Un modello murino indotto da doxorubicina di cardiomiopatia dilatativa in vivo

Riepilogo

È descritto un protocollo per stabilire un modello di cardiomiopatia dilatativa indotta da doxorubicina (DCM) nei topi tramite iniezione intraperitoneale a lungo termine di doxorubicina.

Abstract

La cardiomiopatia dilatativa (DCM) si riferisce a uno spettro di disturbi miocardici eterogenei caratterizzati da dilatazione ventricolare e prestazioni cardiache depresse in assenza di ipertensione, cardiopatie valvolari, congenite o ischemiche e che possono essere correlati a infezioni, anomalie autoimmuni o metaboliche o ereditarietà familiare. Può progredire in insufficienza cardiaca congestizia con una prognosi sfavorevole. La doxorubicina (Dox) è ampiamente impiegata come farmaco chemioterapico, ma il suo uso è limitato perché provoca cambiamenti simili a DCM del miocardio. La sua tossicità miocardica è attribuita allo stress ossidativo, all'infiammazione cronica e all'apoptosi cardiomiocitaria. Non è stato stabilito un modello di DCM che sfrutti questi sintomi di DCM indotti da Dox.

Introduzione

Una delle cause più comuni di insufficienza cardiaca, DCM è caratterizzata da dilatazione ventricolare e diminuzione della funzione cardiaca ed è la ragione più comune per il trapianto di cuore in tutto il mondo¹. Al fine di indagare ulteriormente la sua patogenesi e trovare trattamenti efficaci, l'accesso a modelli animali maturi è particolarmente importante. Lo scopo degli esperimenti descritti è quello di stabilire un modello murino stabile di DCM che assomigli al DCM umano.

A causa della complessa patogenesi del DCM, ci sono molti metodi diversi per realizzare modelli animali corrispondenti. I modelli DCM^{spontanei 2} sono relativamente stabili, ma sono costosi e non facilmente disponibili. I modelli animali geneticamente modificati³ non sono ben consolidati e richiedono un uso più sperimentale. I modelli animali DCM indotti da infezione virale⁴ o difetti autoimmuni⁵ sono facili da ottenere, ma non sono del tutto rappresentativi del DCM. I modelli associati alla tossicità miocardica includono modelli DCM indotti da alcol e modelli animali DCM indotti da Dox.

Il modello di cardiomiopatia indotta da Dox è ottenuto mediante iniezione intraperitoneale di Dox⁶. Il modello sfrutta l'effetto collaterale cronico più grave di Dox: dopo l'esposizione a Dox, i pazienti sviluppano sintomi di DCM ad esordio tardivo con uniformità clinica^7. Lo stress ossidativo indotto da Dox⁸ e il danno mitocondriale⁹, che portano all'apoptosi cardiomiocitaria, sono sintomi nella patogenesi del DCM. Esistono modelli di trattamento Dox acuti e cronici: una singola dose elevata di Dox (15 mg/kg) induce un modello a breve termine per la cardiomiopatia^10,mentre iniezioni ripetitive di Dox a basso dosaggio (sei settimanali, 3 mg/kg) inducono un modello a lungo termine per la cardiomiopatia^11. Sulla base dello studio presentato, i topi wild type iniettati per via intraperitoneale una volta alla settimana per un mese alla dose di 5 mg/kg mostrano morfologia e istologia del cuore coerenti con le caratteristiche del DCM entro la fine del trattamento, fornendo un modo ideale per stabilire un modello DCM.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Nanjing Drum Tower Hospital.

1. Preparazione dei reagenti e degli animali

1. Sciogliere la doxorubicina cloridrato (Pfizer, USA) in acqua sterilizzata. Vortice per ottenere una soluzione di Dox di 1 mg/mL e mantenere a 4 °C.
2. Utilizzare topi C57BL/6 (8-10 settimane di età; 25-30 g di peso). Per questo studio, i topi sono stati acquistati dal Model Animal Research Center dell'Università di Nanchino e tenuti nella stanza degli animali del Nanjing Drum Tower Hospital.
3. Le gabbie per topi prive di agenti patogeni sono state mantenute sotto un ciclo luce/buio di 12 ore a una temperatura costante di 23 °C. Tutti gli animali sono stati nutriti con una normale dieta chow e hanno ricevuto cibo e acqua ad libitum.

