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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo protocollo, è stato descritto un metodo per l'estrazione genica e l'analisi della sequenza della purina nucleosidasi (PN, EC:3.2.2.1) basato su RNA-Seq. L'analisi ProtProm è stata applicata per mostrare le strutture secondarie e terziarie uniche della PN. Inoltre, il gene PN è stato clonato dal trascrittoma per verificare l'affidabilità dei risultati dell'RNA-Seq.

Abstract

Il fungo bruco (Ophiocordyceps sinensis) è uno dei funghi più apprezzati della medicina tradizionale cinese (MTC) e contiene molti principi attivi come l'adenosina. L'adenosina è considerata un ingrediente biologicamente efficace che ha una varietà di attività antitumorali e immunomodulatorie. Al fine di chiarire ulteriormente il meccanismo della purina nucleosidasi (PN) nella biosintesi dell'adenosina, è stato estratto con successo un gene che codifica per la PN e ulteriormente analizzato sulla base del database RNA-Seq del fungo bruco. Il cDNA a lunghezza intera di PN era di 855 bp, che codificava 284 amminoacidi. L'analisi BLAST ha mostrato l'omologia più alta dell'85,06% con la nucleosidi idrolasi in NCBI. L'analisi ProtProm ha mostrato che il peso molecolare relativo era di 30,69 kDa e il punto isoelettrico era di 11,55. La struttura secondaria della PN è stata prevista dalla proteina Predict; I risultati hanno mostrato che la struttura dell'elica alfa rappresentava il 28,17%, la struttura dello strand l'11,97% e la struttura dell'anello il 59,86%. Inoltre, il gene PN è stato ulteriormente clonato dal trascrittoma e rilevato mediante elettroforesi su gel di agarosio per la verifica. Questo studio fornisce basi scientifiche più sufficienti e nuove idee per la regolazione genetica della biosintesi dell'adenosina nella MTC fungina.

Introduzione

La medicina tradizionale cinese (MTC) fungina ha abbondanti risorse di specie 1,2. Il fungo bruco (Ophiocordyceps sinensis) è un noto fungo della MTC ed è considerato una fonte di farmaci innovativi 3,4. Il fungo bruco è una miscela combinata di vermi e funghi che si trova sull'altopiano tibetano nel sud-ovest della Cina, dove l'Hirsutella sinensis è parassita sul corpo del bruco5. Attualmente, H. sinensis è segnalato come l'unico anamorfo del fungo bruco secondo le prove di biologia molecolare e morfologica 6,7, e ha una tossicità associata inferiore e un'efficacia clinica simile rispetto al fungo bruco selvatico8. È stato rivelato che H. sinensis possiede una varietà di ingredienti biologicamente efficaci, come nucleosidi, polisaccaridi ed ergosteroli, con ampi effetti farmacologici come la riparazione di un danno epatico 9,10,11. L'adenosina è un tipico ingrediente attivo isolato dal fungo bruco ed è una sorta di alcaloide purinico12. L'adenosina ha una varietà di attività biologiche: attività antitumorali, antibatteriche e immunomodulanti 13,14. Sfortunatamente, il meccanismo biosintetico dell'adenosina e i geni chiave coinvolti non sono ancora chiari15,16.

L'adenosina mostra il suo effetto antitumorale principalmente attraverso azioni immunosoppressive nel microambiente tumorale17. È stato riportato che l'adenosina mostrava funzioni immunosoppressive, che erano fondamentali per avviare la riparazione dei tessuti dopo un infortunio e per proteggere i tessuti da un'eccessiva infiammazione18,19. Inoltre, è stato dimostrato che la repressione dell'immunità mediata dall'adenosina potrebbe compromettere gravemente l'immunosorveglianza del cancro e promuovere la crescita tumorale20. Pertanto, è urgente studiare il meccanismo della biosintesi dell'adenosina per la sua ampia applicazione nell'antitumorale.

