In Vivo Targeting di cellule tumorali umane Xenografted con nanoparticelle di silice fluorescenti funzionalizzate nel pesce zebra

Riepilogo

Descritto qui è un metodo per utilizzare gli embrioni di pesce zebra per studiare la capacità delle nanoparticelle funzionalizzate di colpire le cellule tumorali umane in vivo. Questo metodo consente la valutazione e la selezione di nanoparticelle ottimali per test futuri su animali di grandi dimensioni e in studi clinici.

Abstract

Lo sviluppo di nanoparticelle in grado di rilevare, colpire e distruggere le cellule tumorali è di grande interesse nel campo della nanomedicina. I modelli animali in vivo sono necessari per colmare la nanotecnologia con la sua applicazione biomedica. Il topo rappresenta il modello animale tradizionale per la prova preclinica; tuttavia, i topi sono relativamente costosi da mantenere e hanno lunghi cicli sperimentali a causa della progenie limitata da ogni madre. Il pesce zebra è emerso come un potente sistema modello per la ricerca sullo sviluppo e biomedica, compresa la ricerca sul cancro. In particolare, grazie alla sua trasparenza ottica e al rapido sviluppo, gli embrioni di pesce zebra sono adatti per il monitoraggio in tempo reale in vivo del comportamento delle cellule tumorali e delle loro interazioni con il loro microambiente. Questo metodo è stato sviluppato per introdurre in sequenza le cellule tumorali umane e le nanoparticelle funzionalizzate negli embrioni trasparenti di pesce zebra Casper e monitorare il riconoscimento in vivo e il targeting delle cellule tumorali da parte delle nanoparticelle in tempo reale. Questo protocollo ottimizzato mostra che le nanoparticelle etichettate in fluorescenza, che sono funzionalizzate con gruppi di folati, possono riconoscere e colpire specificamente le cellule tumorali epiteliali cervicali umane metastatiche etichettate con un'altra fluorochroma. Il processo di riconoscimento e targeting può avvenire già 30 minuti postinizione delle nanoparticelle testate. L'intero esperimento richiede solo l'allevamento di poche coppie di pesci adulti e richiede meno di 4 giorni per essere completato. Inoltre, gli embrioni di pesce zebra non dispongono di un sistema immunitario adattivo funzionale, che consente l'innesto di una vasta gamma di cellule tumorali umane. Pertanto, l'utilità del protocollo qui descritto consente il test di nanoparticelle su vari tipi di cellule tumorali umane, facilitando la selezione di nanoparticelle ottimali in ogni contesto di cancro specifico per i futuri test nei mammiferi e nella clinica.

Introduzione

Lo sviluppo di nanoparticelle in grado di rilevare, colpire e distruggere le cellule tumorali è di grande interesse sia per i fisici che per i ricercatori biomedici. L'emergere della nanomedicina ha portato allo sviluppo di diverse nanoparticelle, come quelle coniugate con ligande bersaglio e/o farmaci chemioterapici^1,2,3. Le proprietà aggiunte delle nanoparticelle consentono la loro interazione con il sistema biologico, rilevando e monitorando gli eventi biologici con alta efficienza e precisione insieme ad applicazioni terapeutiche. Le nanoparticelle di oro e ossido di ferro sono utilizzate principalmente nelle applicazioni di tomografia computerizzata e risonanza magnetica, rispettivamente. Mentre le attività enzimatiche delle nanoparticelle di oro e ossido di ferro consentono di rilevare le cellule tumorali attraverso saggi colorimetrici, le nanoparticelle fluorescenti sono adatte per le applicazioni di imaging in vivo⁴. Tra queste, le nanoparticelle fluorescenti ultrabro sono particolarmente utili, a causa della loro capacità di rilevare precocemente i tumori con meno particelle e meno tossicità⁵.

Nonostante questi vantaggi, le nanoparticelle richiedono la sperimentazione utilizzando modelli animali in vivo per la selezione di nanomateriali adatti e l'ottimizzazione del processo di sintesi. Inoltre, proprio come i farmaci, le nanoparticelle si basano su modelli animali per test preclinici per determinarne l'efficacia e le tossicità. Il modello preclinico più utilizzato è il topo, che è un mammifero la cui manutenzione ha un costo relativamente elevato. Per gli studi sul cancro, topi geneticamente modificati o topi xenopianti sono in genere^{utilizzati 6,7}. La durata di questi esperimenti spesso si estende da settimane a mesi. In particolare, per gli studi sulla metastasi del cancro, le cellule tumorali vengono iniettate direttamente nel sistema circolatorio dei topi in luoghi come le vene della coda e le milza^8,9,10. Questi modelli rappresentano solo le fasi finali della metastasi quando le cellule tumorali stravasano e colonizzano organi distanti. Inoltre, a causa di problemi di visibilità, è particolarmente difficile monitorare la migrazione delle cellule tumorali e il targeting delle nanoparticelle delle cellule tumorali nei topi.

Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un potente sistema di vertebrati per la ricerca sul cancro a causa della sua elevata fecondità, basso costo, rapido sviluppo, trasparenza ottica e conservazione genetica^11,12. Un altro vantaggio del pesce zebra rispetto al modello murino è la fecondazione delle uova di pesce ex utero, che consente agli embrioni di essere monitorati durante il loro sviluppo. Lo sviluppo embrionale è rapido nel pesce zebra, e nel giro di 24 ore postfertilizzazione (hpf), il piano del corpo vertebrato ha già^{formato 13}. Con 72 hpf, le uova vengono schiuse dal chorion, passando dallo stadio embrionale a quello della frittura. La trasparenza del pesce zebra, il ceppo Casper in particolare¹⁴, offre un'opportunità unica per visualizzare la migrazione delle cellule tumorali e il loro riconoscimento e targeting da parte di nanoparticelle in un animale vivente. Infine, i pesci zebra sviluppano il loro sistema immunitario innato di 48 hpf, con il sistema immunitario adattivo in ritardo e diventando funzionale solo a 28 giorni di postferilizzazione¹⁵. Questo lasso di tempo è ideale per il trapianto di vari tipi di cellule tumorali umane in embrioni di pesce zebra senza sperimentare rifiuti immunitari.

Descritto qui è un metodo che sfrutta la trasparenza e il rapido sviluppo del pesce zebra per dimostrare il riconoscimento e il targeting delle cellule tumorali umane da nanoparticelle fluorescenti in vivo. In questo saggio, le cellule tumorali cervicali umane (cellule HeLa) geneticamente progettate per esprimere una proteina fluorescente rossa sono state iniettate nell'area vascolarizzata nella cavità perivitellina di embrioni da 48 hpf. Dopo 20-24 h, le cellule HeLa si erano già diffuse in tutti gli embrioni attraverso il sistema circolatorio dei pesci. Gli embrioni con metastasi apparente sono stati microiniettati con 0,5 nL di una soluzione di nanoparticelle direttamente dietro l'occhio, dove si trova il ricco letto capillare. Utilizzando questa tecnica, le nanoparticelle di silice fluorescenti ultra-abrasa possono colpire le cellule HeLa con una velocità di 20-30 min di postiniezione. Grazie alla sua semplicità ed efficacia, il pesce zebra rappresenta un robusto modello in vivo per testare una varietà di nanoparticelle per la loro capacità di colpire specifiche cellule tumorali.

Protocollo

Tutte le procedure relative agli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Boston University School of Medicine nell'ambito del protocollo: PROTO201800543.

