Isolamento delle cellule CD8 + T residenti neireni del topo per l'analisi della citometria a flusso

Riepilogo

A seguito di infezione virale, il rene ospita un numero relativamente elevato di cellule CD8⁺ T e offre l'opportunità di studiare le cellule T RM non_mucose. Qui descriviamo un protocollo per isolare i linfociti renali del topo per l'analisi della citometria del flusso.

Abstract

La cellula T di memoria residente nei tessuti (T_RM)è un campo in rapida espansione della ricerca immunologica. Isolare le cellule T da vari tessuti non linfoidi è uno dei passaggi chiave per indagare le_{T RM.} Ci sono lievi variazioni nei protocolli di isolamento dei linfociti per diversi organi. Il rene è un organo non linfoide essenziale con numerose infiltrazioni delle cellule immunitarie soprattutto dopo l'esposizione agli agenti patogeni o l'attivazione autoimmune. Negli ultimi anni, diversi laboratori tra cui il nostro hanno iniziato a caratterizzare cellule CD8⁺ T residenti nei reni in vari contesti fisiologici e patologici sia nel topo che nell'uomo. A causa dell'abbondanza di linfociti T, il rene rappresenta un organo modello attraente per studiare le T_RMnei tessuti non mucosi o non barriera. Qui, descriveremo un protocollo comunemente usato nei laboratori focalizzati su T_RMper isolare le cellule CD8⁺ T dai reni del topo a seguito di infezione virale sistemica. In breve, utilizzando un modello di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV) nei topi C57BL/6, dimostriamo l'etichettatura intravascolare delle cellule CD8⁺ T, la digestione enzimatica e la centrifugazione del gradiente di densità per isolare e arricchire i linfociti dai reni del topo per preparare i campioni per la successiva analisi citometrica del flusso.

Introduzione

Le cellule T di memoria residente nei tessuti (T_RM)rappresentano una delle popolazioni di cellule T più abbondanti nei topi adulti umani e infetti. Le cellule T_RM forniscono la prima linea di difesa immunitaria e sono coinvolte criticamente in vari processi fisiologici e^{patologici 1,2,3,4,5}. Confrontandosi con le cellule T circolanti, le celle T_RM trasportano marcatori di superficie distinti con programmi di trascrizione^{univoci 6,7,8}. Ampliare la nostra conoscenza della biologia T_RM è la chiave per comprendere le risposte delle cellule T, che è essenziale per il futuro sviluppo di vaccini e immunoterapie a base di cellule T.

Oltre ai marcatori molecolari comunemente condivisi di T_RMsu tutti i tessuti non linfoidi, l'accumulo di prove suggerisce che le caratteristiche specifiche dei tessuti sono una componente centrale della biologia T_RM ⁹. Il rene ospita molte cellule immunitarie tra cui le cellule T_RM dopo l'infezione e offre una grande opportunità per studiare la biologia cellulare T_RM in un tessuto non mucoso. L'infezione acuta da LCMV (virus della coriomeningite linfocitica) attraverso la via intraperitoneale è un modello di infezione sistemica ben consolidato per studiare le risposte delle cellule T specifiche dell'antigene nei topi. L'infezione viene solitamente risolta in 7-10 giorni in topi di tipo selvatico e lascia un gran numero di cellule T di memoria specifiche di LCMV in una varietà di tessuti, incluso il^{rene 10}. I topi transgenici P14 TCR (T cell receptor) trasportano cellule CD8⁺ T riconoscono uno degli epitopi immuno-dominanti dell'LCMV presentati dalla molecola H2-D b della molecola H2-D^b della classe I (complesso di istocompatibilità maggiore) nei topi C57BL/6. Viene monitorata la combinazione di trasferimento adottivo di cellule P14 T marcate congenicamente e infezione da LCMV nei topi, vengono monitorati l'effettore CD8⁺ e le cellule T di memoria, tra cui la differenziazione T_RM e l'omeostasi.