È stato riportato che una visione completa dei geni espressi e dei loro livelli di espressione potrebbe essere condotta sistematicamente mediante il sequenziamento di nuova generazione del trascrittoma21. Inoltre, il sequenziamento e l'analisi del trascrittoma sono stati applicati per prevedere i geni coinvolti nella via biosintetica dei principi attivi e studiare ulteriormente l'interazione di diverse vie biosintetiche22. La nucleosidasi delle purine (PN, EC 3.2.2.1) è una classe di nucleosidasi con specificità di substrato per i nucleosidi purinici, che possono idrolizzare i legami glicosidici dei nucleosidi purinici in zuccheri e basi23. In genere svolge un ruolo importante nella biosintesi dell'adenosina. È stato riportato che la via biosintetica dell'adenosina nella MTC fungina era prevista; La qPCR e l'espressione genica hanno dimostrato che l'aumento dell'accumulo di adenosina è il risultato di una sottoregolazione del gene PN , indicando che il gene PN può svolgere un ruolo importante nella biosintesi dell'adenosina15. Pertanto, il meccanismo della PN nella biosintesi dell'adenosina deve essere chiarito con urgenza. Tuttavia, le informazioni sulla sequenza e la struttura proteica della PN, così come altri geni chiave coinvolti nella biosintesi dell'adenosina della MTC fungina, non sono stati ulteriormente studiati.

In questo studio, una nuova sequenza del gene PN è stata estratta dai dati RNA-Seq del fungo bruco e verificata mediante clonazione genica. Inoltre, sono state analizzate in modo approfondito le caratteristiche molecolari e la struttura proteica della PN, che potrebbero fornire nuove direzioni e idee per la regolazione genica della biosintesi dell'adenosina.

Protocollo

NOTA: Un ceppo di anamorfo di fungo bruco (H. sinensis) è stato depositato nel nostro laboratorio. Escherichia coli I DH5 sono stati conservati dall'Ospedale di Shenzhen, Università di Medicina Cinese di Pechino.

1. Preparazione per l'RNA-Seq

  1. Raccolta di miceli
    1. Preparare il terreno di fermentazione per la fermentazione di H. sinensis: farina di mais in polvere (1%), pupe di bachi da seta (1,5%), estratto di lievito (0,5%), triptone (1%), glucosio (1,5%), crusca (1,5%), destrina (0,5%), KH2PO4 (0,02%) e MgSO4 (0,01%).
    2. Preparare l'inoculazione con il terreno di fermentazione al 10% per la coltura su scala (aggiungere 10 ml di terreno per 100 ml di terreno). Condurre la fermentazione sommersa alla condizione di 16 °C su un agitatore rotante a 150 giri/min per 10 giorni.
    3. Riproduci e raccogli asessualmente i miceli dell'anamorfo del fungo bruco per 10 giorni. Centrifugare il terreno fermentato e scartare il surnatante dopo la centrifugazione. Sospendi il micelio aggiungendo 100 ml di acqua ultrapura per 3 volte e rimuovi il surnatante per centrifugazione. Macinare il micelio pulito in polvere utilizzando azoto liquido.
  2. RNA-Seq
    1. Estrarre l'RNA totale dell'anamorfo del fungo bruco secondo i protocolli del produttore (Tabella dei materiali) e trattare ulteriormente il campione con DNasi I (Tabella dei materiali) priva di RNasi.
    2. Isolare l'mRNA dall'RNA totale dei sistemi di isolamento dell'mRNA PolyATtract e isolare l'mRNA del poli(A) utilizzando perle con oligo(dT) secondo i protocolli del produttore (Tabella dei materiali).
    3. Prendi i frammenti corti come modelli per sintetizzare il cDNA del primo filamento mediante esamero-primer casuali secondo i protocolli del produttore (Tabella dei materiali). Eseguire la sintesi del cDNA del secondo filamento secondo i protocolli del produttore.
    4. Successivamente, generare le librerie di sequenziamento utilizzando l'Ultra RNA Library Prep Kit secondo i protocolli del produttore (Tabella dei materiali).
    5. Purificare i frammenti corti con il kit di estrazione PCR secondo i protocolli del produttore (Tabella dei materiali) e risolverli rispettivamente con il tampone EB.
    6. Collegare i frammenti corti (soglia di 300 bp) con adattatori di sequenziamento in base al risultato dell'elettroforesi su gel di agarosio.
    7. Successivamente, condurre l'amplificazione con PCR utilizzando i modelli selezionati da frammenti idonei.
    8. Sequenzia la libreria di Illumina HiSeq 4000 con il sequenziamento paired-end secondo i protocolli del produttore. Filtrare le letture non elaborate dai dati della sequenza non elaborati per ottenere dati puliti. Adotta l'assembly denovo per ottenere Unigenes con il minimo N che non può essere esteso su entrambe le estremità.
    9. Allinea le sequenze Unigene mediante blastx a database di proteine come nr, Swiss-Prot, KEGG e COG (valore e < 0,00001). Recupera le proteine con la più alta somiglianza di sequenza con gli Unigenes dati insieme alle loro annotazioni funzionali proteiche. Riassumere i risultati dell'RNA-Seq (Tabella dei materiali).
      NOTA: Nei passaggi precedenti sono stati utilizzati kit commerciali e tutte le operazioni sono state eseguite secondo il protocollo del produttore.

