è stato valutato direttamente su un pool di cellule, il che significa in circuito chiuso senza fuga di ferro, consentendo una misurazione quantitativa delle loro biotrasformazioni a^{livello cellulare 20,21,22}. Tali misurazioni sono possibili attraverso l'analisi delle proprietà magnetiche delle nanoparticelle strettamente legate alla loro integrità strutturale. La magnetometria a campione vibrante (VSM) è una tecnica in cui il campione viene vibrato periodicamente in modo che la misurazione della bobina del flusso indotto fornisca il momento magnetico del campione al campo magnetico applicato. Tale rilevamento sincrono consente una misurazione rapida, che è una risorsa per determinare i momenti magnetici di un gran numero^{di campioni 20,21,22,23}. La firma magnetica macroscopica recuperata da VSM fornisce quindi una panoramica quantitativa dell'intero campione biologico direttamente correlato alle dimensioni e alla struttura delle nanoparticelle. In particolare, fornisce il momento magnetico alla saturazione (espresso in emu) dei campioni, che è una quantificazione diretta del numero di nanoparticelle magnetiche presenti nel campione, rispettivamente alle loro specifiche proprietà magnetiche.

È stato dimostrato che l'elaborazione intracellulare delle nanoparticelle magnetiche è strettamente legata alle loro caratteristiche strutturali²⁰. Queste funzionalità possono essere controllate tramite protocolli di sintesi ottimali. Ogni protocollo presenta vantaggi e limitazioni. Le nanoparticelle di ossido di ferro sono comunemente sintetizzati in soluzioni acquose attraverso la coprecipitazione di ioni di^{ferro 24}. Per superare i limiti della polidispersità delle dimensioni delle nanoparticelle, sono stati sviluppati altri metodi di sintesi come i metodi sol-gel mediati in poliolo²⁵. Approcci non acquosi per decomposizione termica portano alla produzione di nanoparticelle di ossido di ferro molto ben calibrate²⁶. Tuttavia, l'uso di enormi quantità di tensioattivi come l'oleylamina o l'acido oleico complica la loro funzionalizzazione e il trasferimento di acqua per applicazioni biomediche. Per questo motivo, sintetizzano tali nanoparticelle magnetiche attraverso una via sol gel non acquosa che porta ad alta cristallinità, purezza e riproducibilità²⁷. Questo protocollo produce nanoparticelle di dimensioni ben controllate che possono essere sintonizzate attraverso la variazione di^{temperatura 28}. Tuttavia, la via sol-gel non acquosa assistita da microonde ha un limite di dimensione superiore delle nanoparticelle ottenute di circa 12 nm. Questa procedura non sarebbe adattata per applicazioni che utilizzano particelle ferromagnetiche a temperatura ambiente. Oltre alla sintesi del nucleo, un'altra caratteristica principale da considerare è il rivestimento. Situato sulla superficie della nanoparticella, il rivestimento agisce come una molecola di ancoraggio, aiutando l'internalizzazione mirata delle nanoparticelle, o può proteggere la nanoparticella dalla degradazione. Poiché l'alcol betilico agisce come fonte di ossigeno e ligando allo stesso tempo, le nanoparticelle nude sono prodotte senza la necessità di ulteriori tensioattivi o ligandi. Le nanoparticelle vengono quindi facilmente funzionalizzate in superficie dopo la sintesi senza un processo di scambio di tensioattivi.

Qui vengono valutati due tipi di nanoparticelle che possiedono lo stesso nucleo e differiscono nel rivestimento. Il nucleo è sintetizzato utilizzando una tecnica a microonde veloce e altamente efficiente. I due rivestimenti confrontati sono costituiti da acido citrico, uno dei più utilizzati come agente di rivestimento in^{applicazioni biomediche 29,30,}e acido poliacrilico (PAA), un rivestimento polimerico con un alto numero di funzioni chelating. Le misurazioni della magnetometria VSM vengono quindi utilizzate prima per quantificare l'assorbimento delle nanoparticelle da parte delle cellule, e poi come valutazione diretta dell'integrità strutturale della nanoparticella all'internalizzazione nelle cellule staminali. I risultati dimostrano che la concentrazione di incubazione influisce sull'assorbimento delle nanoparticelle e che il rivestimento influenza la loro degradazione, con il gran numero di molecole di ancoraggio di PAA che proteggono il nucleo dalla degradazione.

