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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
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  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per eseguire la manipolazione genetica nel cervello furetto embrionale utilizzando in utero elettroporazione. Questo metodo consente di indirizzare le cellule progenitrici neurali nella neocorteccia in vivo.

Abstract

La manipolazione dell'espressione genica in vivo durante lo sviluppo embrionale è il metodo di scelta quando si analizza il ruolo dei singoli geni durante lo sviluppo dei mammiferi. In utero l'elettroporazione è una tecnica chiave per la manipolazione dell'espressione genica nel cervello di mammifero embrionale in vivo. Qui viene presentato un protocollo per l'elettroporazione in utero della neocorteccia embrionale dei furetti, un piccolo carnivoro. Il furetto è sempre più utilizzato come modello per lo sviluppo della neocorteccia, perché la sua neocorteccia presenta una serie di caratteristiche anatomiche, istologiche, cellulari e molecolari che sono presenti anche nei primati umani e non umani, ma assenti nei modelli di roditori, come il topo o il ratto. In utero l'elettroporazione è stata eseguita al giorno embrionale (E) 33, uno stadio di midneurogenesi in furetto. Nell'elettroporazione in utero si rivolge alle cellule progenitrici neurali che rivestono i ventricoli successivi del cervello. Durante la neurogenesi, queste cellule progenitrici danno origine a tutti gli altri tipi di cellule neurali. Questo lavoro mostra risultati rappresentativi e analisi all'E37, giorno postnatale (P) 1 e P16, corrispondenti rispettivamente a 4, 9 e 24 giorni dopo l'elettroporazione in utero. Nelle fasi iniziali, la progenie delle cellule mirate è costituita principalmente da vari sottotipi di progenitori neurali, mentre nelle fasi successive la maggior parte delle cellule etichettate sono neuroni postmitotici. Così, in utero l'elettroporazione consente lo studio dell'effetto della manipolazione genetica sulle caratteristiche cellulari e molecolari di vari tipi di cellule neurali. Attraverso il suo effetto su varie popolazioni cellulari, in utero l'elettroporazione può essere utilizzata anche per la manipolazione delle caratteristiche istologiche e anatomiche della neocorteccia del furetto. È importante sottolineare che tutti questi effetti sono acuti e vengono eseguiti con una specificità spatiotemporale determinata dall'utente.

Introduzione

La neocorteccia è il foglio esterno del cervello dei mammiferi e la sede delle funzioni cognitive superiori1,2,3,4,5. Per ottenere una manipolazione genetica acuta nella neocorteccia di mammifero in vivo durante lo sviluppo embrionale, sono stati esplorati due diversi metodi: l'infezione virale6 e l'elettroporazione utero7. Entrambi i metodi consentono un targeting efficiente delle cellule neocorticali, ma soffrono di alcune limitazioni. Il principale vantaggio dell'elettroporazione in utero rispetto all'infezione virale è la capacità di raggiungere la specificità spaziale all'interno della neocorteccia, che si ottiene regolando la direzione del campo elettrico.

Dal momento che l'elettroporazione è stata dimostrata per facilitare l'ingresso del DNA nelle cellule in vitro8, è stato applicato per fornire il DNA in vari vertebrati in vivo. Nella neuroscienza dello sviluppo, in utero l'elettroporazione della neocorteccia del topo è stata riportata per la prima volta nel 20019,10. Questo metodo consiste in un'iniezione della miscela di DNA nel ventricolo laterale del cervello embrionale e dalla successiva applicazione del campo elettrico utilizzando elettrodi tweezer, che consente la precisione spaziale7,11. In utero l'elettroporazione è stata poi applicata per fornire acidi nucleici al fine di manipolare l'espressione di geni endogeni o aggiunti ectopicamente nella neocorteccia del topo. Recentemente sono stati compiuti importanti progressi applicando la metodologia dell'editing del genoma mediato da CRISPR/Cas9 tramite l'elettroporazione in utero nella neocorteccia del topo per eseguire (1) l'interruzione genica nei neuroni postmitotici12,13 e le cellule progenitricineurali 14e (2) il genoma15 e l'epigenoma16.

