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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'approccio tecnico per isolare sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi di tessuto adiposo bianco (WAT) murino intra-addominale mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o separazione di microsfere immunomagnetiche.

Abstract

La frazione stromale-vascolare (SVF) del tessuto adiposo bianco (WAT) è notevolmente eterogenea ed è costituita da numerosi tipi cellulari che contribuiscono funzionalmente all'espansione e al rimodellamento del WAT in età adulta. Un enorme ostacolo allo studio delle implicazioni di questa eterogeneità cellulare è l'incapacità di isolare facilmente sottopopolazioni cellulari funzionalmente distinte da WAT SVF per analisi in vitro e in vivo. La tecnologia di sequenziamento a singola cellula ha recentemente identificato sottopopolazioni di cellule perivascolari PDGFRβ+ fibro-infiammatorie e adipogeniche funzionalmente distinte in depositi di WAT intra-addominali di topi adulti. I progenitori fibro-infiammatori (denominati "FIP") sono cellule produttrici di collagene non adipogenico che possono esercitare un fenotipo pro-infiammatorio. Le cellule precursori degli adipociti (APC) PDGFRβ+ sono altamente adipogeniche sia in vitro che in vivo dopo il trapianto di cellule. Qui, descriviamo diversi metodi per l'isolamento di queste sottopopolazioni di cellule stromali da depositi murini di WAT intra-addominali. FIP e APC possono essere isolati mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) o sfruttando la tecnologia delle microsfere immunomagnetiche basate su anticorpi biotinilati. Le cellule isolate possono essere utilizzate per l'analisi molecolare e funzionale. Lo studio delle proprietà funzionali della sottopopolazione di cellule stromali in isolamento amplierà le nostre attuali conoscenze sul rimodellamento del tessuto adiposo in condizioni fisiologiche o patologiche a livello cellulare.

Introduzione

Il tessuto adiposo bianco (WAT) rappresenta il sito principale per l'accumulo di energia nei mammiferi. All'interno di questo tessuto, gli adipociti, o "cellule adipose", immagazzinano le calorie in eccesso sotto forma di trigliceridi, impacchettati in grandi goccioline lipidiche uniloculare. Inoltre, gli adipociti secernono una moltitudine di fattori che regolano vari aspetti dell'omeostasi energetica 1,2,3. Gli adipociti costituiscono la maggior parte del volume di WAT; tuttavia, gli adipociti rappresentano solo meno del 50% del totale delle cellule presenti in WAT 4,5. Il compartimento non adipocitario della WAT, o frazione stromale-vascolare (SVF), è piuttosto eterogeneo e contiene cellule endoteliali vascolari, cellule immunitarie residenti nei tessuti, fibroblasti e popolazioni di cellule precursori degli adipociti (APC).

WAT è eccezionale nella sua notevole capacità di espandersi in termini di dimensioni con l'aumento della domanda di accumulo di energia. Il mantenimento di questa plasticità tissutale è essenziale in quanto un'adeguata conservazione dei lipidi nel WAT protegge dalla deposizione deleteria di lipidi ectopici nei tessuti non adiposi6. Il modo in cui i singoli depositi WAT subiscono questa espansione in risposta all'eccesso calorico è un determinante critico della sensibilità all'insulina nel contesto dell'obesità7. L'espansione patologica del WAT, osservata in individui obesi con sindrome metabolica, è caratterizzata da un'espansione preferenziale dei depositi viscerali di WAT a scapito del tessuto adiposo sottocutaneo metabolicamente favorevole. Inoltre, l'insulino-resistenza nell'obesità è associata al rimodellamento patologico del WAT. Questo è caratterizzato da crescita ipertrofica degli adipociti esistenti (aumento delle dimensioni), angiogenesi inadeguata, infiammazione metabolica cronica, accumulo di componenti della matrice extracellulare (fibrosi) e ipossia tissutale 8,9. Questi fenotipi WAT dell'obesità sono associati alla steatosi epatica e all'insulino-resistenza, in modo simile a quanto osservato nella condizione di lipodistrofia (assenza di WAT funzionale). Al contrario, l'espansione sana del WAT si osserva nella popolazione obesa metabolicamente sana ed è caratterizzata da un'espansione preferenziale del WAT sottocutaneo protettivo e dall'espansione del deposito attraverso l'iperplasia degli adipociti10. Il reclutamento di nuovi adipociti è mediato dalla differenziazione de novo degli adipociti dalle cellule precursori degli adipociti (APC) (definita "adipogenesi"). L'iperplasia degli adipociti coincide con gradi relativamente più bassi di fibrosi WAT e infiammazione metabolica 6,11. Una moltitudine di tipi di cellule all'interno del microambiente WAT influenza direttamente la salute e l'espandibilità del WAT nell'obesità12. Pertanto, la definizione della funzione dei vari tipi di cellule presenti nel WAT rimane una priorità assoluta per il campo.