In alcuni tessuti barriera, come il compartimento dei linfociti intraepiteliali intestinali (IEL) e le ghiandole salivari, la procedura di isolamento dei linfociti stabilita produce_un'alta percentuale di cellule T RM con una contaminazione minima delle cellule T trasmessa dal sangue nel topo LCMV modello¹¹. Tuttavia, nei tessuti non barriera, come il rene, la fitta rete vascolare contiene un gran numero di cellule CD8⁺ T circolanti. È stato ben documentato che anche una perfusione riuscita non può rimuovere in modo efficiente tutte le cellule CD8⁺ T circolanti. Per superare questo ostacolo tecnico, la colorazione degli anticorpi intravascolari è stata stabilita come una delle tecniche più comunemente utilizzate nei laboratori T_RM ¹². In breve, 3-5 minuti prima dell'eutanasia, 3 μg/ anticorpo anti-CD8 del mouse (per etichettare le cellule CD8⁺ T) vengono consegnati per via endovenosa. La parete intatta dei vasi sanguigni impedisce una rapida diffusione dell'anticorpo in questo breve periodo di tempo (cioè 3-5 minuti) e vengono etichettate solo le cellule intravascolari. Seguendo il protocollo standard di isolamento dei linfociti, le cellule intravascolari rispetto a quelle extravascolari possono essere facilmente distinte usando la citometria a flusso.

Qui, descriveremo un protocollo standard comunemente utilizzato nei laboratori T_RM per eseguire l'etichettatura intravascolare, l'isolamento dei linfociti e l'analisi citometrica del flusso delle cellule REnali CD8⁺ T utilizzando un mouse C57BL/6 che ha ricevuto cellule CD45.1⁺ P14 T e infezione da LCMV 30 giorni prima^{delle 13}. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per studiare sia le cellule T dell'effettore che della memoria nel rene.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti a seguito di questo protocollo devono essere approvati dal rispettivo Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). Tutte le procedure qui descritte sono state approvate da IACUC UT Health San Antonio.

1. Trasferimento adottivo di cellule P14 T in destinatari C57BL/6 e infezione da LCMV

1. Utilizzare topi P14 a 6-12 settimane di età. Assicurarsi che il sesso del topo transgenico P14 TCR donatore corrisponda al sesso dei topi ricevente C57BL/6. Altrimenti, cellule come le cellule T maschili che si trasferiscono nei topi femmine si tradurranno in un rifiuto immuno-mediato delle cellule T del donatore circolante in circa 12 giorni¹⁴.
2. Purificare le ingenue cellule CD8⁺ T dalla milza e dai linfonodi di un mouse transgenico P14 TCR utilizzando il kit di purificazione delle cellule CD8⁺ T del mouse seguendo il protocollo del produttore.
   1. In breve, sezionare milza e linfonodi, schiacciare i campioni per generare una sospensione a singola cellula.
   2. Per arricchire per le cellule T ingenue, aggiungere anticorpi biotina-anti-CD44 durante la prima fase di incubazione degli^{anticorpi 13}.
      NOTA: Il kit commerciale di selezione negativa utilizzato in questa fase contiene due componenti principali per due fasi di incubazione (ad esempio, incubazione di miscela biotina-anticorpo e incubazione di perline magnetiche streptavidin).
3. Usa un emocitometro per contare le cellule e iniettare da 1.000 a 10.000 cellule P14 T purificate in 200 μL di PBS in ogni destinatario C57BL/6 abbinato al sesso attraverso la vena della coda.
   NOTA: Il protocollo dettagliato di iniezione delle vene della coda è descritto nel passaggio 2.
4. Il giorno successivo, tutti i destinatari C57BL/6 ricevono 2 x 10⁵ pfu LCMV Armstrong diluito in 200 μL di PBS attraverso una via intraperitoneale.

2. Etichettatura intravascolare di cellule CD8⁺ T

NOTA: A seconda degli interessi di ricerca, diversi punti di tempo possono essere scelti dopo l'infezione. Viene dimostrato un esempio del giorno 30 dopo l'infezione (giorno 30 dopo il passaggio 1.4), che è spesso considerato come un punto di tempo di memoria precoce per la risposta cellulare CD8 T.

