Preconcentrazione su carta e isolamento di microvescicoli ed esosomi

Riepilogo

Presentato è un protocollo per fabbricare un dispositivo cartaceo per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi.

Abstract

I microvescoli e gli esosomi sono piccole vesciche membranose rilasciate nell'ambiente extracellulare e circolate in tutto il corpo. Poiché contengono varie biomolecole derivate dalle cellule parentali come DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, il loro arricchimento e isolamento sono passaggi critici per il loro sfruttamento come potenziali biomarcatori per applicazioni cliniche. Tuttavia, i metodi di isolamento convenzionali (ad esempio, l'ultracentrifuga) causano perdite e danni significativi ai microvescicoli e agli esosomi. Questi metodi richiedono anche più passaggi ripetitivi di ultracentrifugazione, carico e sprechezza dei reagenti. Questo articolo descrive un metodo dettagliato per fabbricare un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) progettato per l'arricchimento efficace e l'isolamento di microvescicoli ed esosomi in modo semplice. Il design unico dell'Exo-PAD, costituito da strati multipiegati a fisarmonica con aree campione convergenti, è integrato con la tecnica di polarizzazione della concentrazione degli ioni, consentendo così l'arricchimento di cinque volte dei microvigli e degli esosomi su strati specifici. Inoltre, i microvescicoli arricchiti e gli esosomi sono isolati semplicemente dispiegando l'Exo-PAD.

Introduzione

I microvescicoli e gli esosomi sono piccole vesciche a membrana che misurano rispettivamente 0,2 m e 30-200 nm. Essi sono secreti nell'ambiente extracellulare da diversi tipi di cellule^1,2,3,4,5. Essi contengono informazioni sulle cellule parentali sotto forma di sottoinsiemi di DNA, mRNA, miRNA, proteine e lipidi, e circolano in tutto il corpo attraverso vari fluidi corporei come siero, plasma, urina, liquido cerebrospinale, liquido amniotico, e saliva^6,7,8,9. Pertanto, le tecniche per un isolamento efficiente dei microviscoli e degli esosomi dai fluidi biologici possono fornire ampie opportunità nei campi della diagnosi, della prognosi e del monitoraggio in tempo reale della malattia, nonché nello sviluppo di nuove terapie.

Tuttavia, il metodo di isolamento convenzionale per microvicoli ed esosomi a base di ultracentrifugazione è estremamente dispendioso in termini di tempo e causa una significativa perdita e contaminazione del campione. Questo perché comporta diverse fasi ingombranti di pipettaggio e caricamento e lo scarto di vari reagenti con ultracentrifugazione ripetuta^5,6,10,11^,12.¹² Inoltre, l'elevata sollecitazione di taglio indotta dall'ultracentrifugazione (100.000 x g)può causare il lisi fisico di microvessicoli ed esosomi, producendo bassi tassi di recupero (5-23%)^6,13,14. Pertanto, è necessario sviluppare una tecnica di isolamento altamente efficiente e discreta per microvicoli ed esosomi per ridurre i danni e le perdite, ottenendo così tassi di recupero più elevati.

È stato sviluppato un dispositivo basato su origami (Exo-PAD) per un isolamento più semplice, più delicato ed altamente efficiente di microvescicoli ed esosomi⁶. Il design dell'Exo-PAD è una carta multipiegata con aree campione collegate in serie che diminuiscono gradualmente di diametro. La tecnica di polarizzazione della concentrazione di ioni (ICP), che è un fenomeno nano-elettrocinetico che preconcentra le biomolecole cariche, è stata integrata con questo design unico. L'utilizzo dell'Exo-PAD ha portato a un arricchimento quintuplicato dei microvessicoli e degli esosomi in strati specifici e al loro isolamento semplicemente aprendo il dispositivo. In questo articolo viene descritto in dettaglio Exo-PAD, dalla fabbricazione e il funzionamento complessivo del dispositivo all'analisi del relativo utilizzo, per illustrare il metodo e mostrare risultati rappresentativi⁶.

Protocollo

1. Fabbricazione del dispositivo

1. Definire la regione da stampare su carta utilizzando il software della stampante (Table of Materials).
   NOTA: Il disegno ha 12 strati con motivi di cera in cui i diametri delle aree campione circolari si restringono gradualmente da 5 a 2 mm (Figura 1A).
2. Stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa (Tabella dei materiali) utilizzando una stampante di cera commerciale ( Tabella deimateriali) (Figura 1B).
3. Mettere la carta stampata in cera in un forno da laboratorio per 80 s a 120 gradi centigradi.
   NOTA: Questo passaggio consente alla cera di raggiungere l'interno della carta ottenendo un riflusso termico della cera stampata. Con questo protocollo di incubazione, la risoluzione del modello è di 2 mm. Quindi, fare attenzione a non stampare modelli di meno di 2 mm. Altrimenti i modelli saranno bloccati dalla cera.
4. Tagliare la carta stampata in cera con una fresa per creare singoli dispositivi (Figura 1C).
5. Cadere 5 l e 2 l di membrana permselective (ad es. Nafion; Tabella dei materiali) sulle aree di esempio nei livelli più a sinistra e più a destra, rispettivamente (Figura 1D).
6. Posizionare gli strati rivestiti con la membrana permselective su una piastra calda a 70 gradi centigradi per 30 min per far evaporare il solvente a membrana permselettiva.
7. Sigillare la superficie più esterna dello strato rivestito rivolto verso la soluzione tampone con nastro sensibile alla pressione, lasciando un piccolo foro.
8. Piegare il singolo dispositivo stampato (ad esempio, Exo-PAD) avanti e indietro lungo le linee bianche.
   NOTA: piegando il dispositivo, tutte le aree campione diventano convergentmente connesse (Figura 1E). Questo design convergente focalizza le linee di campo elettrico quando la tensione viene applicata per ICP, ottenendo una preconcentrazione più intensiva dei microfonie e degli esosomi.