Poco dopo il primo rapporto nel topo, in utero l'elettroporazione è stata applicata alla neocorteccia di rattoembrionale 17,18. I non roditori sono rimasti una sfida fino a quando il primo in utero elettroporazione di furetti, un piccolo carnivoro, è stato segnalato nel 201219,20. Da allora, in utero l'elettroporazione dei furetti è stata applicata per studiare i meccanismi di sviluppo della neocorteccia etichettando progenitori neurali e neuroni20,21,22,23, manipolando l'espressione di geni endogeni, compreso l'uso della tecnologia CRISPR/Cas924, e fornendo geni ectopici21,22,25, compresi i geni specifici dell'uomo26. Inoltre, in utero l'elettroporazione dei furetti è stata utilizzata per affrontare le caratteristiche dello sviluppo umano della neocorteccia in condizionipatologiche 27,28.

Nel contesto dello sviluppo della neocorteccia, i vantaggi dell'uso dei furetti come organismo modello rispetto ai topi sono dovuti al fatto che i furetti ricapitolano meglio una serie di caratteristiche simili a quella umana. A livello anatomico, i furetti presentano un caratteristico modello di piegatura corticale, che è presente anche nell'uomo e nella maggior parte degli altri primati, ma è completamente assente nei topi o nei ratti4,29,30,31. A livello istologico i furetti hanno due distinte zone germicolari subventricolari, denominate zone subventricolari interne ed esterne (rispettivamente ISV e OSV)32,33, separate dallo strato di fibrainterna 23. Queste caratteristiche sono condivise anche con i primati, compresi gli esseri umani, ma non con itopi 34. I fursoli e gli esseri umani sono popolati da abbondanti cellule progenitrici neurali, mentre la zona subventricolare (SV) dei topi contiene solo progenitori neurali sparse21,32,35,36. A livello cellulare, i furetti presentano un'alta percentuale di un sottotipo di progenitori neurali denominati glia radiali basali o esterni (rispettivamente bRG o oRG), che sono considerati strumentali per l'espansione evolutiva della neocorteccia mammifera34,37,38. BRG sono quindi molto abbondanti nella neocorteccia di furetti umani ed embrionali fetali, ma sono molto rari nella neocorteccia di topo embrionale35,36. Inoltre, il furetto bRG mostra un'eterogeneità morfologica simile a quella della bRG umana, di gran lunga superiore al topo bRG21. Infine, a livello molecolare, lo sviluppo della neocorteccia di furetti mostra modelli di espressione genica molto simili a quelli della neocorteccia umana fetale, che si presume controllino lo sviluppo del ripiegamento corticale, tra le altrecose 39.

Le caratteristiche biologiche e molecolari delle cellule del furetto bRG le rendono altamente proliferative, simili a bRG umane. Ciò si traduce in una maggiore produzione di neuroni e lo sviluppo di una neocorteccia espansa e altamente complessa34. Queste caratteristiche rendono i furetti eccellenti organismi modello per lo studio delle caratteristiche umane dello sviluppo della neocorteccia che non possono essere modellate neitopi 26,40. Per sfruttare appieno il furetto come organismo modello è stato sviluppato il metodo presentato. Consiste nell'elettroporazione in utero di embrioni di furetti E33 con un plasmide che esprime GFP (pGFP) sotto il controllo di un promotore onnipresente, CAG. Gli embrioni elettroporati possono quindi essere analizzati embrionalmente o postnatalmente. Al fine di ridurre il numero di animali sacrificati, i furetti femminili (jills) vengono sterilizzati dall'isterectomia e donati per l'adozione come animali domestici. Se gli embrioni mirati vengono raccolti in fasi embrionali, viene eseguito un secondo intervento chirurgico e gli embrioni vengono rimossi da un taglio cesareo, mentre le jills sono isterectomizzate. Se gli embrioni mirati vengono analizzati in fasi postnatali, le jill vengono isterectomizzate dopo che i cuccioli sono stati svezzati o sacrificati. Quindi, viene presentato anche un protocollo per l'isterectomia delle jills.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in accordo con la Legislazione tedesca sul benessere degli animali dopo l'approvazione da parte della Landesdirektion Sachsen (licenze TVV 2/2015 e TVV 21/2017).

1. Preparazione per l'elettroporazione in utero

  1. Preparare la miscela di DNA. In questo protocollo viene utilizzata una concentrazione finale di 1 g/L di pGFP. Sciogliere il DNA in PBS e integrare con 0.1% Fast Green per facilitare la visualizzazione. Una volta preparata, mescolare la miscela di DNA pipettando su e giù più volte o toccando le dita. Conservare a temperatura ambiente fino all'uso.
    NOTA: Per le coelettrorezioni, la miscela di DNA è preparata a contenere una concentrazione finale di 1 g/L di plasmidi codificando un gene di interesse insieme a 0,5 g/L di pGFP diluito in PBS.
  2. Preparare il tavolo operatorio con tutti gli strumenti e gli strumenti necessari.
  3. Pull capillari di vetro utilizzando il puller micropipette. Regolare il diametro della punta capillare tagliando la parte distale del capillare utilizzando le forcetti come descritto in precedenza41.

