Microsezione laser-cattura RNA-Sequenziamento per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto nelle piante

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per la microdissezione laser-cattura (LCM) di tessuti vegetali. LCM è una tecnica microscopica per isolare aree di tessuto in modo privo di contaminazione. La procedura include fissazione del tessuto, incorporamento di paraffina, sessazione, LCM e estrazione dell'RNA. L'RNA viene utilizzato nell'analisi dei trascrimi specifici del tessuto a valle e tempormente risolta.

Abstract

Lo sviluppo di un organismo multicellulare complesso è governato da tipi di cellule distinti che hanno diversi profili trascrizioni. Per identificare le reti di regolamentazione trascrizionali che governano i processi di sviluppo è necessario misurare i profili di espressione genica spaziale e temporale di questi singoli tipi di cellule. Pertanto, la comprensione del controllo spatio-temporale dell'espressione genica è essenziale per comprendere come sono regolati i processi biologici e di sviluppo. Qui, descriviamo un metodo di microdissezione laser-cattura (LCM) per isolare un piccolo numero di cellule da tre organi embrionali d'orzo in un corso di tempo durante la germinazione seguito dalla profilazione della trascrizione. Il metodo consiste nella fissazione dei tessuti, nell'elaborazione dei tessuti, nell'incorporazione di paraffina, nella sessazione, nell'estrazione di LCM e RNA seguita da PCR o RNA-seq in tempo reale. Questo metodo ci ha permesso di ottenere profili spaziali e temporali di trascrittori di organi di semi da un numero variabile di cellule (da decine a centinaia), fornendo una specificità del tessuto molto maggiore rispetto alle tipiche analisi dei tessuti sfusi. Da questi dati siamo stati in grado di definire e confrontare le reti normative trascrizioni, nonché prevedere i fattori di trascrizione normativa candidati per i singoli tessuti. Il metodo deve essere applicabile ad altri tessuti vegetali con ottimizzazione minima.

Introduzione

Lo sviluppo e la crescita delle piante comportano l'azione coordinata delle reti di regolamentazione trascrizionali all'interno di diverse cellule esistenti in un ambiente cellulare complesso. Per comprendere l'attività di queste reti normative, abbiamo bisogno della conoscenza dell'espressione genica spaziale e temporale all'interno di diversi tipi di cellule attraverso le fasi di sviluppo. Tuttavia, le analisi dell'espressione genica sono più comunemente condotte in interi organi o campioni di tessuto sfusa a causa della sfida tecnica di isolare e analizzare un piccolo numero di cellule. Il metodo che descriviamo qui ha permesso di ottenere un'analisi del trascrittura specifica del tessuto spaziale e temporale accoppiando LCM con RNA-seq.

LCM è stato sviluppato due decenni fa da Emmert-Buck e colleghi¹. La tecnica ha permesso ai ricercatori di isolare con precisione singole cellule o ammassi di cellule dal loro ambiente utilizzando la visualizzazione e la manipolazione microscopiche dirette con un laser a fascio^{stretto 1}. Da allora il metodo è stato ampiamente utilizzato nella biologia del cancro e nella^{patologia 2,3}. Molti gruppi di ricerca vegetali hanno anche adattato LCM per l'uso con diverse specie vegetali e diversi tipi di^{tessuto 4,5,6,7,8,9,10,11}. Recentemente, diversi documenti hanno anche usato LCM su semi di eudicot e monocot per studiare embrioni, endospermemi e altre strutture di semi durante lo sviluppo dei semi e la^{germinazione 10,12,13}. La maggior parte degli altri metodi di isolamento a cella singola comunemente utilizzati come micro-pipettazione, smistamento cellulare, separazione magnetica e piattaforme microfluidiche dipendono dalla digestione ezimatica o dall'omogeneizzazione meccanica per dissociare le cellule. Questo può perturbare l'espressione genica, introducendo artefatti tecnici che confondono l'interpretazione^{dei dati 14,15}. Questi metodi richiedono anche una conoscenza precedente dei geni marcatori per ogni tipo di cellula per correlare le cellule dissociate alla loro posizione spaziale e al vero tipo di cellula. Un ulteriore gruppo di tecniche dipende dall'isolamento basato sull'affinità delle strutture subcellulari anziché delle celle intere, ad esempio INTACT (Isolation of Nuclei Tagged in Cell Types) e TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification)^16,17. Tuttavia, l'etichettatura di affinità e la purificazione di nuclei o ribosomi sono tecnicamente impegnative nelle specie vegetali che non hanno protocolli di trasformazione ben consolidati. LCM sfrutta la fissazione rapida dei tessuti per preservare i livelli di trascrizione e l'identificazione ircologica convenzionale mediante la visualizzazione diretta delle cellule all'interno del loro normale contesto di tessuto/organo, che consente alle cellule discrete di essere isolate in un breve^{periodo di tempo 18,19}.