1. Generazione di embrioni di pesce zebra Casper

1. Scegli pesci Casper adulti di almeno 3 mesi di età per l'allevamento naturale per generare embrioni trasparenti di pesce zebra Casper.
2. Riempire le vasche di accoppiamento a due camere con acqua di pesce la sera, separare le vasche superiori con divisori, posizionare un pesce maschio in un lato della camera e uno o due pesci femmina nell'altro lato della camera, e lasciare il pesce separato durante la notte da divisori.
3. Estrarre i divisori la mattina successiva alle 8:00 quando le luci sono accese. Aggiungere piante di arricchimento artificiale e inclinare leggermente la camera superiore per creare una zona poco profonda di acqua. Lasciare che il pesce si riproducono per 3-4 h.
4. Sollevare le camere superiori delle vasche di accoppiamento che contengono i pesci e restituirli alle loro vasche originali.
5. Raccogliere le uova situate nelle camere inferiori versando l'acqua attraverso una rete a rete. Trasferire le uova in un piatto Petri sterile ad una densità non superiore a 200 uova per piatto. Rimuovere eventuali uova morte o non leferte e riempire il piatto 2/3 pieno di acqua di pesce fresco.
   NOTA: Le uova fecondate e sane devono essere traslucide e rotonde. Tutte le uova torbide, bianche o sfigurate devono essere rimosse. L'acqua di pesce è ottenuta da vasche di pesce nell'impianto ittici.
6. Incubare gli embrioni nell'incubatrice a 28,5 gradi centigradi durante la notte.
7. Sbiancare gli embrioni la mattina successiva utilizzando il protocollo standard, come descritto nel libro¹⁶del pesce zebra, e rimettere gli embrioni nell'incubatrice (passaggio facoltativo).
8. Togliere gli embrioni da 24 hpf dall'incubatrice nel pomeriggio e dechorionate gli embrioni usando il pronase.
   1. Togliere quanta più acqua di pesce possibile dagli embrioni nel piatto Petri e aggiungere qualche goccia della soluzione pronase (1 mg/mL in acqua di pesce) al piatto. Girare delicatamente il piatto Petri. Una volta che i choriion mostrano segni di disintegrazione, pipetta gli embrioni su e giù un paio di volte per abbattere i choriions per rilasciare gli embrioni.
   2. Aggiungere acqua di pesce fresco immediatamente nel piatto Petri per terminare il processo una volta che la maggior parte degli embrioni sono fuori dai chorions. Sciacquare gli embrioni 3 volte di più usando acqua di pesce per rimuovere i chorions galleggianti. Riportare gli embrioni all'incubatrice.

2. Preparazione delle cellule tumorali umane per il trapianto

1. Impostare la temperatura dell'incubatrice esattamente a 35,5 gradi centigradi. Monitorare l'incubatrice per garantire una temperatura costante e stabile utilizzando un termometro all'interno dell'incubatrice.
2. Autoclave 1 L di acqua di pesce in una bottiglia di vetro. Fare una soluzione di agarose del 3% aggiungendo 3 g di agarose di grado elettroforesi a 100 mL di acqua di pesce autoclaved e microwaving fino a quando l'agarose è completamente dissolto.
   1. Versare la soluzione di agarose calda in un piatto Petri fino a quando non è pieno 3/4. Posizionare lo stampo di microiniezione sull'agarose. Assicurarsi che lo stampo non sia in contatto con il fondo del piatto Petri e che non si forlighi bolle sotto.
   2. Lasciare che la soluzione solidifica e rimuova con cura lo stampo dalla piastra. Riempire il piatto con acqua di pesce autoclave e conservare il piatto a 4 gradi centigradi. Preguerre la piastra di agarose e l'acqua di pesce nell'incubatrice di 35,5 gradi centigradi prima di raccogliere le cellule HeLa.
3. Tirare 1,0 mm O.D. x 0,78 mm di vetro borosilicato capillari di vetro su un puller di pipette utilizzando le seguenti impostazioni: pressione a 500, calore a 560, tirare a 100, velocità a 100 e tempo/ritardo a 200. Conservare gli aghi sul maccolo in un grande piatto Petri che è stato pulito con un asciugamano di etanolo.
   CAUTION: Gli aghi tirati sono molto affilati e fragili. Prestare attenzione durante la gestione.
4. Preparare una soluzione di stock di metanosulfonato tricaina (MS222, 4 mg/mL) sciogliendo MS222 in acqua di pesce autoclave. Vortice ben prima dell'uso. Diluire la soluzione di stock MS222 1:100 in acqua di pesce (ad esempio, aggiungere 200 L della soluzione di stock MS222 a 20 mL di acqua di pesce ad una concentrazione finale di 40 g/mL) per anestetizzare gli embrioni per le seguenti procedure.
5. Culture hLabel HeLa cellule traducendole con PLenti6.2_miRFP670 lentivirus utilizzando il protocollo descritto¹⁷. Raccogliere le cellule di HeLa RFP 30 min-1 h prima del trapianto.
   NOTA: Le cellule Human HeLa sono state covate in un incubatore di coltura tissu/tessuto fino al 70% di confluenza in un mezzo di crescita completa (mezzo DMEM con 10% DI FBS) a 37 gradi centigradi integrato con 5% CO₂.
   1. Rimuovere il mezzo cellulare HeLa da aspirazione in una cappa di coltura tissure. Risciacquare brevemente lo strato cellulare con PBS sterile per rimuovere tutte le tracce del siero.
   2. Aggiungere 3,0 mL di soluzione trypsin-EDTA sterile a un pallone T-75 e riporre le cellule nell'incubatore di coltura dei tessuti da 37 gradi centigradi per 3-5 minuti per facilitare la digestione enzimatica. Osservare il flacone al microscopio fino a quando l'80% delle cellule viene sospeso.
   3. Aggiungere 6-8 mL di mezzo di crescita completa nel pallone. Raccogliere le cellule in un tubo sterile di 15 mL mediante pipettatura delicatamente. Centrifuga a 135 x g per 5 min.
   4. Aspirare le cellule HeLa supernante e risundere in 3 mL di mezzo di crescita completa. Ripetere il passaggio di lavaggio 2x sopra. Risundere le cellule in 1 mL di mezzo di crescita completa e contare le cellule al microscopio utilizzando un emocitometro.
   5. Far girare di nuovo le cellule verso il basso, rimuovere il supernatante e risundere le cellule in un tubo di microcentrifuge da 1,5 mL ad una concentrazione di 5 x 10⁷ cellule/mL. Mantenere le cellule calde tenendo il tubo in una mano durante il trasporto all'impianto ittici.
      NOTA: Mantenere sempre le cellule calde conservando le cellule all'interno dell'incubatrice di 35,5 gradi centigradi prima o durante l'iniezione degli embrioni.