2. Preparazione dei furetti per l'intervento chirurgico

  1. Tenere le jill incinte con embrioni a E33 di digiuno per almeno 3 h prima dell'intervento chirurgico per ridurre il rischio di vomito.
  2. Prima dell'intervento sterilizzare tutti gli strumenti mediante autoclaving. Eseguire l'intervento in una stanza appositamente assegnata in condizioni asettiche per eliminare potenziali fonti di contaminazione.
  3. Mettere il jill incinta nella scatola narcosi con 4% isoflurane.
  4. Quando anethetized, posizionare il furetto sul tavolo delle operazioni con un pad di calore e collegare la maschera di narcosi con un flusso costante di isoflurane 2-3% al naso. Per garantire il livello appropriato di anestesia, verificare la mancanza dei seguenti riflessi:
    1. Il riflesso palpebrale toccando la pelle periocolare
    2. Il riflesso del flessore pizzicando la pelle tra il 2nd e 3rd, o 3rd e4 dito di entrambi gli arti posteriori
    3. Se il riflesso palpebrale è assente e il riflesso del flessore è chiaramente ridotto, controllare il riflesso del dolore pizzicando un dito di ogni arto posteriore.
      NOTA: Assicurarsi di avere uno stetoscopio a portata di mano per monitorare la frequenza cardiaca e il ritmo, se necessario.
  5. Iniettare il furetto sottocutaneamente con analgesico (0,1 mL di metamizolo, 50 mg/kg di peso corporeo), antibiotico (0,1 mL/kg di peso corporeo di 20 mg/kg di acido a amossicillina) e glucosio (10 mL di soluzione di glucosio 5%).
  6. Posizionare una goccia di soluzione di unguento oculare sugli occhi per prevenire la disidratazione degli occhi durante la procedura chirurgica.
  7. Rasa la pancia del furetto con un rasoio.
  8. Pulire la pelle con acqua e sapone, disinfettare la pancia con lo scrub al 70% di etanolo, disinfettare 2x con iodio e lasciarla asciugare.

