Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon

Riepilogo

Qui, abbiamo descritto un protocollo per studiare quantitativamente l'assemblaggio e la struttura dei segmenti iniziali di axon (AIS) dei neuroni ippocampali che mancano di AIS pre-assemblato a causa dell'assenza di un anchirina-G gigante.

Abstract

I segmenti iniziali dell'assone neuronale (AIS) sono siti di iniziazione di potenziali d'azione e sono stati ampiamente studiati per la loro struttura molecolare, assemblaggio e plasticità dipendente dall'attività. L'anchirina gigante-G, il principale organizzatore dell'AIS, si associa direttamente ai canali del sodio gated al sodio (VSVG) e del potassio (KCNQ2/3), nonché alla neurofascina da 186 kDa, una molecola di adesione cellulare L1CAM. L'anchirina gigante-G si lega e recluta anche molecole di AIS citoplasmatiche tra cui beta-4-spectrin, e le proteine leganti i microtubuli, EB1/EB3 e Ndel1. L'anchirina gigante-G è sufficiente per salvare la formazione di AIS in neuroni carenti di anchirina-G. L'anchirina-G include anche un isoforma più piccolo da 190 kDa situato alle spine dendritiche invece dell'AIS, che non è in grado di mirare all'AIS o di salvare l'AIS in neuroni carenti di anchirina-G. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza neuroni ippocampali coltivati da topi ANK3-E22/23-flox, che, se trasfettato con Cre-BFP mostrano la perdita di tutta l'isoforma di anchirina-G e compromettono la formazione di AIS. Combinato un sistema di co-coltura Banker glia/neurone modificato, abbiamo sviluppato un metodo per trasfetto i neuroni nulli anchirina-G con un plasmide anchirina-G-GFP da 480 kDa, che è sufficiente per salvare la formazione di AIS. Utilizziamo inoltre un metodo di quantificazione, sviluppato da Salzer e colleghi per affrontare la variazione della distanza AIS dai corpi cellulari neuronali che si verifica nelle colture neuronali ippocampali. Questo protocollo consente studi quantitativi sull'assemblaggio de novo e sul comportamento dinamico dell'AIS.

Introduzione

Il segmento iniziale dell'assone si trova all'assone prossimale nella maggior parte dei neuroni vertebrati. Funzionalmente, AIS è il luogo in cui vengono avviati potenziali d'azione a causa dell'alta densità dei canali del sodio gated di tensione in questa regione. L'AIS di alcuni neuroni eccitatori è anche preso di mira da internauri inibitori formando sinapsi GABAergiche^1,2,3. Pertanto, AIS è un sito critico per integrare la segnalazione cellulare e modulare l'eccitabilità dei neuroni. AIS è normalmente lungo 20-60 μm e si trova entro 20 μm dal corpo cellulare. La lunghezza e la posizione dell'AIS varia nei neuroni tra le regioni cerebrali, così come in diversi stadi di sviluppo dello stesso^{neurone 4,5}. Le prove accumulate hanno suggerito che la composizione e la posizione dell'AIS sono dinamiche nel rispondere al cambiamento dell'attività^{neuronale4,5,6,7}.

480 kDa ankyrin-G è il master organizer di AIS. 480 kDa anchirina-G è una proteina adattatore associata alla membrana che si lega direttamente ai canali del sodio gated di tensione e ad altre principali proteine AIS tra cui beta4-spectrina, canali KCNQ2/3 che modulano l'attività del canale del sodio^8,9e 186 kDa neurofascina, un L1CAM che dirige le sinapsi GABAergice all'AIS^2,10. 480 kDa ankyrin-G condivide domini di anchirina canonica trovati nel breve isoforma anchirina-G da 190 kDa (ANK ripete, dominio legante spectrin, dominio regolatore), ma si distinguono per un esone gigante che si trova solo nei vertebrati ed è specificamente espresso nei neuroni(Figura 1A)^11,12. Il dominio specifico del neurone anchirina-G da 480 kDa (NSD) è necessario per la formazione^{DIA 12}. L'anchirina-G da 190 kDa non promuove l'assemblaggio AIS o l'AIS bersaglio nei neuroni anchirina-G-null¹². Tuttavia, 190 kDa anchirina-G sono concentrati nell'AIS contenente 480 kDa anchirina-G¹². Questa capacità dell'anchirina-G da 190 kDa di colpire l'AIS pre-assemblato dei neuroni di tipo selvatico è stata una fonte di confusione nella letteratura e ha rallentato l'apprezzamento delle funzioni critiche specializzate dell'anchirina-G da 480 kDa nell'assemblaggio AIS. Pertanto, è fondamentale studiare l'assemblaggio AIS in neuroni anchirina-G-null che mancano di un AIS pre-assemblato.