1. Diluire l'anticorpo anti-CD8α della biotina a 15 μg/mL in PBS. Assicurarsi che ogni topo riceva 200 μL di PBS contenente 3 μg di anticorpo.
   NOTA: L'anticorpo biotina anti-CD8 viene utilizzato qui in modo che sia più flessibile progettare il pannello di colorazione FACS finale. L'anticorpo fluorescente etichettato colorante può essere utilizzato direttamente. Tuttavia, è importante utilizzare diversi cloni di anticorpi monoclonali per l'etichettatura endovenosa rispetto alla colorazione FACS.
2. Riscaldare correttamente la vena di coda dei topi con una lampada termica in testa per 5-10 minuti per dilatare le vene.
   NOTA: Occorre prestare particolare attenzione per evitare il surriscaldamento degli animali. Ridurre il fuoco o rimuovere la lampada termica se i topi si sono fermati a muoversi.
3. Esegnare 200 μL di miscela di anticorpi anti-CD8α prediluti in una siringa per insulina da 100 U (28G) e rimuovere eventuali bolle d'aria spostando il pistone su e giù. Piegare l'ago per creare un angolo di 150 ° tra l'ago e la siringa, smussare, in modo che l'ago sia parallelo alla vena.
4. Trattenere il topo con un limitatore di roditori di dimensioni appropriate e spruzzare la coda con il 70% di etanolo per rendere la vena chiaramente visibile.
   NOTA: La durata del sistema di ritenuta deve essere mantenuta al minimo.
5. Tenere la coda all'estremità distale con il pollice e le dita medie della mano non dominante. Posizionare l'indice sotto il sito in cui verrà inserito l'ago.
6. Tenere la siringa con la mano dominante e inserire l'ago nella vena in parallelo verso la direzione del cuore.
   NOTA: Quando si posiziona correttamente, l'ago dovrebbe muoversi senza intoppi nella vena.
7. Iniettare lentamente 200 μL di anticorpi anti-CD8α attraverso la vena della coda.
   NOTA: Se c'è una resistenza o si vede un'area bianca sopra l'ago sulla coda, l'ago non è all'interno della vena. Avviare l'iniezione iniziale vicino alla punta della coda. Quando necessario, andare avanti verso il fondo della coda per successive iniezioni.
8. Rimuovere l'ago e applicare delicatamente la compressione fino all'arrestarsi del sanguinamento.
9. Riportare il topo nella gabbia ed eutanasiare il topo dopo 3-5 minuti.
   NOTA: I topi devono essere eutanasiati tramite camera isoflurana seguita da lussazione cervicale. Altri metodi, come l'inalazione di CO_2, richiederanno fino a 5 minuti e possono introdurre inutili variazioni del tempo di etichettatura degli anticorpi per via endovenosa.
10. Sezionare il rene usando le forbici, trasferire l'intero rene a 1,5 ml di tubi di microcentrifugo e lasciare i campioni sul ghiaccio fino a un'ulteriore lavorazione.
    NOTA: Il rene intero intatto può essere conservato in sicurezza sul ghiaccio per alcune ore prima della successiva lavorazione e digestione.