2. Istituzione del modello animale DCM

1. Randomizzare i topi in un gruppo normale (n = 5) e dox (n = 5).
2. Somministrare la soluzione di Dox per via intraperitoneale alla dose di 5 mg/kg utilizzando una siringa sterilizzata da 1 mL 1 volta a settimana per il gruppo Dox. Trattare i topi di controllo allo stesso modo con la stessa quantità di soluzione salina.
3. Misurare il peso corporeo dei due gruppi settimanalmente. Di conseguenza, aggiustare la dose di iniezione in base al peso corporeo settimanalmente per un totale di 4 settimane, con una dose cumulativa di 20 mg/kg (Figura 1).
   NOTA: È stato scelto un periodo di tempo di 4 settimane perché l'ecocardiografia a 4 settimane ha mostrato una differenza significativa nella funzione cardiaca tra i due gruppi.

3. Esame ecocardiografico

1. Alla fine della quarta settimana, condurre un esame ecocardiografico dei topi.
2. Anestetizzare i topi con il 2% di isoflurano per via intranasale. Se i topi non rispondono a un pizzico di pelle con una pinzetta dentata o stimolando le dita dei piedi e la coda, continuare con il protocollo.
3. Posizionare il mouse su una piattaforma di manipolazione degli animali in posizione supina. Per mantenere l'anestesia, coprire il naso e la bocca dell'animale con un cono nasale e fornire il 2% di isoflurano.
   NOTA: Per l'anestesia IP, iniettare il 4% di idrato di cloralio alla dose di 0,2 ml/20 g.
4. Rimuovere accuratamente la pelliccia del torace con un rasoio elettrico. Valutare la funzione cardiaca in vivo utilizzando l'ecocardiografia transtoracica.
5. Eseguire l'ecocardiogramma LV sia nell'asse lungo parasternale che nell'asse corto ad un frame rate di 233 Hz. Le dimensioni sistolica e diastolica finale sono state definite come le fasi corrispondenti rispettivamente all'onda T ECG e all'onda R.
6. Sui tracciati in modalità M, misurare il diametro medio sistolico finale LV (LVIDd), il diametro diastolico terminale LV (LVID), lo spessore del setto interventricolare (IVS) e lo spessore della parete posteriore LV (LVPW) da 3-5 battiti cardiaci. Calcola anche la frazione di eiezione (EF) e l'accorciamento della frazione (FS) in base all'ecocardiografia.

4. Colorazione istologica

1. Dopo l'analisi ecocardiografica, sacrificare i topi con l'iniezione intraventricolare di cloruro di potassio al 10%.
2. Perfondere il cuore con circa 30 ml di soluzione salina dopo la dissezione fino a quando il fegato e il polmone diventano pallidi.
3. Asportare il cuore e lavarlo accuratamente in soluzione tampone fosfato per estrudere il sangue.
4. Fissare il cuore in formalina al 4% a temperatura ambiente per 24 ore e trattare il tessuto in una scatola di paraffina in modo che la cera di paraffina si raffreddi e si solidifichi.
5. Tagliare i cuori in fette spesse 5 μm per la colorazione patologica.
6. Decerazione e sezioni reidratate contenenti muscolo papillare.
   1. Incubare i vetrini a 55 °C per 30 min. Quindi, incubare in xilene 2 volte per 2 minuti ciascuno; 100% etanolo 2x per 2 minuti ciascuno; 95% di etanolo 2x per 2 minuti ciascuno; 80% di etanolo per 2 min; 75% di etanolo per 2 min; e 50% di etanolo per 2 min.
7. Macchiare con ematossilina ed eosina (H & E) e la macchia di Masson.

Risultati

Funzione cardiaca
La cardiomiopatia dilatativa è caratterizzata da progressiva dilatazione ventricolare e disfunzione contrattile. La Figura 2 mostra immagini ecocardiografiche rappresentative dei due gruppi. I topi trattati con Dox hanno mostrato una frazione di eiezione ventricolare sinistra marcatamente ridotta e un accorciamento frazionario ventricolare sinistro (Figura 3A,B). Il diametro LV è aumentato anche nella fase...

Discussione

Dox è un farmaco chemioterapico antitumorale periodico non specifico comunemente usato nella pratica clinica¹². Il suo principale effetto collaterale è la cardiotossicità, caratterizzata da cardiomiopatia e successiva insufficienza cardiaca¹³. Il meccanismo sottostante include il danno della perossidazione lipidica miocardica, l'inibizione del reticolo sarcoplasmatico miocardico Ca²⁺-ATPasi e l'attivazione del sistema renninico-angiotensina locale miocardico, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB