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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Eventi di vita stressanti compromettono la funzione cognitiva, aumentando il rischio di disturbi psichiatrici. Questo protocollo illustra come lo stress influisce sulla flessibilità cognitiva utilizzando un paradigma automatizzato di cambiamento della strategia operante nei ratti Sprague Dawley maschi e femmine. Vengono discusse aree cerebrali specifiche alla base di particolari comportamenti e viene esplorata la rilevanza traslazionale dei risultati.

Abstract

Lo stress influisce sulla funzione cognitiva. Se lo stress migliora o compromette la funzione cognitiva dipende da diversi fattori, tra cui il tipo 1), l'intensità e la durata del fattore di stress; 2) tipo di funzione cognitiva in studio; e 3) tempistica del fattore di stress in relazione all'apprendimento o all'esecuzione del compito cognitivo. Inoltre, le differenze di sesso tra gli effetti dello stress sulla funzione cognitiva sono state ampiamente documentate. Qui è descritto un adattamento di un paradigma automatizzato di cambiamento della strategia operante per valutare come le variazioni dello stress influenzano la flessibilità cognitiva nei ratti Sprague Dawley maschi e femmine. In particolare, lo stress da contenimento viene utilizzato prima o dopo l'allenamento in questo compito basato sull'operante per esaminare come lo stress influisce sulle prestazioni cognitive in entrambi i sessi. Particolari aree cerebrali associate a ciascun compito in questo paradigma automatizzato sono state ben consolidate (cioè la corteccia prefrontale mediale e la corteccia orbitofrontale). Ciò consente manipolazioni mirate durante l'esperimento o la valutazione di particolari geni e proteine in queste regioni al completamento del paradigma. Questo paradigma consente anche il rilevamento di diversi tipi di errori di prestazione che si verificano dopo lo stress, ognuno dei quali ha substrati neurali definiti. Sono inoltre identificate differenze di sesso distinte negli errori perseveranti dopo un ripetuto paradigma di stress di contenimento. L'uso di queste tecniche in un modello preclinico può rivelare come lo stress colpisce il cervello e compromette la cognizione nei disturbi psichiatrici, come il disturbo da stress post-traumatico (PTSD) e il disturbo depressivo maggiore (MDD), che mostrano marcate differenze sessuali nella prevalenza.

Introduzione

Nell'uomo, gli eventi stressanti della vita possono compromettere la funzione cognitiva (cioè la flessibilità cognitiva1), che denota la capacità di adattare le strategie di elaborazione cognitiva per affrontare nuove condizioni nell'ambiente2. La compromissione della cognizione precipita ed esacerba molti disturbi psichiatrici, come il disturbo da stress post traumatico (PTSD) e il disturbo depressivo maggiore (MDD)3,4. Questi disturbi sono due volte più diffusi nelle femmine5,6,7,8, ma la base biologica di questa disparità rimane sconosciuta. Gli aspetti del funzionamento esecutivo negli esseri umani possono essere valutati utilizzando il Wisconsin Card Sorting Task, una dimostrazione di flessibilità cognitiva2. Le prestazioni in questo compito sono compromesse nei pazienti con PTSD9 e MDD10, ma la base neurale di questo cambiamento può essere esaminata solo dall'imaging cerebrale11.

I progressi nella comprensione di come lo stress influisce sul cervello sono stati fatti attraverso l'uso di modelli animali, in particolare roditori. Poiché la flessibilità cognitiva è influenzata nelle malattie legate allo stress, è un fenotipo eccezionalmente rilevante da esaminare nei roditori. Ad oggi, la maggior parte della letteratura di neurobiologia dello stress ha utilizzato un paradigma alternativo di flessibilità cognitiva (a volte indicato come il compito di scavo)12,13,14,15. Mentre questo compito è stato ampiamente controllato, richiede più tempo e sforzi da parte dello sperimentatore per addestrare i roditori. Adattato e descritto qui è un protocollo di set-shifting automatizzato ben consolidato16 per valutare la flessibilità cognitiva nei ratti Sprague Dawley maschi e femmine utilizzando vari modelli di stress17,18. La procedura richiede una supervisione minima da parte dello sperimentatore e consente di testare più ratti contemporaneamente. Inoltre, a differenza di altre versioni di questo compito automatizzato19, l'adattamento di questo paradigma richiede solo 3 giorni di formazione e include un'efficiente analisi dei dati programmata.