3. Digestione enzimatica del rene

1. Preparare 6 piastre di pozzo contenenti 3 ml della soluzione di digestione (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenasi B) per ogni topo, conservare sul ghiaccio.
   NOTA: La soluzione di collagenasi B a concentrazione più elevata (ad esempio, 20x) può essere preparata e conservata a -20°C o inferiore. La soluzione di lavoro deve essere preparata fresco. Vedere la tabella 1 per le ricette per tutte le soluzioni/buffer utilizzati nel protocollo corrente.
2. Aggiungere 300 μL di soluzione di digestione nei tubi campione di microcentrifugo da 1,5 ml e tritare i campioni di rene con una forbice a molla dritta.
   NOTA: Il tessuto renale deve essere tritato in pezzi pari con dimensioni non superiori a 1,5 mm di diametro. Non è richiesta alcuna fase di decapsulazione.
3. Trasferire i campioni di rene tritati in 6 piastre di pozzo contenenti la soluzione di digestione
   NOTA: 6 piastre di pozzo vengono utilizzate per comodità solo quando ci sono più campioni da elaborare.
4. Incubare i campioni a 37 °C con dondolo delicato (circa 60 giri/min) per 45 minuti.
5. Dopo la digestione, schiacciare il tessuto con la flangia dello stantuffo di una siringa da 3 ml direttamente all'interno del piatto e trasferirlo in tubi conici da 15 ml.
   NOTA: Di solito la filtrazione attraverso un colino cellulare non è richiesta in questo passaggio perché la centrifugazione del gradiente di densità viene eseguita accanto per purificare i linfociti vivi.
6. Far girare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
7. Resuspend il pellet in 3 mL di RPMI/10% FCS.

4. Centrifugazione gradiente densità per arricchire i linfociti dal rene digerito

1. Far girare il campione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
2. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con 5 mL del 44% di mix Percoll/RPMI (44% Percoll + 56% RPMI senza FBS).
3. Mettere la punta di una pipetta da 3 ml contenente 3 mL di 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) direttamente sul fondo di ciascun tubo e rilasciare lentamente la soluzione in modo che la soluzione pesante (67% Percoll/PBS) formi uno strato distinto nella parte inferiore e la soluzione luminosa (44% Percoll/RPMI) sia sollevata. Insieme, si formeranno strati di cocktail.
   NOTA: Per il mezzo gradiente di densità appena arrivato dal fornitore, aggiungere 1/10 volume di PBS sterile 10x alla bottiglia, mescolare bene e considerare il mezzo gradiente di densità bilanciato PBS come soluzione al 100%.
4. Ruotare i campioni a 900 x g per 20 minuti a temperatura ambiente con acceleratore ridotto e impostazione del freno.
   NOTA: Per le centrifughe con impostazioni acceleratore e freno (su scala 1-9 (1 significa minimo e 9 significa massimo)), utilizzare 6 per l'acceleratore e 4 per il freno.
5. Rimuovere con cura i tubi dalla centrifuga senza disturbare gli strati;
   NOTA: Viene identificato uno strato di linfociti chiaro tra lo strato RPMI di colore rosa e lo strato PBS incolore.
6. Rimuovere lo strato superiore con una pipetta di trasferimento senza toccare lo strato di linfocita.
7. Trasferire lo strato di linfocita in un nuovo tubo da 15 ml, riempire il tubo con PBS/5% FCS e mescolare invertendo lentamente il tubo 4-6x per garantire una miscelazione sufficiente.
   NOTA: Questo passaggio è importante per lavare via eventuali Percoll residui.
8. Far girare i campioni a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
9. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare con 500 μL di mezzo RPMI completo. Le cellule sono pronte per la colorazione citometrica del flusso.

5. Colorazione e analisi della citometria del flusso

NOTA: Seguire il protocollo standard di colorazione della citometria a flusso per i linfociti T.