Nell'ultimo decennio, sono state impiegate diverse strategie per definire e isolare APC native da WAT SVF13 umano e murino. Tali strategie isolano le APC in base all'espressione sulla superficie cellulare di comuni marcatori di cellule mesenchimali/cellule progenitrici utilizzando tecniche di separazione cellulare basate su anticorpi. Questi approcci includono la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS), utilizzando anticorpi marcati con fluorofori o la separazione immunomagnetica delle microsfere (cioè anticorpi chimicamente modificati). Le proteine della superficie cellulare bersaglio per l'isolamento delle APC includono PDGFRα, PDGFRβ, CD34 e SCA-1. Questi approcci hanno contribuito ad arricchire le APC; Tuttavia, le popolazioni cellulari isolate sulla base di questi marcatori sono piuttosto eterogenee. Recentissimi studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) hanno evidenziato l'eterogeneità molecolare e funzionale delle cellule stromali all'interno della frazione stromale-vascolare isolata (SVF) del WAT murino 14,15,16,17. Dalle nostre analisi funzionali e scRNA-seq, abbiamo identificato e caratterizzato sottopopolazioni di cellule perivascolari PDGFRβ+ adipogeniche immunomodulanti e adipogeniche funzionalmente distinte nel compartimento stromale del WAT intra-addominale in topi adulti15. I precursori fibro-infiammatori, o FIP, rappresentano una sottopopolazione importante di cellule PDGFRβ+ e possono essere isolati in base all'espressione di LY6C (cellule LY6C+ PDGFRβ+)15. Le FIP mancano di capacità adipogenica, esercitano una forte risposta pro-infiammatoria a vari stimoli, producono collagene e secernono fattori anti-adipogenici15. L'attività pro-infiammatoria e fibrogenica di queste cellule aumenta in associazione con l'obesità nei topi, implicando queste cellule come regolatori del rimodellamento del WAT. La sottopopolazione LY6C- CD9- PDGFRβ+ rappresenta le cellule precursori degli adipociti (APC). Queste APC sono arricchite nell'espressione di Pparg e di altri geni pro-adipogenici e si differenziano facilmente in adipociti maturi in vitro e in vivo15. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di queste distinte popolazioni cellulari da depositi WAT intra-addominali di topi adulti utilizzando FACS e separazione immunomagnetica delle microsfere con anticorpi biotinilati. Questo protocollo può essere utilizzato per isolare sottopopolazioni progenitrici adipose funzionalmente distinte da più depositi WAT intra-addominali di topi adulti maschi e femmine15. Lo studio di queste popolazioni cellulari funzionalmente distinte in isolamento può contribuire notevolmente alla nostra attuale comprensione dei meccanismi molecolari che regolano l'adipogenesi e il rimodellamento del tessuto adiposo intra-addominale in salute e malattia.

Il protocollo seguente descrive in dettaglio l'isolamento dei progenitori adiposi dal WAT dell'epididimo murino; tuttavia, la stessa procedura può essere utilizzata per isolare le cellule corrispondenti dai depositi WAT mesenterico e retroperitoneale di topi maschi e femmine15. Un protocollo dettagliato su come identificare e isolare questi depositi nei topi può essere trovato in Bagchi et al.18. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso di topi di 6-8 settimane di età. La frequenza e la capacità di differenziazione delle APC possono diminuire in associazione con l'invecchiamento.

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Protocollo

Tutti i protocolli e le procedure per gli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali del Southwestern Medical Center dell'Università del Texas.