Se lo stress migliora o compromette la funzione cognitiva dipende dal tipo, dall'intensità e dalla durata del fattore di stress, nonché dai tempi del fattore di stress in relazione all'apprendimento o all'esecuzione di un compito cognitivo20,21. Pertanto, il protocollo incorpora procedure di stress sia prima che dopo l'allenamento operante. Esamina anche i risultati rappresentativi degli studi sullo stress. Inoltre, le regioni cerebrali alla base di particolari aspetti del set-shifting sono state ben consolidate2,16,22; pertanto, il rapporto descrive anche come indirizzare e valutare particolari regioni del cervello durante o dopo le procedure di spostamento dello stress e della strategia.

C'è stata una ricerca limitata sull'esame diretto delle differenze sessuali nella flessibilità cognitiva18,23.  Il protocollo descrive come 1) incorporare ratti maschi e femmine nel paradigma sperimentale, quindi 2) tracciare cicli estrali prima e durante le procedure nelle femmine che pedalano liberamente. Studi precedenti hanno indicato che lo stress prima dell'allenamento operante può portare a deficit specifici del sesso nella flessibilità cognitiva nei ratti17. In particolare, i ratti femmina mostrano interruzioni nella flessibilità cognitiva dopo lo stress, mentre la flessibilità cognitiva migliora nei ratti maschi dopo lo stress17. È interessante notare che un importante segno distintivo dei disturbi psichiatrici legati allo stress, che hanno un'incidenza distorta dal sesso negli esseri umani, è l'inflessibilità cognitiva. Questi risultati suggeriscono che le femmine possono essere più vulnerabili a questo tipo di deterioramento cognitivo rispetto ai maschi. L'uso di queste tecniche nei modelli animali farà luce sugli effetti dello stress sul cervello e su come compromette la cognizione nei disturbi psichiatrici negli esseri umani.

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Protocollo

Tutte le procedure in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Bryn Mawr College. Ottenere l'approvazione IACUC o altrimenti applicabile prima di ordinare animali da laboratorio e iniziare la sperimentazione.

1. Preparazione animale

  1. Acquisire ratti Sprague Dawley adulti maschi e femmine.
    NOTA: I ratti possono essere partorito prima dei 65 giorni di età, ma non iniziano le procedure fino a dopo questo punto per garantire che sia i maschi che le femmine siano completamente maturi.
  2. Ratti dello stesso sesso a coppia il più a lungo possibile, poiché l'isolamento a lungo termine è un fattore di stress24. Per la restrizione alimentare, ospitare da soli i ratti appena prima del protocollo di spostamento della strategia operante.
  3. Dopo 1 settimana di acclimatazione, iniziare delicatamente a maneggiare i ratti per 3-5 minuti al giorno. Raccogli il peso corporeo di ciascun ratto. Inoltre, se interessati a valutare in che modo gli ormoni gonadici possono influenzare i risultati, raccogliere la lavanda vaginale per le femmine di ratto (descritta al paragrafo 2).
  4. Limitare (dal cibo) gli animali che verranno eseguiti nel paradigma di cambiamento della strategia operante almeno 3 giorni prima dell'inizio dell'addestramento in modo che imparino con successo il compito. Assicurati che l'acqua sia sempre liberamente disponibile. Le registrazioni scritte dovrebbero essere conservate per ogni animale per documentare il consumo giornaliero di cibo e liquidi, lo stato di idratazione e qualsiasi cambiamento comportamentale e clinico utilizzato come criterio per la rimozione temporanea o permanente di un animale da un protocollo (Morton 2000; NRC 2003b).
    1. Se si utilizza una procedura di stress per più di 3 giorni prima dell'allenamento, regolare la restrizione alimentare in base al numero di giorni di stress (ad esempio, 5 giorni di contenzione più restrizione alimentare25).
    2. Ogni giorno, fornire l'80% della normale assunzione giornaliera di cibo (cioè 4 g di cibo per 100 g di peso corporeo)26. Usa la raccolta giornaliera del peso per il ratto per calcolare quanto cibo dare ogni giorno.
    3. Continua la restrizione alimentare attraverso i giorni di formazione e test. Tuttavia, non mettere il cibo nella gabbia domestica fino a quando il topo non ha completato l'addestramento o il test per la giornata, altrimenti non saranno motivati a svolgere i compiti per una ricompensa di pellet di cibo. Assicurarsi che i tempi di consegna del cibo ai ratti al completamento del compito siano abbastanza imprevedibili poiché ciò aiuta a evitare una ridotta motivazione a esibirsi nella camera dell'operante (a favore della semplice attesa del cibo nella gabbia domestica in seguito).
      NOTA: Gli animali sottoposti al paradigma dello stress di contenimento non mostrano una perdita di peso significativamente maggiore rispetto ai soggetti non stressati. Tuttavia, varie procedure di stress possono a loro volta indurre la perdita di peso, con il risultato che i ratti ricevono meno cibo rispetto alle controparti non stressate durante la restrizione alimentare basata sul peso corporeo. Questo può presentare un ulteriore fattore di stress confondente. Se questo sembra essere il caso, in alternativa utilizzare una quantità fissa di cibo dato a ciascun soggetto, indipendentemente dal peso27.