3. In utero elettroporazione di furetti

  1. Assicurarsi che l'area chirurgica sia sterile: posizionare strumenti chirurgici sterili su tessuti sterili e cambiare mantello e guanti.
  2. Posizionare un drappo chirurgico sterile sull'animale.
  3. Utilizzando un bisturi, aprire chirurgicamente il ventre all'alba linea con un taglio lungo 5 cm.
  4. Tagliare lo strato muscolare con le forbici.
  5. Posizionare tamponi di garza intorno al sito di incisione e bagnarli con PBS. I tamponi di garza assorbono il PBS aggiuntivo che verrà aggiunto durante l'intervento chirurgico.
    NOTA: Mantenere il calore e il supporto PBS durante l'intervento chirurgico.
  6. Esporre l'utero del furetto e posizionarlo sui tamponi di garza.
  7. Caricare un capillare di vetro con la soluzione di iniezione utilizzando una pipetta con una lunga punta di carico. Assicurarsi che il volume di carico sia approssimativamente compreso tra 5 e 20 L a seconda del numero di embrioni e del numero di diverse condizioni sperimentali. Il volume medio iniettato per embrione è di 3-5 L. Collegare il capillare di vetro caricato a un supporto e collegare l'altro lato del supporto a un tubo e a un boccaglio.
  8. Ispezionare il primo embrione e trovare la testa.
  9. Posizionare la sorgente di luce in fibra ottica accanto alla testa dell'embrione per facilitare la visualizzazione.
    NOTA: Le pareti uterino di Ferret sono molto scure, ed è difficile attraverso di esse, a meno che la luce non sia brillata direttamente su di esse.
  10. Eseguire una singola iniezione intraventricolare nel ventricolo di uno degli emisferi cerebrali e mantenere l'altro emisfero intatto per servire come controllo interno. Il ventricolo in sé non è facilmente distinto dall'occhio, quindi la sua posizione è stimata in base alla posizione dell'iride pigmentata, che è visibile. L'iniezione intraventricolare viene effettuata prendendo il supporto attaccato al vetro capillare e penetrando la pelle, il cranio e il tessuto cerebrale con la punta del capillare di vetro.
    NOTA: Assicurarsi di non danneggiare la placenta, che è più scura della placenta murina.
    1. Quando la punta del capillare di vetro è nel ventricolo, iniettare circa 3-5 L della soluzione di iniezione mediante la tubazione della bocca utilizzando il boccaglio collegato al portacapivolare in vetro. Poiché la soluzione iniettata contiene lo 0,1% di Fast Green, il ventricolo iniettato ora diventerà verde scuro e sarà visibile come struttura a forma di rene.
  11. Posizionare gli elettrodi tweezer sull'utero sopra la testa dell'embrione in modo che il polo positivo sia posizionato sopra l'area che verrà presa di mira e il polo negativo sotto l'area iniettata.
  12. Impostare le seguenti condizioni di elettroporazione sull'elettroporatore: lunghezza dell'impulso - 50 ms; Tensione a impulsi 100 V; Intervallo di impulso : 1 s; Numero di impulsi - 5. Quindi, premere il pulsante" Pulse" sull'elettroporatore.
  13. Far cadere rapidamente diverse gocce di 1x PBS caldo sull'embrione elettroporato.
  14. Ripetere la procedura per tutti gli embrioni. Mantenere l'utero costantemente bagnato con PBS caldo.
    NOTA: Se i primi embrioni rivolti verso la vagina non sono facilmente accessibili, è meglio non elettroporati.
  15. Quando tutti gli embrioni sono elettroporati, rimuoviare l'utero nella cavità peritoneale.
  16. Sutura lo strato muscolare con il peritoneo utilizzando una sutura 4-0.
  17. Suturare la pelle utilizzando lo stesso spessore e spruzzare la ferita con spray in alluminio.
  18. Mettere l'animale in una gabbia e tenerlo caldo con una fonte di calore. Monitorare attentamente l'animale fino a quando non si sveglia.

4. Cura postoperativa e alloggio di animali mirati

  1. Per 3 giorni dopo l'intervento assicurarsi che gli animali siano sottoposti alle seguenti cure postoperatorie: 20 mg/kg di amoxicillina (antibiotica) 1 volte al giorno; 25 mg/kg metamizol (analgesico) 3 volte al giorno.
  2. Assicurarsi che i furetti siano alloggiati singolarmente.
  3. Assicurarsi che i furetti siano esaminati da un veterinario almeno 1x al giorno.
  4. Assicurarsi che i furetti siano disturbati il meno possibile durante la consegna.
  5. Dopo che i cuccioli sono svezzati o sacrificati, preparare le jill per l'isterectomia.

5. Isterectomia dei furetti

NOTA: Viene eseguita un'isterectomia per ridurre il numero di animali sacrificati in modo che gli animali sterilizzati possano essere donati per l'adozione come animali domestici. La procedura prechirurgica per l'isterectomia è la stessa del passaggio 2.

  1. Rasare e sterilizzare la pancia del furetto come descritto nei punti 3.1 e 3.2.
  2. Aprire chirurgicamente il ventre alla linea alba. Tagliare lo strato muscolare. Sollevare lo strato muscolare e riparo l'intestino con un dito mentre si apre completamente lo strato muscolare.
  3. Posizionare tamponi di garza intorno al sito di incisione e bagnarli con PBS sterili. Esporre l'utero furetto e le ovaie e metterli sui tamponi di garza.
  4. Avviare l'isterectomia da un lato legando l'arteria ovarica e vena ovarica cranial al mesovar. Mettere un morsetto su ogni lato della legatura ed eseguire un altro cranico legatura ai morsetti. Fissare il terzo morsetto alle estremità della legatura per salvarli. Ripetere sull'altro lato.
  5. Tagliare tra i morsetti e staccare il cornua uteri dal mesentery su entrambi i lati.
  6. Ligate l'arteria uterina su entrambi i lati uteretti caudal per l'omeri uteri. Poi ligate la vagina e fissare la legatura. Fissare il morsetto alle estremità delle legature per salvarle. Mettere due morsetti cranial alla legatura. Tagliare tra i morsetti e staccare l'utero dalla vagina. Rimuovere l'utero e le ovaie e smaltirli. Raschiare la membrana mucosa residua dal culo dell'utero.
  7. Staccare tutti i morsetti rimanenti e accorciare le estremità della legatura. Assicurarsi di controllare il sanguinamento dopo che i morsetti sono stati rimossi.
  8. Sutura lo strato muscolare e la pelle come descritto nei punti 3.16 e 3.17. Seguire il protocollo postoperatorio come nei passaggi 3.18 e 4.1–4.3. Tenere gli animali nella struttura animale per almeno 2 settimane con visite veterinarie regolari. Dopo che gli animali sono stati completamente recuperati, possono essere donati per l'adozione.