Il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato per l'isolamento di cellule o tipi di cellule specifiche dalle sezioni tisssate dei semi di cereali, che possono essere applicate alla maggior parte delle cellule che possono essere identificate istologicamente. LCM fornisce un metodo senza contatto di isolamento cellulare, riducendo notevolmente la contaminazione e aumentando l'integrità dell'RNA recuperato. Inoltre, il metodo illustra la potenza della ML su larga scala su studi su tutto il genoma a partire da piccole quantità di materiali biologici. Descriviamo anche l'amplificazione lineare dell'RNA per generare materiale di input sufficiente per le analisi di trascrizione/trascrizione a valle.

Ci sono dieci passaggi principali in questo protocollo LCM RNA-seq per trascrittori spaziali e temporali specifici del tessuto, tra cui la fissazione di campioni di tessuto, disidratazione, infiltrazione di paraffina, incorporamento, sezionazione, LCM, estrazione dell'RNA, amplificazione dell'RNA, quantificazione dell'RNA e qRT-PCR e/o RNA-seq (Figura 1).

Figura 1: diagramma di flusso di LCM seguito da RNA-seq o qRT-PCR. LCM è una tecnica spazialmente precisa e senza contatto per raccogliere cellule da sezioni di tessuto fisse utilizzando un raggio laser sotto visualizzazione microscopica. Il processo inizia con la fissazione di campioni di tessuto, seguita da disidratazione utilizzando una serie di gradienti di etanolo e xylene, e finito con infiltrazione di paraffina. Il processo può essere completamente automatizzato utilizzando un processore di tessuto. Una volta che il tessuto è infiltrato con paraffina, è incorporato in uno stampo con paraffina fusa utilizzando una stazione di incorporamento. Il sessaggio viene eseguito utilizzando microtomo impostato allo spessore desiderato. I vetrini vengono preparati e LCM condotto immediatamente prima che l'RNA venga estratto dalle cellule catturate. L'estrazione dell'RNA è seguita direttamente da due cicli di amplificazione dell'RNA prima di qRT-PCR e/o RNA-seq. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Poiché il prodotto finale è l'RNA, fare attenzione a evitare di contaminare il lavoro con RNases. Indossare i guanti è un must. Utilizzare acqua trattata con dietile pirocarbonato (DEPC), tamponi, ecc. Tamponi autoclave e cuocere bicchieri prima dell'uso.

1. Fissazione dei tessuti

1. Preparare il fissativo di scelta a seconda della specie e dei tipi di tessuto; per i semi d'orzo, utilizzare il fissativo del contadino (75% etanolo, 25% acido acetico glaciale (v/v)).
2. Raffreddare il fissativo sul ghiaccio prima di raccogliere i tessuti.
3. Raccogliere il materiale vegetale di interesse e, se necessario, sezionarlo in pezzi di dimensioni appropriate per adattarsi allo stampo di incorporamento selezionato. Per il seme d'orzo, tagliare il seme a metà longitudinalmente per aiutare la penetrazione della soluzione fissativa e per adattarsi allo stampo di incorporamento.
4. Immergere il tessuto in almeno 10 volte il volume di fissativo ghiacciato. Per i semi d'orzo, immergere il seme tagliato a metà nel fissativo.
5. Utilizzare l'infiltrazione sottovuoto per accelerare la penetrazione del fissativo. I tessuti dovrebbero affondare dopo l'infiltrazione sottovuoto del fissativo. Per il seme d'orzo, utilizzare 30 min di infiltrazione sottovuoto.
6. Sostituire il fissativo e incubare a 4 gradi centigradi per consentire al fissativo di penetrare completamente nel tessuto. Per i semi d'orzo, incubare i campioni durante la notte (12-16 h).
   NOTA: I tessuti più sottili o piccoli richiederanno tempi di fissazione più brevi a causa del più alto tasso di diffusione del fissativo nel tessuto.
7. Rimuovere il tessuto dal fissativo e trasferire il tessuto in cassette e quindi iniziare l'elaborazione del tessuto.
   NOTA: Il tessuto piccolo o fragile, come il tessuto fogliare, può essere inserito in cassette per il fissaggio per garantire che non sia danneggiato durante la fissazione. Sacchetti di biopsia, pastiglie o involucri potrebbero essere utilizzati per tenere il tessuto in modo sicuro all'interno delle cassette durante la fissazione dei tessuti e le fasi di elaborazione dei tessuti.

2. Elaborazione dei tessuti

1. Utilizzare un processore automatico di tessuti nel passaggio 2 con un minimo di 10 camere di soluzione e 2 camere di paraffina riscaldate (vedi Tabella dei materiali).
2. Verificare che vi siano adeguate quantità di soluzione in ogni camera; sostituire le soluzioni dopo ogni pochi usi del processore dei tessuti.
3. Mettere le cassette con tessuto nel cestello metallico. Fissare il cestello metallico al suo supporto sopra la camera 1. Il supporto ruoterà e "dunk e immergere" le cassette nelle camere, seguendo il programma designato.
4. Impostare il programma eseguendo clic sui pannelli di controllo del processore del tessuto che comportano l'impostazione della durata per ogni camera.
5. Premere il pulsante" Start" per avviare il programma di elaborazione. Il seguente programma è progettato per i semi d'orzo e funziona durante la notte (18 h)
   1. Eseguire la disidratazione immergendo la cassetta per 1 h 30 min ciascuno nella serie di gradienti di etanolo (75%, 85%, 100%, 100% e 100% (v/v) etanolo).
   2. Eseguire la compensazione utilizzando l'etanolo: gradiente di xylene per 1 h 30 min ciascuno a 75:25, 50:50, 25:75 (etanolo: xylene %, v/v). Quindi immergere la cassetta per 1 h 30 min ciascuno di 100% xylene poi 100% xylene.
   3. Eseguire l'infiltrazione di paraffina a 55-60 gradi centigradi per 1 h 30 min due volte in paraffina fusa.
      NOTA: La temperatura delle camere di riscaldamento a paraffina può essere impostata sul retro del processore dei tessuti.
6. La mattina successiva, rimuovere le cassette dal processore dei tessuti e procedere all'incorporamento di paraffina.
   NOTA: il tempo di programma può variare tra diversi tipi di tessuto. Il vuoto e/o l'agitazione possono essere utilizzati durante l'elaborazione dei tessuti per accelerare l'infiltrazione di soluzioni selezionate premendo i pulsanti "V" e/o "agitazione" sul pannello di controllo del processore dei tessuti.