2. Lavanda vaginale

NOTA: Gli ormoni gonadici (cioè estrogeni e progesterone) sono noti per influenzare la risposta allo stress e la cognizione28,29,30. Questi ormoni fluttuano nel corso del ciclo estrale delle femmine di ratto31. Se interessati a tracciare il ciclo estrale dei roditori femminili che pedalano liberamente per correlarsi con i dati sullo stress o sulla flessibilità cognitiva, raccogliere la lavanda vaginale come descritto di seguito. Non vengono forniti dati rappresentativi che considerino la fase del ciclo estrale.

  1. Per ottenere campioni di lavaggio vaginale dalle femmine, raccogliere acqua tiepida in un becher pulito, un contagocce di vetro, un vetrino "lavage" (vetrino per microscopio con cerchi di vernice acrilica per contenere il campione di lavaggio) e un becher vuoto.
  2. Riempire il contagocce con una piccola quantità di acqua tiepida (~ 0,5 ml), quindi inserire la punta nella vagina del ratto femmina (sollevando per la coda). Espellere l'acqua sterile 2x-3x ed espellere il fluido raccolto su un vetrino microscopico. Non traboccare il cerchio di scorrimento della lavanda.
  3. Espellere il liquido in eccesso nel becher vuoto. Etichettare il vetrino di lavaggio con i numeri di ratto e mettere i campioni di ciascun ratto in quell'ordine in modo che sia chiaro quale campione appartiene a ciascun ratto.
  4. Risciacquare accuratamente il contagocce pipettando acqua calda pulita ed erogandolo più volte nel becher "in eccesso" prima di riempire il contagocce per campionare il ratto successivo.
  5. Portare con attenzione il vetrino di lavaggio su un microscopio a campo luminoso per immaginare il campione di lavaggio e classificare il giorno all'interno del ciclo estrale come descritto in Becker et al31.
    NOTA: Idealmente, il lavaging dovrebbe essere fatto per alcune settimane per tracciare correttamente il ciclo di una femmina e dovrebbe essere eseguito in un momento molto simile ogni giorno per controllare i ritmi circadiani. Preferibilmente, questa procedura dovrebbe essere eseguita prima delle procedure di spostamento della strategia dello stress e dell'operante. L'uso di tamponi di cotone e soluzione salina sterile può essere utilizzato anche come alternativa a questa tecnica contagocce. I dati per le femmine di ratto possono essere analizzati post-hoc in base al giorno del ciclo estrale (considerare i giorni di ciclo quando viene eseguito lo stress e / o il giorno del ciclo in cui si verifica il test).