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Risultati

In utero l'elettroporazione dei furetti all'E33 ha portato al targeting delle cellule del progenitore neurale che rivestono la superficie ventricolare della neocorteccia embrionale (Figura 1). Queste cellule sono chiamate progenitori apici e sono altamente proliferative, dando origine a tutti gli altri tipi di cellule durante lo sviluppo. Sulla divisione asimmetrica, i progenitori apici hanno generato un altro progenitore afonico e una cellula più differenziata, tipicamente un progenitore b...

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Discussione

In utero l'elettroporazione nel furetto è una tecnica importante, con vantaggi e svantaggi rispetto ad altri metodi. Esistono passaggi critici e limitazioni a questo metodo, nonché potenziali modifiche e applicazioni future da tenere a mente.

Dal lavoro pionieristico di Victor Borrell e colleghi sulla manipolazione genetica della neocorteccia di furetti postnatali tramite elettroporazione o iniezione virale35,42,

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Siamo grati ai Servizi e Alle Strutture del Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics per l'eccezionale supporto fornito, in particolare l'intero team dei servizi biomedici (BMS) per l'eccellente allevamento di furetti e J. Peychl e il suo team del Light Microscopy Facility. Siamo particolarmente grati a Katrin Reppe e Anna Pfeffer del BMS per l'eccezionale supporto veterinario e a Lei Xing del gruppo Huttner per aver assistito con interventi chirurgici in furetto.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1ml syringeBD309628Electroporation
4-0 Vicryl sutureEthiconV392ZGSurgery
Aluminium spraycp-pharma98017Surgery
Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU)WDT6301Surgery
Cappilary holderWPIMPH6S12Electroporation
Dexpanthenol Ointment solutionBayer6029009.00.00Surgery
Drape sheet 45x75cmHartmann2513052Surgery
Electrode Tweezer, platinum plated 5mmBTX45-0489Electroporation
ElectroporatorBTXECM830Electroporation
Fast GreenSigmaF7258-25GElectroporation
Ferret Mustela putorius furoMarshallNAExperimental organism
Fiber optic light sourceOlympusKL1500LCDElectroporation
ForcepsAllgaier instrumente08-033-130Surgery
Forceps 3C-SARubis Tech3C-SASurgery
Forceps 55Dumostar11295-51Surgery
Forceps 5-SARubis Tech5-SASurgery
Gauze swabs largeHartmann401723Surgery
Gauze swabs smallHartmann401721Surgery
GFAP antibodyDakoZ0334Antibody
GFP antibodyAves labsGFP1020Antibody
Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length)Sutter InstrumentBF120-69-10Electroporation
GlucoseBela-pharmK4011-02Surgery
Heat padHans DinslageSanitas SHK18Surgery
Iodine (Betadine solution 100 mg/ml)Meda997437Surgery
IsofluranCP21311Surgery
Loading tips 20µlEppendorf#5242 956.003Electroporation
MetamizolWDT99012Surgery
Metzenbaum dissecting scissorsAesculapBC600RSurgery
Micropipette pullerSutter InstrumentModel P-97Electroporation
pCAGGS-GFPNANAFrom Kalebic et al., eLife, 2018
PCNA antibodyMilliporeCBL407Antibody
pH3 antibodyAbcamab10543Antibody
ScalpelAesculap294200104Surgery
ShaverBraunEP100Surgery
Sox2 antibodyR+D SystemsAF2018Antibody
Surgical clamp 13cmWDT27080Surgery
Surgical double spoon (Williger)WDT27232Surgery
Surgical drapeWDT28800Surgery
Surgical scissors smallFST14090-09Surgery
Suturing needle holderAesculapBM149RSurgery
Tbr2 antibodyAbcamab23345Antibody
Transfer pipette 3mlFischer scientific13439108Surgery
Water bathJulaboTW2Surgery

Riferimenti

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