Protocollo

1. Sintesi di nanoparticelle magnetiche

1. Sintesi di base - assistita da microonde
   1. Sciogliere 400 mg di acetilacetonato di ferro (III) (>99,9%) in 10 mL di alcol bendilico (BA, 99,8%) all'interno di una fiala di vetro monocromatico da 30 mL.
   2. Aumentare la temperatura della sospensione da 25 a 250 °C in 20 min (ad una velocità di 11,25 °C/min) e mantenerla a 250 °C per 30 minuti utilizzando un reattore a microonde.
   3. Trasferire le nanoparticelle risultanti sospese in alcol bendilico in una fiala di vetro e separare le nanoparticelle usando un magnete al neodimio per 30 minuti.
   4. Lavare il precipitato nella precedente fiala di vetro da 100 mL con 10 mL di diclorometano, 1 M idrossido di sodio, etanolo, acqua pH 7 (tre volte) utilizzando un magnete al neodimio per 5 minuti ogni passo per pellettizzare le nanoparticelle e rimuovere il supernatante.
   5. Regolare la sospensione della nanoparticella in acqua in pH 2 usando 1 M di acido cloridrico, quindi centrifugare in filtri ultracentrifali da 100 kDa a 2.200 x g per 10 min.
   6. Rimuovere il filtrato, aggiungere 12 mL di acido^{cloridrico da 10-2} M alla soluzione di nanoparticelle e centrifugare in filtri ultracentrifali da 100 kDa a 2.200 x g per 10 min (tre volte). Quindi diluire la soluzione di nanoparticelle entro 10 mL di acido cloridrico^10-2 M prima del rivestimento.
2. Rivestimento
   1. Diluire 175 mg di acido citrico e acido poliacrilico in acqua a pH 2 in una fiala di vetro da 100 mL e regolare il pH a 2 con una soluzione di acido cloridrico da 1 M.
   2. Aggiungere la dispersione acquosa delle nanoparticelle da 10 mL alla soluzione della molecola di rivestimento, corrispondente a un rapporto di massa di 5 tra la molecola di rivestimento e le nanoparticelle. Agitare per 2 ore sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente.
   3. Dopo la reazione, regolare il pH a 7 con 1 M idrossido di sodio.
   4. Centrifugare la soluzione di nanoparticelle 3 volte con acqua deionizzata (DI) in filtri ultracentrifali da 100 kDa a 2.200 x g per 10 min; rimuovere il filtrato e diluire la soluzione di nanoparticelle in 12 mL di acqua DI.

2. Coltura ed etichettatura magnetica delle cellule staminali

1. Coltura delle cellule staminali mesenchimali umane (MSC) in un mezzo completo di crescita delle cellule staminali mesenchimali (MSCGM) a 37 °C e al 5% di CO₂. Quando le cellule sono al 90% di confluenza, aggiungere 10 ml di tripsiderina-EDTA pre-riscaldata a 37 °C per pallone da 150 cm² e lasciare per 2-3 minuti per staccare le cellule.
   1. Per sapere quando le cellule sono staccate, osservale con un microscopio a campo luminoso. Rimospendare le celle staccate in MSCGM e dividerle in quattro contenitori da 150 cm². Amplificare le cellule in questo modo fino al passaggio da 4 a 5.
2. Preparare la soluzione di nanoparticelle magnetiche per l'etichettatura cellulare: disperdere la concentrazione scelta di nanoparticelle di ossido di ferro in mezzo roswell park memorial institute privo di siero (RMPI-1640) senza glutammina. L'RPMI è usato per l'incubazione di nanoparticelle (e i relativi passaggi di risciacquo) in quanto ha una forza ionica inferiore rispetto al DMEM e previene meglio gli eventi di aggregazione delle nanoparticelle.
3. Quando le cellule sono al passaggio 4 o 5 e 90% confluenti, rimuovere il mezzo MSCGM, sciacquare le cellule con RPMI senza siero (senza glutammina) e aggiungere 10 ml di soluzione di nanoparticelle di ossido di ferro per pallone da coltura 150 cm^2, che è il volume minimo necessario per coprire tutte le cellule.
4. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 30 min e quindi scartare la soluzione di nanoparticelle. Lavare una volta con RPMI-1640 senza siero (senza glutammina) e incubare con il Mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con FBS al 10% e 1% di penicillina-streptomicina (25 mL per pallone da 150 cm²⁾ durante la notte a 37 °C e 5% di CO₂ per consentire una completa internalizzazione delle nanoparticelle.