Qui presentiamo un metodo per studiare l'assemblaggio e la struttura dell'AIS utilizzando neuroni ippocampali coltivati da topi ANK3-E22/23-flox che elimina tutte le isoforme di anchirina-G¹³ (Figura 1B). Trasfettando i neuroni con un costrutto Cre-BFP prima che l'AIS sia assemblato, abbiamo generato neuroni carenti di anchirina-G completamente privi di AIS (Figura 1B, Figura 2). L'assemblaggio dell'AIS è completamente salvato a seguito della co-trasfezione di 480 kDa anchirina-G-GFP plasmide con un plasmide Cre-BFP. Questo metodo consente di studiare l'assembly AIS in un ambiente AIS non preassemblato. Abbiamo anche modificato il sistema di co-coltura glia-neurone da Gary Banker senza utilizzare antibiotici, precedentemente progettato per i neuroni del giorno embrionale 18, per^{l'applicazione}ai neuroni del topo postnatale e adattato un metodo di quantificazione AIS alle misurazioni medie AIS da più neuroni per normalizzare la variazione di AIS 14^,15.

Protocollo

NOTA: Questo metodo di coltura dei neuroni ippocampali dai topi ANK3-E22/23^f/f postnatali è adattato dal sistema di co-coltura glia/neurone di Gary Banker. Pertanto, è fondamentale eseguire tutti i passaggi dopo la dissezione in una cappa pulita utilizzando strumenti sterilizzati. Questo protocollo richiede fino a 1 mese. Il flusso di lavoro viene visualizzato nella figura 3. Il protocollo segue le linee guida sugli animali della Duke University.

1. Preparazione di coverlips e piatti di placcatura neuronale

1. Almeno una settimana prima del giorno di coltura, caricare le coperture sul rack di coverlip e immergerlo in acido nitrico (70% W / W) durante la notte (potrebbe essere esteso per giorni).
2. Lavare le copertine trattate con acido nitrico con acqua distillata su uno shaker a bassa velocità in un barattolo di vetro 2 volte, 1 ora ciascuna.
3. Incubare le copertine in KOH saturo sciolte al 100% di etanolo durante la notte. Aggiungere KOH in etanolo fino a quando non è più sciolto.
4. Ripetere il passaggio di lavaggio con acqua distillata. Risciacquare le coverlips con etanolo al 100% una volta per 10 minuti.
5. Trasferire le coverlips dal rack a un bicchiere di vetro. Coprire il becher con un foglio di alluminio. Cuocere le coverlips in un forno a 225 °C durante la notte per sterilizzare i copripasci. (Le copertine potrebbero essere conservate nel becher per settimane).
6. Posizionare le copertine in una piastra di Petri e quindi applicare 3-4 punti di cera sul coperchio per fungere da piedi. Utilizzare una pipetta Pasteur per immergersi in cera bollita in una bottiglia di vetro. Quindi toccare rapidamente il coverslip per creare un punto. Una piastra di Petri da 60 mm può contenere 4 coverlips. Una piastra di Petri da 10 mm può contenere ~10 coverlips.
7. 2 giorni prima del giorno della coltura, rivestire le labbra (il lato con i punti di cera) con filtro sterilizzato 1 mg/mL poli-L-lisina in acido borico 0,1 M (pH 8,5) per un minimo di 6 ore e risciacquare con acqua 2 volte, 1 ora ogni volta. Le coverlips rimangono nella stessa piastra di Petri.
8. Aggiungere lentamente il mezzo di placcatura (MEM integrato con glucosio 0,6% (wt/vol) e 10% (vol/vol) siero di cavallo) alle piastre senza disturbare le coperture. Metti le piastre nell'incubatrice fino al giorno della coltura per seminare i neuroni.