3. Incorporamento di paraffina

1. Utilizzare una macchina di incorporamento in questo passaggio (vedere Tabella dei materiali).
2. Preimpostare la macchina di incorporamento per accendere almeno un paio d'ore prima dell'incorporamento per consentire il tempo per la paraffina nei serbatoi di sciogliersi completamente.
3. Accendere la piastra fredda prima di iniziare.
4. Incorporare i campioni negli stampi tenendo i campioni in posizione utilizzando le fopando fini e erogando la paraffina fusa nello stampo. Garantire il corretto orientamento dei campioni per ogni scopo sperimentale. Per i semi d'orzo, orientare il seme longitudinale alla direzione di taglio per ottenere sezioni longitudinali.
   NOTA: gli stampi di incorporamento sono disponibili in diverse dimensioni. Selezionare una dimensione appropriata per consentire il corretto inserimento e l'inserimento del campione. L'orientamento dei campioni deve essere considerato a seconda delle esigenze sperimentali. Se sono necessarie sezioni longitudinali, il campione deve essere orientato longitudinale alla direzione di taglio, mentre per le sezioni trasversali il campione deve essere orientato parallelamente alla direzione di taglio.
5. Posizionare una cassetta pulita sullo stampo e assicurarsi che una paraffina sufficiente copi completamente l'intera cassetta per tenere il campione sulla cassetta.
6. Posizionare lo stampo sulla piastra fredda e lasciare che la paraffina si alisca completamente (10-20 min) prima di rilasciare il blocco dallo stampo.
7. Procedere con la sezionazione o trasferire i blocchi a 4 gradi centigradi per lo stoccaggio.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I blocchi incorporati possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di tre mesi.

4. Preparazione di scivoli a membrana di naphthalate in polietilene (PEN)

1. Immergere gli scivoli a membrana PEN nella soluzione di disattivazione RNase per 3 s seguita da due brevi lavaggi in acqua trattata dePC per rimuovere le rule sui vetrini. Asciugare i vetrini in un'incubatrice di 37 gradi per rimuovere la soluzione rimasta.
2. UV-trattare i vetrini utilizzando una lampada UV in un cabinet di flusso laminare per 30 min per migliorare le proprietà idrofili per una migliore adesione paraffina.

5. Sezionazione

1. Utilizzare un microtomo nel passaggio di sessazione (vedere Tabella dei materiali).
2. Posizionare una nuova lama nel supporto del coltello, e tenere sempre la guardia coltello quando non sezionare attivamente
   CAUTION: Le lame microtome sono estremamente affilate e possono causare danni significativi se trattate in modo inappropriato.
   NOTA: Ci sono due meccanismi di bloccaggio sul microtome, uno è sul lato della macchina e l'altro è sulla maniglia della ruota. Entrambi devono essere impegnati quando non attivamente sezionare.
3. Regolare il blocco di coltello per essere il più vicino possibile al campione senza toccare. Assicurarsi che il braccio microtomo non entra mai in pieno contatto con il blocco di coltello in quanto ciò causerà danni strutturali catastrofici al microtome.
4. Accendere la piastra fredda prima di iniziare. Mantenere i blocchi di paraffina sulla piastra fredda prima di sezionare e ri-raffreddare i blocchi quando necessario durante la sezionazione per evitare che i blocchi si ammorbidiscono.
5. Riempire il bagno d'acqua con acqua trattata DEPC e riscaldare a 42 gradi centigradi prima di iniziare.
6. Tagliare i blocchi alla profondità desiderata (dove la sezione che ti interessa) e i blocchi di paraffina di sezione allo spessore desiderato (6-10 m) utilizzando il microtomo; un blocco ben sezionato formerà un 'nastro' sul bordo della lama. Per i semi d'orzo, sezione con spessore di 8 m.
7. Trasferire delicatamente i nastri dal microtomo al bagno d'acqua utilizzando pennello fine o forfettari fini, assicurando che il nastro sia piatto sulla superficie dell'acqua.
8. Tenere uno scivolo ad un angolo di 45 gradi, utilizzando un movimento verso l'alto, sollevare un nastro dall'acqua sul scivolo e rimuovere con attenzione l'acqua in eccesso con un tessuto privo di lanugine.
9. Asciugare gli scivoli per 30 minuti a 37 gradi centigradi per eliminare l'acqua rimanente sotto la paraffina.
10. Procedere alla rimozione della paraffina o conservare a 4 gradi centigradi in una scatola chiusa in condizioni disidratante (da utilizzare entro diversi giorni).
11. Rimuovere la paraffina lavando i vetrini 3x per 20 s ciascuno in xylene, seguita da 2x lavaggi di 30 s in etanolo 100% (v/v) e 2x lavaggi di 30 s in etanolo 70% (v/v).
12. Procedere immediatamente alla microdissezione laser-cattura dopo la rimozione della paraffina.
    NOTA: Il cryosectioning è un metodo alternativo che è stato accoppiato con successo con LCM. La preparazione del campione per la criosezione sarà diversa.