3. Attrezzature e software

  1. Utilizzare camere operanti per l'allenamento comportamentale e i test.
    1. Assicurarsi che le camere contengano almeno due leve retrattili con due luci di stimolo sopra, una luce di casa e un distributore per il rinforzo per questi compiti.
    2. Verificare che le leve si trovino su entrambi i lati dell'area di erogazione del rinforzo centrale con una luce di stimolo sopra ciascuna leva.
    3. Utilizzare la luce di casa per illuminare la camera senza interferire con il rilevamento dello stimolo luminoso (è meglio se la luce della casa si trova sulla parete posteriore della camera, opposta alle leve e alle luci di stimolo).
  2. Utilizzare pellet alimentari senza polvere (qui vengono utilizzati pellet da 45 mg: 18,7% di proteine, 5,6% di grassi e 4,7% di fibre) per rinforzo nei ratti con restrizioni alimentari. Non usare pellet ad alto contenuto di saccarosio o grassi (a meno che non vi sia interesse per il modo in cui lo stress influisce sull'assunzione di cibo appetibile).
  3. Controllare la presentazione degli stimoli, il funzionamento della leva e la raccolta dei dati da un computer con un software in grado di azionare la camera (Tabella dei materiali).
    NOTA: per informazioni relative alla codifica dei programmi che utilizzano questo software, contattare gli autori. Gli script MED-PC sono inclusi come file supplementari. Questo software raccoglie informazioni sulle risposte dell'animale per ogni prova (quale leva viene premuta, se è corretta / errata / nessuna risposta e latenza per fare la scelta). Da queste informazioni, gli utenti possono calcolare varie misure nel paradigma comportamentale, come descritto nella sezione analisi comportamentale.
  4. Eseguire allenamenti / test alla stessa ora ogni giorno per controllare i ritmi circadiani negli ormoni dello stress32 (e altre misure pertinenti).
  5. Riempire il vassoio inferiore di ogni scatola operante con biancheria da letto fresca per raccogliere feci / rifiuti. Dopo ogni sessione, scaricare ogni vassoio, pulire i vassoi e l'interno della camera con salviette icool o un disinfettante approvato IACUC e sostituirlo con lettiera fresca prima di posizionare un nuovo animale nella camera.

4. Procedure di stress

  1. Decidere se la procedura di stress deve essere eseguita prima, durante e / o dopo l'allenamento sul paradigma di cambiamento della strategia operante (ad esempio, 5 giorni di stress di contenimento prima di 3 giorni di allenamento operante contro 3 giorni di allenamento operante seguiti da una singola restrizione e test).
  2. Eseguire la procedura di stress allo stesso tempo ogni giorno rispetto all'allenamento operante. (ad esempio, 30 minuti di stress di contenimento a partire da 9 A.M., seguito dal posizionamento nella camera dell'operante).
  3. Eseguire le procedure di stress in una stanza separata sia dalla stanza della colonia che dalle stanze del paradigma di spostamento della strategia (per garantire che non vi siano fattori confondenti associati allo stress dei testimoni)33. Brevemente, posizionare il topo in un tubo di ritenuta trasparente in stile Broome e sigillare l'apertura, facendo attenzione a non pizzicare gli arti o la coda. Tra un soggetto e l'altro, utilizzare un disinfettante approvato IACUC per pulire il tubo in stile Broome. Una sanificazione impropria può lasciare feromoni dietro che possono influire negativamente sul protocollo di test.
    NOTA: Stimare quanto tempo il primo gruppo di ratti trascorrerà nelle camere operanti. Questo varierà a seconda dell'allenamento rispetto al giorno del test; tuttavia, dopo aver eseguito diverse coorti, è possibile calcolare un tempo medio per completare ogni attività per stimare le attività future.
  4. A seconda di quante camere operanti sono disponibili, scaglionare la procedura di stress per i soggetti. Ad esempio, quattro ratti subiscono uno stress di contenimento e sono collocati in quattro camere operanti. Un'ora dopo, altri quattro animali subiscono procedure di stress da seguire dalla camera operante.

5. Formazione

NOTA: Questo paradigma è modificato dalla procedura operante di set-shifting sviluppata da Floresco et al. in modo tale che possa essere completato in 3 giorni19.  Le procedure di addestramento per i ratti richiedono 3 giorni (1 giorno per imparare ogni compito come descritto di seguito). È raro che un topo non impari questi compiti. Se un topo non riesce a imparare ogni compito, dovrebbe essere escluso dallo studio finale. Vedere la Figura 1A per una rappresentazione visiva del paradigma di allenamento descritto di seguito.