1. Isolamento della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo bianco gonadico

  1. Sezionare il tessuto adiposo bianco gonadico da topi di 6-8 settimane e posizionare i cuscinetti adiposi in 1x soluzione PBS.
  2. Combinare fino a 4 depositi di grasso (consigliati 2-4 depositi da 1-2 topi) e tritare il tessuto in un becher da 10 ml contenente 200 μl di tampone di digestione (1x HBSS, 1,5% BSA e 1 mg/mL di collagenasi D).
  3. Trasferire il tessuto macinato in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 10 ml di tampone per la digestione.
  4. Incubare la miscela a 37 °C a bagnomaria per 1 ora agitando.
  5. Filtrare il tessuto digerito attraverso un colino cellulare da 100 μm per rimuovere il tessuto non digerito.
  6. Diluire il campione filtrato a 30 mL con PBS contenente il 2% di FBS e centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante, che contiene adipociti maturi.
  7. Procedere immediatamente al metodo di isolamento cellulare preferito.

2. Isolamento di APC e FIP mediante FACS

  1. Sciogliere il pellet in 1 mL di tampone di lisi 1x RBC agitando delicatamente la provetta.
  2. Incubare a RT per 1-2 min.
  3. Aggiungere 10 mL di FBS/PBS al 2% e passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da centrifuga pulita da 50 mL.
  4. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
  5. Aspirare il terreno e risospendere il pellet in 400-800 μl di FBS/PBS al 2% contenente blocco Fc (1:200).
  6. Incubare a 4 °C per 10 min.
  7. Trasferire 400 μL-800 μL di sospensioni cellulari contenenti ≤106 cellule per mL in provette da 1,5 mL e aggiungere anticorpi. Le concentrazioni di anticorpi sono elencate nella sezione Tabella dei materiali .
    1. Preparare provette di controllo separate per 1) cellule non colorate, 2) controlli a colore singolo e 3) controlli FMO (fluorescenza meno uno).
    2. Colorare i campioni con gli anticorpi PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.
  8. Incubare a 4 °C per 15 min al riparo dalla luce.
  9. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
  10. Aspirare i terreni e risospendere le cellule in 400 μl di FBS/PBS al 2%.
  11. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
  12. Aspirare i terreni e risospendere le cellule in 400-800 μL di FBS/PBS al 2%. Quindi passare attraverso i tappi del filtro da 40 μm in provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL per FACS.
  13. Segui i seguenti passaggi per il gating.
    1. Utilizzare controlli non colorati e monocolore per la compensazione.
    2. Usa i controlli FMO per impostare i gate sperimentali.
    3. Utilizzare la strategia di gating illustrata nella Figura 1 per ottenere APC e FIP. Gate APCs come CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- e FIP come cellule CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ .
  14. Raccogliere le cellule selezionate in provette contenenti 500 μl di siero al 100% e mantenere le cellule in ghiaccio.
  15. Centrifugare le celle a 600 x g per 5 min a 4 °C. Aggiungere il 2% di FBS/PBS per lavare le celle centrifugando nuovamente a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante utilizzando le pile pellettate.
  16. Risospendere le cellule pellettate nel volume appropriato di terreno di coltura APC gonadico (per coltura cellulare) o tampone appropriato per l'analisi successiva.