2. Estrazione genica della nucleosidasi purinica

  1. Scarica i file dei risultati dell'RNA-Seq sul computer. Trova i file dei risultati delle annotazioni degli Unigene assemblati dai risultati RNA-Seq.
    NOTA: Le letture paired-end sono state utilizzate di nuovo per il riempimento degli scaffold per ottenere sequenze con meno N che non possono essere estese su entrambe le estremità. Tali sequenze sono state definite Unigenes. L'annotazione Unigene fornisce informazioni sull'espressione e l'annotazione funzionale di Unigene.
  2. Apri il percorso dei file di annotazione e inserisci la mappa 00230 nella barra di ricerca; quindi cerca Metabolismo delle purine (map00230) nella classificazione KEGG dei file di annotazione.
  3. Contrassegnare EC:3.2.2.1 (PN) in rosso nella mappa annotata00230 e indicare che sono stati assemblati Unigene che sono stati annotati su PN.
    NOTA: C'erano tre Unigene (Unigene10777, Unigene14697 e Unigene17827) annotati su PN dopo aver cliccato sul numero EC 3.2.2.1 e mostrati nella mappa annotatata.
  4. Fare clic sul numero EC 3.2.2.1 e visualizzare le informazioni Unigenes annotate.
  5. Apri il software LTFViewer e importa il file Unigene.fa con una scorciatoia Ctrl-O e mostra le informazioni sulla sequenza degli Unigene assemblati.
  6. Cerca le informazioni sulla sequenza di Unigene10777, Unigene14697 e Unigene17827 con una scorciatoia Ctrl-F .
  7. Scarica le informazioni sulla sequenza di Unigene10777, Unigene14697 e Unigene17827 con le scorciatoie Ctrl-C e Ctrl-V.
  8. Elimina Unigene10777 e Unigene17827 con sequenze eccessivamente brevi di frame di lettura aperto (ORF).
    NOTA: Le informazioni di base sulla sequenza sono state visualizzate nel software LTFViewer.
  9. Selezionare Unigene14697 (dimensione 1.705 bp, gap 0,0%) con lunghezza ORF adeguata per ulteriori studi.