6. Microdissezione di cattura laser

1. Utilizzare un microscopio a microscopia a cattura laser (vedi Tabella dei materiali) per microdissere le cellule da sezioni di tessuto de-paraffinato e essiccato.
2. Caricare le diapositive sui tre slot disponibili.
3. Utilizzare i tappi adesivo speciali dei tubi di raccolta per raccogliere i campioni catturati. L'acquisizione senza liquido (raccolta "a secco") riduce al minimo l'attività di RNase. Caricare i tubi di raccolta negli slot disponibili.
4. Spostare lo stage per individuare l'area del campione da tagliare. Questo può essere fatto utilizzando il mouse o joystick della macchina LCM, o i tasti freccia sulla tastiera.
5. Per ottimizzare la velocità di taglio, tagliare l'energia e la messa a fuoco, l'energia e la messa a fuoco della catapultamento della pressione laser (LPC), tagliare prima su un segmento vuoto privo di tessuto sullo scivolo a membrana. Per i semi d'orzo, velocità di taglio 18, CutEnergy - 52 CutFocus - 63, LPCEnergy - 78, messa a fuoco LPC - 61 a 10x ingrandimento.
   NOTA: La messa a fuoco e l'energia di taglio devono essere regolate per diversi vetrini, tessuti diversi e area catturata, ma le regole generali sono che la potenza di catapulta è superiore alla potenza di taglio e il laser deve essere defocused per catapultare. Maggiore è l'ingrandimento della lente obiettivo, minore è la messa a fuoco del laser e maggiore è l'energia.
6. Utilizzare gli strumenti disegno per selezionare le celle delineando l'area di interesse.
7. Selezionare la funzione RoboLPC dalla barra degli strumenti delle funzioni per catapultare le celle nei tappi adesive in base ai parametri ottimizzati ottenuti tagliando su un segmento nero sopra.
   NOTA: i parametri LCM variano tra i tipi di tessuto, nonché lo spessore della sezione, la durezza del tessuto e le lenti oggettive. Pertanto, è meglio ottimizzare ogni diapositiva su una semplice area di membrana senza campione di tessuto prima di tagliare il campione effettivo.
8. Utilizzare gli strumenti Contrassegno per contrassegnare le aree di interesse per individuarle immediatamente selezionando tale contrassegno dall'elenco degli elementi.
9. Controllare tramite il pulsante "CapCheck" per ispezionare il tappo adesivo per verificare che i campioni siano stati acquisiti. Tipicamente, LCM di 10-15 sezioni (200 cellule) per tappo è necessario per l'estrazione dell'RNA.
10. Tenere i campioni catturati sul ghiaccio. Procedere immediatamente per l'estrazione dell'RNA per evitare la degradazione dell'RNA.
    NOTA: Alcune microscopie LCM sono dotate di luce fluorescente che consente la cattura di cellule etichettate con marcatori fluorescenti.

7. Estrazione dell'RNA

1. Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA a basso input (vedere Tabella dei materiali) per l'estrazione dell'RNA dopo LCM. Tali kit sono progettati per recuperare costantemente RNA totale di alta qualità da meno di dieci cellule.
2. Isolare l'RNA totale dai tipi di cellule catturate secondo le istruzioni del produttore, incluso il trattamento DNase su colonna.
   NOTA: Il primo passo dell'estrazione dell'RNA in cui il tubo è invertito e sfarfallio è fondamentale per garantire che i campioni catturati sul coperchio siano a contatto con il buffer di estrazione aggiunto.