  1. Prima di posizionare il ratto nella camera, assicurarsi che ci siano abbastanza pellet di cibo nel distributore e che le scatole operanti funzionino correttamente. Per fare ciò, caricare e avviare un programma di formazione o di test day in una camera vuota, testando manualmente che la leva corretta fornisca in modo appropriato una ricompensa per ogni pressa a leva.
  2. Addestrare il topo a premere ogni leva
    1. Prima di posizionare il topo nella scatola per il primo giorno di allenamento, impostare manualmente una ricompensa di pellet di cibo sulla leva corretta, come indicato al momento del caricamento della procedura di allenamento all'interno di ciascuna camera.
    2. Addestrare il ratto utilizzando un programma a rapporto fisso (FR-1), in modo tale che ogni corretta pressa a leva sia ricompensata con un rinforzo. Controbilanciare la leva corretta al giorno tra soggetti e/o condizioni sperimentali (modellando una sola leva alla volta) designando la leva corretta al momento del caricamento della procedura di addestramento sul computer che aziona le camere.
    3. Lasciare che il topo prema la leva fino a raggiungere il criterio premendo la leva corretta 50x, di solito completando l'attività tra 30-45 minuti.
    4. Il giorno seguente costringere il topo a eseguire questo compito sulla leva opposta utilizzando lo stesso programma del primo giorno di allenamento, ma designare la leva opposta come quella corretta. Non è necessario "modellare" la leva con un pellet di cibo in questo giorno di allenamento. Tipicamente, questo criterio viene rapidamente acquisito dopo che i ratti hanno imparato a premere la prima leva.
  3. Addestrare il ratto a rispondere al segnale luminoso
    1. Il terzo giorno di allenamento, illumina la luce sopra entrambe le leve per 15 prove, durante le quali il ratto può premere una delle leve per ricevere potenzialmente una ricompensa per il pellet di cibo. Durante il compito di discriminazione leggera, questo programma selezionerà in modo casuale quale leva è corretta su base sperimentale.
    2. Se il topo preme la leva corretta, assicurarsi che le luci rimangano accese per 3 s e la ricompensa venga consegnata, seguita da un periodo di 5 s, durante il quale le luci vengono spente prima della prova successiva. Se il ratto preme la leva errata, assicurarsi che non venga consegnata alcuna ricompensa e che le luci si spengano per 10 s prima della prova successiva.
    3. Dopo questo ultimo giorno di allenamento, calcola il "side bias" per determinare se il ratto ha una preferenza per la leva sinistra o destra dividendo il numero di presse di una leva diviso per il numero totale di presse a leva. Il giorno del test, il ratto inizierà dal suo lato meno preferito per assicurarsi che stia imparando la specifica contingenza risposta-ricompensa, piuttosto che rispondere a una leva preferita.

6. Test

NOTA: vedere la Figura 1B per una rappresentazione visiva del paradigma di test descritto di seguito.

  1. Il giorno 4 (giorno del test), posiziona il topo nella camera operante seguendo le procedure di stress e testalo in serie in attività di discriminazione laterale, inversione laterale e discriminazione leggera. Assicurarsi che l'attività di discriminazione della luce illumini solo la luce sopra la leva "corretta". In ogni compito, i ratti devono eseguire consecutivamente otto prove corrette per completare ogni discriminazione senza premere la leva non ricompensata e errata. Una pressione errata della leva ripristinerà questa catena di prove.
    1. Testare i ratti usando il compito di discriminazione laterale. Utilizzando il programma di discriminazione laterale, premiare il topo per aver premuto la leva sul suo lato meno preferito come determinato dal terzo giorno di allenamento, indipendentemente dal segnale luminoso. L'attività termina premendo la leva corretta 8 volte consecutivamente (escluse le omissioni).
    2. Esegui il test di inversione laterale eseguendo nuovamente i ratti utilizzando il programma di discriminazione laterale, ma questa volta designando la leva opposta a quella corretta dal compito di discriminazione laterale come corretta. Assicurarsi che il ratto sia ricompensato per aver premuto questa leva, indipendentemente dal segnale luminoso. L'attività termina premendo la leva corretta 8 volte consecutivamente (escluse le omissioni).
    3. Esegui il compito di discriminazione della luce, che premia il topo per aver premuto la leva con la luce illuminata sopra. Ogni test operante viene completato premendo la leva corretta 8x consecutivamente (escluse le omissioni).
      NOTA: Sulla base di studi precedenti, questi compiti codificano un minimo di 30 prove, indipendentemente dalle presse consecutive, per garantire che i ratti abbiano tempo sufficiente per apprendere le regole di ciascun compito18. Pertanto, se il ratto raggiunge consecutivamente otto prove corrette prima che si siano verificate 30 prove, il compito rimarrà impegnato fino al completamento di 30 prove.