2. Preparazione di piatti di alimentazione a celle glia (2 settimane prima del giorno della coltura)

1. Sezionare la corteccia da un cervello postnatale di topi di 1 giorno e staccare le meningi.
2. Tritare il tessuto della corteccia nel modo più fine possibile con forbici pulite in una piastra di Petri pulita in una panca pulita.
3. Trasferire il tessuto tritato in 12 mL di HBSS e aggiungere 1,5 mL di tripside al 2,5% e 1% (wt/vol) DNasi. Incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti, oscillare ogni 5 minuti. Beh, i tessuti digeriti diventano appiccicosi e formano un grande ammasso. Triturato 10-15 volte con una pipetta da 10 mL per abbattere il tessuto e ottenere una migliore digestione.
4. Triturare il tessuto ben digerito 10-15 volte con una pipetta da 5 mL fino a quando la maggior parte dei pezzi scompare e il mezzo diventa torbido. Passare attraverso un colino cellulare per rimuovere i pezzi rimanenti e aggiungere 15 mL di mezzo glia (Mem (Minimal essential medium) integrato con glucosio (0,6% wt/vol), siero di cavallo 10% (vol/vol) e Penicillina-Streptomicina (1x) per fermare la digestione.
5. Centrifugare le cellule a 120 x g per 5 minuti e aspirare il supernatante. Risospendare il pellet cellulare con mezzo glia fresco e semi in piatti di coltura cellulare (circa 10⁵ celle/cm^2).
6. Sostituire il mezzo con un mezzo glia fresco il giorno successivo per rimuovere le celle non attaccate.
7. Dai da mangiare ai piatti glia ogni 3-4 giorni con mezzo glia fresco. Schiaffeggiare il pallone 5-10 volte con una mano per spostare le cellule liberamente attaccate prima di cambiare il mezzo.
8. Dopo 10 giorni di coltura, le cellule glia dovrebbero essere quasi confluenti. Staccare le cellule glia con lo 0,25% di tripside-EDTA e seminare circa 10^{5 cellule} in un nuovo piatto di coltura cellulare da 60 mm. Le cellule rimanenti potrebbero essere congelate per un uso futuro.
9. 3 giorni prima del giorno della coltura, cambiare il mezzo di coltura da glia medio a neuronale (Neurobasal-A Medium con 1x GlutaMAX-I e 1x B27 supplemento).

3. Cultura neuroni ippocampali

NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.

1. Sezionare 6-8 ippocampi da cuccioli postnatali di 1 giorno da topi ANK3-E22/23^f/f con mezzo HBSS in una piastra di Petri a temperatura ambiente temperata. Tritare gli ippocampi con forbici di dissezione a pezzi più piccoli. Trasferire gli ippocampi dalla piastra di Petri a un tubo da 15 ml.
2. Lavare hippocampi 2x con 5 ml di HBSS nel tubo. Lasciare gli ippocampi in 4,5 mL di 1x HBSS dopo il lavaggio.
3. Aggiungere 0,5 mL di tripside del 2,5% in 4,5 mL di HBSS e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti. Invertire il tubo ogni 5 minuti. Gli ippocampi ben digeriti dovrebbero diventare appiccicosi e formare un ammasso. Se necessario, prolungare la digestione per altri 5 minuti.
4. Lavare gli ippocampi con HBSS 3 volte per 5 minuti ciascuno. Non utilizzare un vuoto per rimuovere l'HBSS. È molto facile rimuovere gli ippocampi.
5. Aggiungere 2 mL di HBSS dopo il lavaggio e pipettare l'ippocampi su e giù con una pipetta Pasteur 15 volte.
6. Triturare il tessuto con una pipetta Pasteur lucidata dal fuoco (il diametro dell'aperto è ristretto della metà) 10 volte. Non andare oltre 10 volte anche se ci sono ancora blocchi rimanenti. Il surriscaldamento uccide i neuroni.
7. Riposare il tubo per 5 minuti fino a quando tutti i pezzi sono impostati sul fondo. Utilizzare delicatamente una punta di pipetta da 1 mL per trasferire il supernatante contenente i neuroni dissociati a piatti placcanti (piatto^{da 10 5} cellule / 60 mm). Aggiungerlo direttamente al mezzo di placcatura pre-incubato e agitare delicatamente la piastra.
8. Ripetere il passaggio 3.6-3.7 con i blocchi rimanenti fino a quando la maggior parte dei pezzi non è scomparsa.
9. 2-4 ore dopo la semina, controllare le stoviglie con un microscopio leggero. La maggior parte dei neuroni avrebbe dovuto attaccarsi al coverslip. Le celle attaccate sono rotonde e luminose. Capovolgere le copertine usando una punta fine si invola verso i piatti dell'alimentatore di cellule glia con mezzo di coltura neuronale precondizione con il lato dei punti di cera rivolto verso il basso.
10. I neuroni possono crescere nei piatti di alimentazione delle cellule glia per un massimo di 1 mese. Nutrire i neuroni ogni 7 giorni con 1 mL di mezzo di coltura neuronale fresco.
11. Passo opzionale: 1 settimana dopo la semina, aggiungere citosina arabinoside (1-β-D-arabinofuranosilcitosina) a una concentrazione finale di 5 μM per frenare la proliferazione gliale.