8. Amplificazione dell'RNA

1. Utilizzare un kit di amplificazione antisense RNA (aRNA) (vedi Tabella dei Materiali) per l'amplificazione dell'aRNA dall'RNA estratto dalla trascrizione in vitro per produrre aRNA sufficiente per la sintesi della libreria RNA-seq.
2. Eseguire due cicli di amplificazione utilizzando il kit di amplificazione aRNA secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: È importante preriscaldare il termo-ciclo e il coperchio alla temperatura istruita dal produttore del kit (vedi Tabella deimateriali ). Un approccio alternativo invece dell'amplificazione dell'RNA consiste nell'utilizzare un kit di preparazione della libreria a basso input per sintetizzare la libreria direttamente dall'RNA estratto.

9. Quantificazione dell'RNA

1. Quantificare e qualificare l'ARNA utilizzando un sistema di elettroforesi automatizzato (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Un sistema di elettroforesi automatizzato è preferito in quanto richiede meno campioni (1-2 L) e fornisce un'immagine gel-like ed elettropherogramma per ogni singolo campione.

10. qRT-PCR e/o RNA-seq

1. Sintetizzare cDNA dall'aRNA per qRT-PCR o per realizzare librerie RNA-seq utilizzando kit di libreria standard RNA-seq.

Risultati

Abbiamo generato trascrittori spaziali e temporali specifici del tessuto da semi d'orzo durante la germinazione utilizzando il nostro protocollo LCM RNA-seq¹⁰. Lo studio è stato condotto applicando LCM RNA-seq a un piccolo numero di cellule di tre organi embrionali (plumule, punta di radicolo, scutellum) ogni 8 h su un corso di tempo di 48 h durante la germinazione (0-48 h, 7 punti di tempo)(Figura 2A,B).

Discussione

Molti studi sull'espressione genica specifici dei tessuti sono stati limitati dalla dissezione manuale di campioni, che richiede molto tempo e richiede lavoro, ha un alto rischio di contaminazione e può utilizzare solo campioni che un operatore umano è sufficientemente abile da raccogliere. LCM è una tecnica precisa e senza contatto per raccogliere cellule da sezioni di tessuto fisse utilizzando un raggio laser azionato meccanicamente sotto visualizzazione microscopica.

Una buona preparazio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid 100 % ACS/R.	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC20104.323
AdhesiveCap 200 opaque	Zeiss	415190-9181-000
Clear base moulds 8 X 10	Leica	3803015
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	40718-25ML
High Sensitivity RNA ScreenTape	Agilent	5067-5579
Low­profile disp.blades DB80LS	Leica	14035843489
MembraneSlide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	Ambion (ThermoFisher)	AMB17515
On-Column DNase I Digestion Set	Sigma-Aldrich	DNASE70
Ovation RNA-Seq System V2	NuGen (Integrated Science)	7102-08
Paraffin (Surgipath Paraplast)	Leica	39601006
PicoPure RNA Isolation Kit	ABI (ThermoFisher)	KIT0214
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Ambion (ThermoFisher)	AM9780
Xylene	AnalaR NORMAPUR (BioStrategies)	VWRC28975.360
Leica Benchtop Tissue Processor	Leica Biosystems	TP1020
Leica Heated Paraffin Embedding Module	Leica Biosystems	EG1150H
Leica Cold Plate	Leica Biosystems	EG1150C
Safemate Class 2 Biological Safety Cabinets	LAF Technologies Pty Ltd	Safemate 1.5
Leica Fully Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2265	with PALMRobo v 4.6 software
Zeiss PALM MicroBeam LCM system	Zeiss miscroscopy
TapeStation	Agilent	TapeStation 2200