3. Trapianto di cellule tumorali umane

1. Pulire l'area di lavoro utilizzando asciugamani di etanolo prima del trapianto (ad esempio, forbici, pinzette, pipette di plastica, lame di rasoio).
2. Allineare gli embrioni all'interno delle scanalature della piastra di agarose utilizzando una pipetta di plastica. Posare gli embrioni sul lato con l'anteriore rivolto in avanti.
   NOTA: Assicurarsi che l'acqua di pesce copra gli embrioni. Mettere da parte alcuni embrioni per non iniettare cellule tumorali e utilizzare come controlli.
3. Accendere la sorgente d'aria e il microiniettore. Togliere le cellule HeLa dall'incubatrice e pipette le cellule su e giù 20-30x utilizzando una punta P200. Caricare immediatamente 3 L della miscela cellulare in un ago utilizzando una punta di carico gel con un'estremità tagliata. Inserire con attenzione la punta verso l'estremità inferiore tagliente dell'ago. Se necessario, agitare l'ago per assicurarsi che la miscela cellulare si muove lungo l'ago per riempire l'estremità tagliente.
   1. Inserire l'ago nel supporto dell'ago. Utilizzare un paio di pinzette per rompere con attenzione la punta dell'ago. Regolare la pressione e la durata del tempo sul microiniettore per spingere fuori tutte le bolle d'aria all'interno della punta dell'ago. Ridurre la pressione e il tempo di iniezione fino a quando la dimensione delle goccioline di iniezione è di 1 nL.
   2. Posizionare la piastra di iniezione al microscopio in una posizione appropriata per avere il lato del tuorlo degli embrioni rivolto verso l'ago. Anestesizzare gli embrioni aggiungendo cinque gocce della soluzione MS222 diluita (40 g/mL).
   3. Posizionare l'iniettore e lasciare che l'ago tocchi la cavità perivitellina di ogni embrione.
4. Iniviare la miscela cellulare negli embrioni nell'area vascolarizzata sotto la cavità perivitellina premendo il pedale del piede.
5. Utilizzare la mano nondominante per spostare la piastra di iniezione all'embrione successivo. Utilizzare la mano dominante per estendere e ritrarre l'iniettore premendo contemporaneamente il pedale del piede per continuare l'iniezione. Pipetta qualche goccia di acqua di pesce sterile sugli embrioni che sono stati iniettati. Una volta completata l'iniezione di tutti gli embrioni sulla piastra, lavare gli embrioni con acqua di pesce sterile, metterli su un piatto Petri sterile e spostarli immediatamente nell'incubatrice da 35,5 gradi centigradi.
6. Dopo 3 h, esaminare gli embrioni iniettati e rimuovere quelli morti.
7. Riportare gli embrioni vivi all'incubatrice di 35,5 gradi centigradi e incubarli per 20-24 h per consentire alle cellule HeLa di diffondersi dal sito di iniezione ad altre parti del corpo.
   NOTA: Gli embrioni sono conservati nell'incubatrice di 35,5 gradi centigradi per consentire la sopravvivenza e la migrazione delle cellule tumorali umane perché le cellule non fanno bene a 28,5 gradi centigradi, gli embrioni di pesce a temperatura sono normalmente incubati.