2. Arricchimento e messa a fuoco spaziale di microvescicoli ed esosomi mediante polarizzazione della concentrazione iostico

1. Caricare 15 L del seme di microvessicolo ed exosoma (3 x 10¹¹ particelle/mL in 0,1x fosfato tamponata salina [PBS] con 0,05% Tween 20) nelle aree campione convergenti mediante pipettaggio e attendere alcuni secondi per garantire la bagnatura completa di tutte le aree campione (Figura 1F).
2. Posizionare due camere acriliche ad entrambe le estremità dell'Exo-PAD e bloccare l'Exo-PAD in modo sicuro con piccole clip legante per evitare lo svolgimento (Figura 1G).
3. Riempire le camere con 110 xL di 0,1x PBS e inserire due elettrodi Ag/AgCl (Figura 1H).
4. Applicare 30 V agli elettrodi per 20 min utilizzando un sistema di misurazione della sorgente di corrente-tensione (Tabella dei materiali).
   NOTA: La tensione applicata genera il fenomeno ICP e quindi preconcentra i microfonie e gli esosomi sugli strati 8 e 9 dell'Exo-PAD.

3. Isolamento dei microvessicoli e degli esosomi arricchiti

1. Separare l'Exo-PAD piegato dalle camere acriliche e aprire il dispositivo per isolare i microvescicoli e gli esosomi arricchiti dagli altri strati (Figura 1I).
2. Estrarre le aree campione nei livelli 8 e 9, in cui vengono arricchiti i microvicoli e gli esosomi, per l'analisi a valle (Figura 1J).

4. Analisi della microscopia elettronica a scansione

1. Fissare i microvescicoli e gli esosomi arricchiti immergendo le aree perforate in glutaraldeide 2,5% in buffer di cacodilate di sodio da 0,1 M per 1 h e nell'1% di tetrossido di osmio in cacodilate di sodio da 0,1 M per 1 h.
   AVVISO: il tetrossido di Osmio è una sostanza chimica altamente velenosa e pericolosa. Poiché il tetrossido di osmio può penetrare nella plastica, deve essere conservato nel vetro. Qualsiasi trattamento di tetrossido di osmio deve essere eseguito in una cappa di fumi chimici con guanti a doppio nitrile.
2. Disidratare i microvescoli fissi e gli esosomi con gradi ascendenti di 200 etanolo di prova (ad esempio, 50%, 70%, 90% e 100%) per 30 min ciascuno.
3. Asciugare chimicamente il campione immergendolo in hexamethyldisilazane in un desiccatore per 30 min.
   AVVISO: l'hexamethyldisilazane è una sostanza chimica infiammabile e sensibile all'umidità. Deve essere conservato in un'area asciutta e ben ventilata lontana da fonti di accensione.
4. Rivestire i microvescicoli e gli esosomi completamente essiccati con oro/palladio (20 nm) attraverso immagini di microscopia elettronica a scansione (SEM).

5. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle

1. Estrarre le aree campione nei livelli 6, 8 e 10 utilizzando un punzone di biopsia dopo 20 min di funzionamento del dispositivo.
2. Immergi ogni area perforata in una soluzione buffer (0,1x PBS con 0,01% Tween 20).
3. Vortice per 10 min e centrifuga per 30 s a 6.000 rpm per rimettere in sospensione i microvessi e gli esosomi arricchiti.
4. Rimuovere le aree perforate dalla soluzione e misurare la concentrazione di microvissicoli ed esosomi da parte di uno strumento di analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) (Tabella dei materiali).

Risultati

Il tempo di funzionamento deve essere ottimizzato per ottenere il massimo rendimento di recupero dei microvessicoli arricchiti e degli esosomi. Tempo insufficiente non consente una sufficiente migrazione dei microvicoli e degli esosomi, che diminuisce l'arricchimento, mentre il tempo eccessivo deteriora la messa a fuoco spaziale e quindi disperde i migameni e gli esosomi. Così, attraverso la fase di ottimizzazione del tempo, è possibile identificare il massimo fattore di preconcentrazione di microvissicoli ed esosomi e...

Discussione

Anche se l'Exo-PAD è stato utilizzato con successo per l'arricchimento e l'isolamento di microvicoli ed esosomi, diversi punti critici devono essere attentamente considerati: 1) il tempo di incubazione del forno e la temperatura durante la preparazione del dispositivo, 2) tempo di elaborazione, 3) applicazione di tensione con diversi numeri di strato e diametri di area campione, e 4) l'applicabilità ai campioni clinici.

Il tempo di incubazione e la temperatura indicati nel protocollo sono co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ag/AgCl electrodes	A-M Systems, Inc.	531500	0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A13101	BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer	Sigma-Aldrich	C3041-50CAP	Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada)	Corel Corporation		Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870	Xerox Corporation		Wax printer
Chromatography paper grade 1	Whatman	3001-861	Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards	HansaBioMed Life Sciences, Ltd.	HBM-F-PEP-100	Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter	Keithley Instruments, Inc.		Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution	Sigma-Aldrich	31175-20-9	Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10	NanoSight Technology		Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010001