4. Interruzione dell'AIS da parte del knockout di Ankyrin-G nella fase precedente dello sviluppo dei neuroni

1. Su 3 div (giorno in vitro),capovolgere i copripavimenti con punti di cera rivolti verso un piatto di alimentazione a cellule glia con mezzo di coltura neuronale condizionato.
2. Mescolare 0,25 μg di DNA Cre-BFP con 0,5 μg di DNA anchirina-G-GFP (WT/mutante) in un tubo da 1,7 ml per trasfetto 4 coverlips (~ rapporto 2:1 del numero di copia del DNA). Aggiungere 100 μL di mezzo di coltura (ad esempio Opti-MEM), mescolare e riposare su un rack. Se viene transfettato solo cre-BFP, la spina dorsale plasmide GFP viene utilizzata per corrispondere alla quantità totale di DNA.
3. Mescolare 3 μL di reagente di trasfezione (ad esempio, Lipofectamina 2000) (~ 3 volte di DNA) con mezzo di coltura di 100 μL in un nuovo tubo da 1,7 ml. Incubare per 5 minuti a RT.
4. Mescolare 100 μL di soluzione di DNA dal passo 4.2 con 100 μL di reagente di trasfezione dal passo 4.3. Riposare per 5-10 minuti su un rack.
5. Aggiungere 50 μL di miscela di DNA dal passo 4.4 proprio sopra ogni coverlip inserendo la punta appena sotto il mezzo senza toccare i copripacchi. Pipetta lentamente per evitare la diffusione del mix di DNA.
6. Riportare lentamente il piatto nell'incubatrice e incubare per 30-45 minuti.
7. Capovolgere i copripasta fino al piatto di alimentazione glia di casa con punti di cera rivolti verso il basso e rimettere il piatto nell'incubatrice.

5. Quantificazione del segmento iniziale di Axon

1. Fissare i neuroni su 7-10 div e macchiare con marcatore AIS seguendo il protocollo immunocitochimica standard per la proteina di interessante.
2. Raccogli immagini fluorescenti con la microscopia desiderata.
   1. Prendi le sezioni della serie Z per raccogliere il segnale dell'intero AIS. Mantieni la stessa profondità Z per tutte le immagini.
   2. Regola l'intensità del laser per raggiungere il miglior intervallo dinamico di intensità dei pixel.
   3. Assicurati che tutte le foto AIS siano scattate sulla stessa configurazione del microscopio.
   4. Controllare sempre il segnale di Cre-BFP.
3. Quantificazione AIS
   1. Immagine aperta con Fiji (https://fiji.sc).
   2. Genera la massima proiezione di immagini della serie Z.
   3. Sottrarre il segnale di sfondo del coverslip vuoto dall'immagine.
   4. Disegna una linea lungo l'AIS. La larghezza della linea dovrebbe coprire completamente l'AIS. Avviare la linea prima che il segnale AIS sia sollevato sopra lo sfondo e fermarsi dopo che è uscita in background.
   5. Misura l'intensità media dei pixel da sola la linea ed esporta in un foglio di calcolo (sono necessari ~ 10-15 AIS).
   6. Generare la curva di intensità media di AIS utilizzando lo script MATLAB adattato da Berger et^al.
   7. Per ogni esperimento, includere solo Cre e Cre più i neuroni trasfetati di anchirina-G di tipo selvaggio 480 kDa come controlli negativi e positivi per assicurarsi che il knockout dell'AIS sia efficienza e che il salvataggio abbia successo.

Risultati

Una serie completa di esperimenti dovrebbe includere la trasfezione solo Cre-BFP come controllo negativo, Cre-BFP più 480 kDa di co-trasfezione anchirina-G come controllo positivo e una condizione non trasfettata come controllo della tecnica. Nel controllo solo Cre-BFP, i neuroni trasfetti mancano dell'accumulo di marcatori AIS, tra cui anchirina-G (ankG), beta4-spectrina (β4), neurofascina (Nf) e canali di sodio gated di tensione (VSVG)(Figura 4A)¹⁶. Al contrario, ...

Discussione

L'assemblaggio dell'AIS è organizzato da 480 kDa ankyrin-G. Tuttavia, l'anchirina-G ha isoforme più corte che possono colpire l'AIS dei neuroni di tipo selvatico, il che può portare a difficoltà nell'interpretazione delle analisi struttura-funzione dell'assemblaggio AIS. Qui presentiamo un metodo che utilizza neuroni di topi ANK3-E22/23-flox che consente lo studio dell'assemblaggio de novo dell'AIS. Transfettando con Cre-BFP a 3 div, eliminiamo tutte le isoforme endogene di anchirina-G. Potremmo anc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
18mm coverglass (1.5D)	Fisher Scientific	12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP	Addgene	#31059
2.5% Tripsin without phenol red	Thermo Fisher Scientific	14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP	lab made	Provide upon request
ANK3-E22/23f/f mice	JAX	Stock No: 029797	B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplement	Thermo Fisher Scientific	A3582801
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Cell strainer with 70-mm mesh	BD Biosciences	352350
Ceramic coverslip-staining rack	Thomas Scientific	8542E40
Cre-BFP	Addgene	#128174
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
GlutaMAX-I supplement	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103-049
Nitric acid 70%	Sigma-Aldrich	225711
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Poly-L-lysine hydrochloride	Sigma-Aldrich	26124-78-7
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3