4. Iniezione di nanoparticelle o veicoli

1. Anestetizzare gli embrioni trapiantati la mattina successiva con cinque gocce di soluzione MS222 diluita. Non aggiungere troppo MS222, perché questo ucciderà gli embrioni. Sotto un microscopio fluorescente, raccogliere con cura gli embrioni con metastasi della coda delle cellule RFP HeLa e collocarli in un nuovo piatto Petri con acqua di pesce sterile.
2. Fare gli aghi di iniezione come descritto in precedenza nella sezione 2 utilizzando le seguenti impostazioni: pressione a 500, calore a 645, tirare a 60, velocità a 50 e tempo/ritardo a 100.
3. Seguire le procedure descritte ai punti 3.1-3.3 per allineare gli embrioni e caricare il veicolo (ad esempio, H₂O) o la soluzione delle nanoparticelle nell'ago.
4. Iniettare 0,5 nL di soluzione di nanoparticelle da 1 mg/mL dietro l'occhio e continuare l'iniezione come descritto nei punti 3.5-3.6 (Figura 1B). Questa posizione dietro gli occhi è arricchita da capillari, permettendo alle nanoparticelle di entrare in circolazione.
5. A seguito di una procedura analoga, iniettare il veicolo (ad esempio, H₂O) utilizzato per sospendere le nanoparticelle negli embrioni con cellule HeLa trapiantate e quelle senza (cioè i controlli)(Figura 1A, C).
6. Incubare tutti gli embrioni iniettati a 35,5 gradi centigradi.

5. Imaging e tracciamento di nanoparticelle e cellule tumorali

1. Esaminare gli embrioni iniettati al microscopio fluorescente a 0, 30, 60, 90, 120, 180 e 210 min postinjection di nanoparticelle per monitorare la loro distribuzione in circolazione e il grado di targeting delle cellule tumorali. Il targeting delle cellule tumorali da parte delle nanoparticelle può essere osservato già 30 minuti dopo l'espulsione a seconda del tipo di nanoparticelle testate.
2. Pipetta 2-3 embrioni in un piatto Petri e immobilizzarli aggiungendo cinque gocce di soluzione MS222 diluita (40 g/mL). Una volta che gli embrioni smettono di nuotare, rimuovere la maggior parte dell'acqua per consentire agli embrioni di sdraiarsi sui loro lati.
3. Utilizzare una pipetta con un pennello sottile e morbido attaccato alla sua estremità per allineare gli embrioni in modo che si trovino sui lati con l'anteriore rivolto in avanti e un solo occhio visibile.
4. Immagine degli embrioni in rosso, blu e canale di campo luminoso a basso ingrandimento (2x) per catturare l'intero embrione e ripetere ad un ingrandimento più elevato (6,4x) per catturare l'area della coda. Concentrare l'embrione sotto il canale rosso per evitare il sanguinamento delle nanoparticelle.
   NOTA: gli embrioni non devono muoversi durante l'imaging. Qualsiasi movimento porterà a immagini sfocate e all'incapacità di sovrapporre immagini da canali diversi.
5. Aggiungere acqua di pesce fresco agli embrioni subito dopo l'imaging e restituirli all'incubatrice. Ripetere i passaggi 5.2-5.4 per visualizzare gli embrioni in punti di tempo diversi.

Risultati

Lo schema del protocollo illustrato nella Figura 1 illustra le procedure generali per questo studio. Sono stati allevati pesci adulti maschi e femmine trasparenti Casper per generare embrioni (sezione 1). Le cellule di HeLa di RFP sono state iniettate nell'area vascolarizzata sotto la cavità pervitellina degli embrioni di pesce zebra a 48 hpf, con embrioni non iniettati come controlli (sezione 3). Per gli individui con esperienza nella microiniezion...

Discussione

Il protocollo qui descritto utilizza il pesce zebra come un sistema in vivo per testare la capacità delle nanoparticelle di riconoscere e colpire le cellule tumorali umane metastatiche. Diversi fattori possono influire sul successo dell'esecuzione degli esperimenti. In primo luogo, gli embrioni devono essere completamente sviluppati a 48 hpf. La corretta fase di sviluppo degli embrioni consente loro di sopportare e sopravvivere al trapianto di cellule tumorali umane. Gli embrioni di età inferiore a 48 hpf hanno un tass...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122