3. Analisi bioinformatica

  1. Analizzare l'ORF del gene PN mediante ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. Incolla la sequenza nella casella. Scegliere i parametri come segue, lunghezza minima ORF (nt): 75, codice genetico: 1. standard, codone di inizio ORF da utilizzare: solo ATG. Fare clic sul pulsante Invia per ottenere le informazioni ORF.
  2. Utilizzare lo strumento ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) per calcolare la massa molecolare teorica e il punto isoelettrico.
    1. Incolla la sequenza di amminoacidi (in codice di una lettera) nella casella e fai clic sul pulsante Calcola parametri per ottenere i risultati.
  3. Applicare SignalP5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) per stimare i peptidi segnale.
    1. Inserire le sequenze proteiche in formato FASTA. Scegli i parametri come segue, gruppo di organismi: Eukarya, formato di output: Uscita lunga. Fare clic sul pulsante Invia per ottenere i risultati.
  4. Applicare BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) per analizzare l'omologia delle sequenze proteiche.
    1. Fare clic sul pulsante Protein Blast e inserire la sequenza nella casella. Scegliere i parametri come segue, database: Sequenze proteiche non ridondanti (nr), algoritmo: blastp (proteina-proteina BLAST). Fare clic sul pulsante Esplosione per ottenere i risultati.
  5. Applicare il programma Clustal X (http://www.clustal.org/) per allineare le sequenze acide di PN di diversi funghi.
    1. Carica un file o incolla le sequenze nella casella. Impostare i parametri come segue, formato di output: ClustalW con conteggio dei caratteri. Fare clic sul pulsante Invia per ottenere i risultati. Clustal X è in grado di riconoscere solo i file in formato FASTA e il percorso dei file può includere solo nomi inglesi.
  6. Usa MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) per condurre l'albero filogenetico.
    1. Apri il software e fai clic sul pulsante File per caricare le sequenze. Seleziona il tipo di dati come Sequenze proteiche, fai clic sul pulsante OK per procedere al passaggio successivo. Successivamente, fai clic sul pulsante Filogenesi e seleziona Filogenesi del test Bootstrap, quindi fai clic su Albero di unione dei vicini. Selezionare i parametri predefiniti e fare clic sul pulsante Calcola per ottenere i risultati.
  7. Applicare InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) per identificare il dominio catalitico della PN.
    1. Inserisci la sequenza nella casella. Seleziona i parametri predefiniti e fai clic sul pulsante Cerca per ottenere i risultati.
  8. Applica Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) online per prevedere la struttura secondaria della proteina.
    1. Inserisci una sequenza di aminoacidi (codice di una lettera) nella casella, quindi fai clic sul pulsante predictProtein per ottenere i risultati.
  9. Applicare gli strumenti online SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) per valutare la struttura tridimensionale di PN24.
    1. Fare clic sul pulsante Avvia modellazione e incollare la sequenza di destinazione nella casella. Inserisci il titolo del progetto e le informazioni dell'e-mail e fai clic sul pulsante Cerca modelli per ottenere i risultati.

4. Clonaggio genico e costruzione di plasmidi ricombinanti

  1. Primer di progettazione il cui primer inverso conteneva un sito NotI e il primer in avanti aveva un sito EcoRI.
  2. Mostra l'innesco in avanti come: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), e l'innesco in avanti come: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') di Primer Express.
  3. Preparare i primer e il cDNA del fungo bruco per la clonazione del gene PN . Eseguire la PCR come segue: pre-denaturazione a 95 °C per 5 minuti, denaturazione a 94 °C per 45 secondi, rinaturazione a 55 °C per 60 secondi, estensione a 72 °C per 90 secondi, ripetizione per 35 cicli ed estensione a 72 °C per 10 minuti.
  4. Ottenere i frammenti di PCR e rilevarli mediante elettroforesi su gel di agarosio per la verifica. Legare i frammenti di PCR con pMD18-T. Condurre il sistema di legatura di PMD18-T come segue: 1 μL di PMD18-T, 4 μL di soluzione1 e 5 μL di gene bersaglio. Impostare le condizioni come segue: mantenimento a 16 °C per 16 h, inattivazione a 65 °C per 15 min.
  5. Trasferire i plasmidi ricombinanti alle cellule JM109 di E. coli competenti secondo il manuale operativo25.
  6. Digerire i plasmidi ricombinanti pMD18-T/PN e il vettore ppic9K con EcoRI e NotI. Legare i frammenti dopo la digestione mediante DNA ligasi T4.
  7. Costruire il plasmide ricombinante ppic9K/PN per un'ulteriore espressione eterologa.

Risultati

La sequenza ORF del gene PN era lunga 855 bp, che codificava 284 amminoacidi con una massa molecolare calcolata di 30,69 kDa e un punto isoelettrico previsto di 11,55, indicando che PN è una proteina alcalina. L'applicazione di SignalP4.0 Server è stata condotta per identificare il peptide segnale e i risultati hanno indicato che PN non ha peptidi segnale. Inoltre, i risultati della ricerca BLASTP hanno indicato che la PN ha avuto origine dal fungo bruco che condivideva la pi?...

Discussione

La salute umana sta affrontando una serie di importanti problemi medici come malattie tumorali, cardiovascolari e cerebrovascolari26,27. La MTC è stata considerata la fonte della ricerca e dello sviluppo di medicine innovative, a causa delle sue ricche risorse di specie e della diversa struttura e funzioni dei principi attivi28,29. Il fungo bruco è un parassita fungino ...

Divulgazioni

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31871244, 81973733, 81803652), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (2019A1515011555, 2018A0303100007), dalla Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZBC2018016), dal Fondo speciale per lo sviluppo economico e tecnologico del distretto di Longgang della città di Shenzhen (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

Riferimenti

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