7. Analisi comportamentale

NOTA: I dati acquisiti per ciascun animale il giorno del test vengono automaticamente registrati e salvati dal computer, a patto che uno script MED-PC per ogni attività sia stato avviato e permesso di completare (vedere materiali supplementari per gli script MED-PC).

  1. Apri i dati per ogni attività del giorno di prova (discriminazione laterale, inversione laterale e discriminazione leggera) utilizzando il programma per computer. Le principali misure registrate dal programma sono prove al criterio, errori nel criterio e tempo al criterio. Queste misure sono descritte in dettaglio di seguito.
    NOTA: gli autori hanno generato uno script MATLAB che consente l'automazione del processo di analisi e l'analisi degli errori perseveranti rispetto a quelli regressivi (contattare gli autori per le informazioni sul codice per semplificare l'analisi dei dati).
    1. Utilizzare le prove per criterio (che si riferisce al numero totale di prove [escluse le omissioni] necessarie affinché il ratto completi consecutivamente otto prove corrette, comprese quelle otto prove) come principale indicatore di accuratezza. Questi dati si trovano nella prima colonna della matrice B in un file di dati generato dallo script MED-PC per una qualsiasi delle attività del giorno del test.
    2. Esaminare gli errori totali commessi durante ogni attività. Questi dati si trovano nella terza colonna della matrice B in un file di dati generato dallo script MED-PC per una qualsiasi delle attività del giorno del test. Questi errori sono anche classificati in errori perseveranti o regressivi. Gli errori perseveranti vengono commessi quando il topo continua a seguire la regola precedente dell'attività precedente. Gli errori regressivi vengono commessi dopo che si è disimpegnata dalla regola precedente ma continua a cercare di acquisire la nuova regola (per maggiori dettagli su come vengono calcolati questi tipi di errori, fare riferimento al metodo pubblicato18).
    3. Se il ratto non ha risposto a un segnale leggero entro 15 s, lo studio è classificato come un'omissione e non conterà per il numero totale di prove al criterio. Calcolare questa opzione sommando prima il numero di risposte corrette (che si trova nella seconda colonna della matrice B nel file di dati) e il numero di errori (che si trovano nella terza colonna dell'array B nel file di dati). Quindi, sottrarre questo numero dal numero totale di prove al criterio (questo è l'ultimo numero nella prima colonna della matrice B in un file di dati, diverso dalle prove al criterio).
    4. Utilizzare gli orari di inizio e fine registrati dal programma (che si trova nella parte superiore di un file di dati generato dallo script MED-PC per una qualsiasi delle attività del giorno del test) per calcolare il criterio del tempo. La latenza alla prima pressione della leva può anche essere calcolata dal file di dati sottraendo la variabile K (tempo trascorso in secondi dalla prima pressione della leva) dal tempo al criterio.
    5. Media dei dati per ogni misura comportamentale per i ratti all'interno dello stesso gruppo di trattamento. Eseguire analisi statistiche appropriate (a seconda del numero di variabili esaminate).