3. Formazione di sferoidi delle cellule staminali

1. Preparare al momento un terreno di coltura cellulare-sferoide composto da glucosio alto DMEM con L-glutammina integrato con 50 μM L-acido ascorbico 2-fosfato, 0,1 μM di desametasone, 1 mM di piruvato di sodio, 0,35 mM L-prolina e 1% di integratore di coltura universale contenente insulina, transferrina umana e acido selenoso (ITS-Premix).
2. Staccare gli MSC magnetici aggiungendo 10 mL dello 0,05% di tripsiderina-EDTA pre-riscaldata a 37 °C per pallone da 150 cm² per 2-3 minuti. Quando le cellule sono staccate, inattivare immediatamente la tripparina aggiungendo 1/3 del volume di DMEM integrato con FBS al 10% e 1% di penicillina-streptomicina pre-riscaldata a 37 °C.
3. Centrifugare le cellule dissociate a 260 x g per 5 minuti, aspirare il mezzo e sospendere di nuovo le cellule in un piccolo volume (meno di 1 ml per pallone da 150 cm²) di mezzo di coltura cellulare-sferoide come avere 200.000 cellule in circa 50 μL di mezzo. Contare il numero di cellulare usando un emocitometro e regolare il volume, se necessario.
4. Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura cellulare-sferoide appena preparato in un tubo di centrifuga conico sterile da 15 ml e aggiungere il volume di soluzione rimorsizzata corrispondente a 200.000 cellule.
5. Centrifuga queste cellule etichettate magneticamente a 180 x g per 3 minuti come la formazione di un pellet cellulare nella parte inferiore del tubo e mantieni il supernatante, che è il mezzo di coltura cellulare.
6. Aprire leggermente i tubi per consentire lo scambio d'aria e l'incubazione a 37 °C con 5% di CO₂ per un massimo di 21 giorni, tempo di coltura lungo il quale le cellule formano una struttura 3D coesa che si traduce in uno sferoide completamente formato. Cambiare il mezzo due volte a settimana.
7. In alcuni giorni, lavare gli sferoidi due volte con tampone cacodilato composto da 0,2 M cacodilato diluito in acqua demineralizzata e fissarli utilizzando il 2% di glutaraldeide in tampone cacodilato da 0,1 M diluito in acqua distillata per 30 minuti a temperatura ambiente. Conservare gli sferoidi fissi in PBS fino a quando non vengono utilizzati per la misurazione VSM o l'imaging TEM. Questa fase di fissazione interrompe tutti i processi biologici e consente la conservazione a lungo termine.

4. Quantificazione delle nanoparticelle magnetiche in soluzione e in cellulo utilizzando un magnetometro a campione vibrante (VSM)

1. Posizionare un dato volume di soluzione magnetica di nanoparticelle (massimo 10 μL) o una singola cellula-sferoide nel portacampioni specificamente progettato per adattarsi al VSM.
2. Inserire l'esempio nel VSM e cercare l'offset del campione. Posizionare il campione nella posizione corrispondente al massimo di magnetizzazione.
3. Eseguire la prima misurazione a basso campo magnetico (tra -1500 Oe e +1500 Oe) con una velocità di 20 Oe/s.
4. Eseguire una seconda misurazione ad alto campo magnetico (tra -30 000 Oe e +30 000 Oe) con una velocità di 200 Oe/s.

5. Analisi della microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

1. Per le soluzioni di nanoparticelle, depositare 10 μL della soluzione acquosa su una griglia di rame rivestita di carbonio e lasciarla asciugare a temperatura ambiente.
2. Per le nanoparticelle internalizzate nelle cellule, confrontare gli sferoidi cellulari fissi con estratto di tè Oolong (OTE) allo 0,5% diluito in tampone cacodilato da 0,1 M, post fissare con l'1% di tetrossido di osmio contenente l'1,5% di cianoferrato di potassio e quindi disidratarsi nei bagni di etanolo graduati, inclusi in Epon. Tagliare le ultrasezioni di 70 nm e depositarle su griglie di bottaio.
3. Scatta immagini usando un microscopio elettronico a 80 kV con un ingrandimento da 1k per l'osservazione di intere cellule a 40k per l'osservazione di compartimenti endosomiali.

Risultati

Utilizzando la sintesi assistita da microonde, le nanoparticelle magnetiche con una dimensione del nucleo monodispersa da 8,8 ± 2,5 nm sono prodotte e rivestite con citrato o PAA(Figura 1A). Le cellule staminali vengono quindi incubate con queste nanoparticelle disperse nel mezzo di coltura ad una data concentrazione per 30 minuti, con conseguente endocitosi e confinamento all'interno degli endosomi cellulari (Figura 1B). Le cellule staminali magnetiche vengono...

Discussione

Utilizzando una sintesi rapida ed efficiente a microonde, le nanoparticelle magnetiche possono essere facilmente sintetizzati, con dimensioni controllate e ulteriormente rivestiti con date molecole. Un passo fondamentale è quello di stoccare il sale di ferro e l'alcol benzile sotto vuoto per mantenere una piccola dispersione di dimensioni. L'alcol benzile agisce sia come solvente che come ligando allo stesso tempo permettendo di ottenere direttamente ossido di ferro nudo calibrato senza la necessità di ligandi aggiunti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Benzyl alcohol for synthesis	Sigma Aldrich	8.22259
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10270-106
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35640
Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%)	Sigma Aldrich	517003
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501
Monowave glass vial	Anton Paar	82723_us
Microwave reactor	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL)	Life Technologies	15140-122
Poly(acrylic acid, sodium salt)	Sigma Aldrich	416010	MW = 1200 g/mol
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution	Alfa Aesar	35629
Sodium pyruvate solution 100mM	Sigma	S8636
Sterile conical centrifuge tube	Falcon	352097	15 mL tubes
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis	Sigma Aldrich	10396430
Ultra centrifugal filter	Amicon	AC S510024