1. Prendere circa 1 x 10^{6 celle} per ogni colorazione FACS.
   NOTA: Utilizzare una piastra a U-bottom 96 per la colorazione FACS. Tuttavia, se si tratta solo di un numero limitato di campioni, è possibile utilizzare anche tubi FACS da 5 ml.
2. Far girare le cellule a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il supernatante.
3. Resuspend ogni campione in 50 μL di tampone FACS contenente 10 μg/mL di blocco FcR 2.4G2 (un anticorpo monoclonale anti-CD16/32 per bloccare l'interazione tra l'anticorpo FACS aggiunto con FcR). Incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
4. Senza ulteriore centrifugazione, aggiungere 50 μL di miscela anticorpale di colorazione superficiale per ciascun campione in modo che il volume finale di colorazione sia di 100 μL/ciascun campione. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio.
   NOTA: Includere la streptavidina con etichetta fluorescente (2 μg/mL o seguire la raccomandazione del produttore) nella miscela di anticorpi per etichettare le cellule CD8α⁺ INTRAVASCOLARE CD8⁺ T e utilizzare anticorpi fluorescenti etichettati anti-CD8β per etichettare tutte le cellule T CD8. La miscela di anticorpi viene effettuata aggiungendo le quantità desiderate di anticorpi interessati nel tampone FACS.
5. Lavare i campioni con PBS due volte. Per ogni lavaggio, riempire i pozzi di 96 piastra del pozzo con PBS freddo, girare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il supernatante.
6. Rimorsiva le cellule in 100 μL/pozzo di colorante vivo/di morte diluito. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio.
   NOTA: Anche con lo spin medio gradiente di densità, la fase di digestione enzimatica spesso induce una morte cellulare significativa nelle cellule T residenti nei tessuti a causa della segnalazione ARTC2.2/P2RX7¹⁵. La colorazione del colorante vivo/di morte è altamente raccomandata prima della fissazione. Il nanocorpo anti-ARTC2 può essere amministrato nei topi prima dell'eutanasia per prevenire la morte cellulare indotta dall'isolamento cellulare.
7. Lavare i campioni con tampone FACS due volte. Per ogni lavaggio, riempire i pozzi di piastra da 96 pozzi con tampone FACS freddo, girare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il supernatante.
8. Rimossare le cellule in tampone di fissaggio di 100 μL/pozzo. Incubare a 37 °C per 10 minuti.
   NOTA: Il tampone di fissaggio viene fatto appena diluire la formaldeide con PBS ad una concentrazione finale del 2% di formaldeide.
9. Lavare i campioni con tampone FACS due volte. Per ogni lavaggio, riempire i pozzi di 96 piastra del pozzo con tampone FACS freddo, girare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il supernatante.
10. Rimospendare le cellule in tampone FACS da 250 μL/pozzo. Sigillare la piastra, conservare a 4 °C e proteggere dalla luce fino all'analisi FACS.
    NOTA: Prima dell'analisi FACS, filtrare i campioni attraverso una rete di nylon da 70 μM per rimuovere possibili cluster di celle che potrebbero ostruire la macchina FACS.

Risultati

Il protocollo qui descritto è riassunto in un diagramma di flusso (Figura 1A). Al giorno 30 dopo l'infezione da LCMV, abbiamo eseguito l'etichettatura intravascolare delle cellule CD8⁺ T. 5 minuti dopo, entrambi i reni dell'animale sono stati sezionati, tritati e sottoposti a digestione della collagenasi. I linfociti sono stati ulteriormente purificati dai campioni digeriti tramite centrifugazione Percoll e analizzati per citometria a flusso. Come mostrato nella

Discussione

Poiché l'immunità specifica dei tessuti è un'area di ricerca in rapida espansione, l'accumulo di prove suggerisce che le cellule immunitarie, in particolare la popolazione di linfociti, possono essere identificate in quasi tutti gli organi di topi adulti umani o infetti o immunizzati. Il modello di infezione da topo LCMV è un modello consolidato per studiare la differenziazione cellulare T specifica dell'antigene, dell'effettore e della memoria, compresa la biologia T_{RM su} più tessuti. Qui, abbiamo descri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisherbrand	05-408-130
15 ml Conical Tubes	Corning	431470
3 ml syringe	BD	309657
37C incubator	VWR
Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7)	Tonbo Biosciences	30-0081-U025
Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073.03
Collegenase B	Millipore Sigma	11088807001
Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Insulin Syringe	BD	329424
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical	RS 5692
Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit	Biolegend	480043
overhead heat lamp	Amazon	B00333PZZG
PBS
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	17089101
rocker	VWR
RPMI	GE Healthcare Life Sciences	SH30096.01
Solid Brass Mouse Restrainer	Braintree Scientific, Inc	SAI-MBR
Swing Bucket Centrifuge with refrigerator	Thermofisher
Tissue Culture 6-well plate	Corning	3516