8. Substrati cerebrali

  1. Determinare un'area cerebrale interessata e / o un aspetto della flessibilità cognitiva. Ad esempio, se lo stress aumenta gli errori perseveranti nel compito di inversione laterale, la corteccia orbitofrontale (OFC) può essere di particolare interesse, poiché precedenti studi sulle lesioni hanno indicato che questa regione del cervello svolge un ruolo in molte forme di apprendimento dell'inversione (cioè l'inversione spaziale testata nel compito di inversione laterale)34,35,36. In questo esempio, sacrificare i ratti dopo che il paradigma di cambiamento della strategia è stato completato ed esaminare c-fos (misura dell'attivazione neurale37) nell'OFC utilizzando i metodi immunoistochimici descritti25 e descritti brevemente qui.
    1. In primo luogo, estrarre il cervello dagli animali e tagliarlo in fette da 40 μm.
    2. Lavare il tessuto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 4 volte per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in perossido di idrogeno allo 0,3% per 10 minuti per estinguere le perossidasi endogene.
    3. Lavare i tessuti in PBS 2 volte per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in anticorpo primario anti-c-fos di topo (1:500), 3% di siero d'asino normale (NDS) e 0,3% di Triton X durante la notte.
    4. Il giorno successivo, lavare i tessuti in PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in anticorpo anti-topo anti-topo coniugato con biotina-SP (1:500) per 2 ore.
    5. Lavare i tessuti in PBS 3x per 5 minuti ciascuno, quindi incubare nel complesso avidina-streptavitina AB per 1 ora.
    6. Lavare il tessuto in PBS 3x per 5 minuti ciascuno, quindi incubare in soluzione DAB per un massimo di 10 minuti quando il tessuto subisce una reazione cromogenica di ossidazione.
    7. Lavare i tessuti in PBS 3x per 5 minuti ciascuno, quindi montare le fette di cervello su vetrini per microscopio.
    8. Coprire il tessuto utilizzando un mezzo di montaggio a base di toluene e l'immagine utilizzando un microscopio a campo luminoso.
      NOTA: Qui, come riflesso nei risultati rappresentativi, i ratti vengono sacrificati 30 minuti dopo la fine del cambio di paradigma della strategia, circa 60-90 minuti dopo che l'attività di inversione è stata completata (a seconda delle prestazioni di ciascun ratto nel compito leggero). Questo dovrebbe rappresentare la tempistica ottimale per l'espressione c-fos38, riflettendo le prestazioni nell'attività di inversione.
  2. In alternativa, puònulare un'area cerebrale specifica per l'iniezione di droga o l'iniezione virale prima dell'esecuzione dello stress o del paradigma di cambiamento della strategia operante.
    NOTA: I ricercatori potrebbero voler esaminare come la manipolazione dei substrati neurali altera gli effetti dello stress sulla flessibilità cognitiva. Ad esempio, i ricercatori possono bloccare un particolare recettore dei neurotrasmettitori nella corteccia prefrontale prima del test.

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Risultati

Il paradigma di cambiamento automatico della strategia operante adattato sopra delineato è stato utilizzato per determinare se lo stress di contenzione ripetuto influisce sulla cognizione nei ratti Sprague Dawley maschi e femmine. I dati comportamentali rappresentativi sono descritti nella Figura 2 di seguito. In breve, i ratti di controllo e ripetutamente trattenuti hanno eseguito questo test di spostamento della strategia operante, che consisteva in una serie di compiti: discriminazione l...

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Discussione

Il protocollo dimostra come misurare gli effetti dello stress sulla funzione cognitiva. In particolare, un paradigma di spostamento della strategia operante modificato viene utilizzato nei roditori, che misura la flessibilità cognitiva (analoga al Wisconsin Card Sorting Task negli esseri umani)1. La flessibilità cognitiva denota la capacità di adattare le strategie di elaborazione cognitiva per affrontare nuove condizioni nell'ambiente ed è fondamentale per il normale funzionamento quotidiano<...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori vorrebbero ringraziare Hannah Zamore, Emily Saks e Josh Searle per il loro aiuto nello stabilire questo paradigma di cambiamento di strategia operante nel laboratorio Grafe. Vorrebbero anche ringraziare Kevin Snyder per il suo aiuto con il codice MATLAB per l'analisi.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3 inch glass pipette eye droppersAmazon4306-30-012LCFor vaginal lavage
Alcohol WipesVWR15648-990To clean trays in set shifting boxes between rats
Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteinsJackson ImmunoResearch715-065-150All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper
C-fos mouse monoclonal primary antibodyAbCamab208942To stain neural activation in brain areas after set shifting
Dustless Food PelletsBio ServF0021For set shifting boxes (dispenser for reward)
GraphPad PrismUsed for data analysis
Leica DM4 B Microscope and associated imaging softwareLeicaLots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos
MatLabSoftware; code to help analyze set shifting data, available upon request.
Med-PC Software SuiteMed AssociatesSOF-736Software; uses codes to operate operant chambers
Operant ChambersMed PCMED-008-B2Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request.
Rat BeddingEnvigoT.7097
Rat ChowEnvigoT.2014.15
Restraint DevicesBryn Mawr CollegeMade by our shopFor stress exposure; specifications available upon request.
Scribbles 3d fabric paintAmazon54139For vaginal lavage
Sprague Dawley RatsEnvigoAt least D65 Males and Females
VWR Superfrost Plus Micro SlideVWR48311-703For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos

Riferimenti

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