3. Separazione immunomagnetica delle frazioni adipogeniche e non adipogeniche

  1. Isolare la SVF dal tessuto adiposo bianco gonadico seguendo i passaggi 1.1-1.7.
  2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet SVF in 10 mL di 1x tampone MS disponibile in commercio.
  3. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm.
  4. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
  5. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule pellettate in 100 μl di 1x MS Buffer.
  6. Eseguire la deplezione delle cellule CD31+ e CD45+ come discusso di seguito (Figura 2A, Passaggio 1). Questo viene fatto per rimuovere le cellule del lignaggio endoteliale ed ematopoietico.
    1. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e regolare la concentrazione a ≤ 1 x 108 cellule/mL.
    2. Aggiungere gli anticorpi CD31 e CD45 coniugati con biotina alla sospensione cellulare, ciascuno a una concentrazione di ≤ 0,25 μg per 106 cellule e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
    3. Lavare le celle aggiungendo 4 mL di 1x MS Buffer.
    4. Centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 °C.
    5. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con 100 μL di tampone 1x MS.
    6. Aggiungere 10 μL di nanosfere di streptavidina e incubare le cellule su ghiaccio per 15 minuti.
    7. Lavare le celle aggiungendo 4 mL di tampone 1x MS.
    8. Centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C, quindi aspirare il surnatante.
    9. Risospendere le cellule in 2,5 mL di 1 tampone MS e trasferirle in una provetta in polipropilene da 5 mL.
    10. Posizionare il tubo nella rastrelliera magnetica per 5 minuti.
    11. Raccogliere le cellule non marcate versando la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga pulita da 15 mL.
      NOTA: Evitare di scuotere o asciugare le goccioline pendenti in quanto ciò porta alla contaminazione da frazione cellulare indesiderata.
    12. Rimuovere il tubo dal magnete e ripetere i passaggi 3.6.9. al punto 3.6.11. altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
  7. Separazione delle frazioni adipogeniche e non adipogeniche (Figura 2A, Fase 2)
    1. Continua a lavorare con la frazione non etichettata (cioè la frazione CD45- CD31- ).
    2. Centrifugare la provetta da 15 mL contenente cellule non marcate a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μl di tampone 1x MS.
    4. Aggiungere rispettivamente gli anticorpi LY6C coniugati con biotina e CD9 a una concentrazione di ≤ 0,25 μg per 106 cellule e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
    5. Seguire i passaggi 3.6.3. al punto 3.6.12. per completare la seconda separazione.
    6. Raccogli le frazioni non legate. Le cellule non marcate (LY6C- CD9-) rappresentano la frazione adipogenica contenente APC (Figura 2A, Fase 3).
    7. Rimuovere la provetta dal magnete, risospendere ed eluire le cellule legate in 1x tampone MS. Gli eluati o frazione marcata (LY6C+ CD9+), rappresentano la frazione non adipogenica contenente FIP (Figura 2A, Fase 3).
    8. Centrifugare frazioni marcate e non marcate a 600 x g per 5 minuti in celle a pellet a 4 °C.
  8. Procedere immediatamente alla coltura cellulare (fase 6) o utilizzare precursori indifferenziati per le analisi preferite (fase 4 e/o fase 5).

4. Valutare la purezza delle frazioni adipogeniche e non adipogeniche mediante citometria a flusso

  1. Risospendere frazioni cellulari isolate da microsfere in 200-400 μL di blocco FBS/PBS al 2% contenente Fc (1:200).
  2. Incubare a 4 °C per 10 min.
  3. Trasferire la sospensione cellulare in provette da 1,5 mL e aggiungere gli anticorpi. Le concentrazioni di anticorpi sono elencate nella Tabella dei materiali.
    1. Preparare provette di controllo separate per 1) cellule non colorate, 2) controlli a colore singolo e 3) controlli FMO.
    2. Ai campioni, aggiungere gli anticorpi CD45, CD31, CD9 e LY6C.
  4. Incubare a 4 °C per 15 min al riparo dalla luce.
  5. Centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
  6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 400 μL di FBS/PBS al 2%.
  7. Centrifugare la sospensione a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
  8. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 400-800 μL di FBS/PBS al 2%. Filtrare attraverso tappi filtranti da 40 μm in provette a fondo tondo in polistirene da 5 mL per l'analisi mediante citometria a flusso.
  9. Analisi di citometria a flusso per valutare la purezza
    1. Utilizzare controlli non colorati e monocolore per la compensazione.
    2. Usa i controlli FMO per impostare i gate sperimentali.
    3. Utilizzare la strategia di gating per celle vive e singole come mostrato nella Figura 2B.
    4. Eseguire il gating come mostrato nella Figura 2B per CD45, CD31, LY6C e CD9.
    5. Utilizzare il software di citometria a flusso per valutare le frequenze delle cellule CD45, CD31, LY6C, CD9 (APC) e delle cellule CD45, CD31, LY6C+ (FIP) all'interno di frazioni isolate.

5. Analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa per valutare la purezza di FIP e APC

  1. Estrarre l'mRNA da cellule isolate magneticamente o FACS utilizzando il kit di estrazione disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
  2. Utilizzare 1 μg di RNA per sintetizzare il cDNA utilizzando un kit per la trascrittasi inversa del cDNA (vedere la Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Determinare i livelli relativi di mRNA dei geni selettivi per APC e FIP (Tabella 1) mediante PCR quantitativa utilizzando il master mix SYBR green PCR.
    1. Impostare la reazione del campione per la PCR come segue: 5 μL di 2x colorante verde SYBR, 1 μL di cDNA (~50 ng/μL), 0,5 μL di ciascun primer diretto e inverso (10 μM) e 3 μL di acqua.
    2. Utilizzare le seguenti condizioni standard di PCR per l'esecuzione quantitativa della PCR: fase di mantenimento: 50 °C per 2 min, 95 °C per 10 min; Fase PCR (40 cicli): 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min.
  4. Normalizzare i valori ai livelli del gene house-keeping (Rps18) calcolando ΔΔ-Ct.
  5. Per valutare la significatività statistica, eseguire il test t di Student non accoppiato.

6. Colture cellulari e differenziamento

  1. Centrifugare magneticamente o celle isolate FACS a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
  2. Risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura APC gonadico e piastra 40K cellule/pozzetto da ciascuna frazione in una piastra di coltura a 48 pozzetti.
  3. Sostituire il supporto ogni 1-2 giorni. Le APC inizieranno a differenziarsi in adipociti man mano che si avvicinano alla confluenza. Le FIP mantenute nello stesso terreno sono resistenti all'adipogenesi.

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Risultati

Questo protocollo descrive due strategie che consentono l'isolamento di popolazioni di cellule stromali distinte da depositi WAT intra-addominali di topi adulti. Le APC e le FIP possono essere isolate mediante FACS (Figura 1) o separazione immunomagnetica delle microsfere con anticorpi biotinilati (Figura 2). Entrambi gli approcci utilizzano reagenti e anticorpi tutti disponibili in commercio. La separazione immunomagnetica delle microsfere porta alla separazion...

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Discussione

Il ceppo di topi C57BL/6 è il ceppo di topo più utilizzato negli studi sull'obesità indotta dalla dieta. I topi C57BL/6 aumentano rapidamente di peso quando vengono sottoposti a una dieta ricca di grassi (HFD) e sviluppano alcune delle caratteristiche principali della sindrome metabolica associata all'obesità (ad esempio, insulino-resistenza e iperlipidemia). In particolare, l'espansione del WAT che si verifica in associazione con l'alimentazione con dieta ricca di grassi (HFD) si verifica in modo specifico del depos...

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Divulgazioni

T.A.P. è un dipendente e azionista di Novo Nordisk A/S

Riconoscimenti

Gli autori sono grati a Lisa Hansen e Kirsten Vestergaard per l'eccellente assistenza tecnica, e a P. Scherer, N. Joffin e C. Crewe per la lettura critica del manoscritto. Gli autori ringraziano l'UTSW Flow Cytometry Core per l'eccellente guida e assistenza nello sviluppo dei protocolli qui descritti. R.K.G. è supportato da NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 e NIDDK R01 DK119163. J.P. è sponsorizzato da un premio pre-dottorato del Fondo per l'innovazione della Danimarca.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainersFisher Scientific352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)Fisher Scientific21040CV
5ml polypropylene tubesFisher Scientific352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSSSigmaH8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)Roche11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)Fisher ScientificBP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)BioLegend480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)BioLegend480019
100 µL MojoSort Streptavidin NanobeadsBioLegend480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis BuffereBioscience00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)eBioscience553141
Antibodies
Biotin CD45BioLegend103103Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: 30-F11
Biotin CD31BioLegend102503Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MEC13.3
Biotin CD9BioLegend124803Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MZ3
Biotin LY6CBioLegend128003Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5BioLegend102419Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5BioLegend103131Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PEBioLegend136006Concentration: Dilution 1:50
Species: Mouse
Clone: APB5
LY6C-APCBioLegend128016Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD9-FITCBioLegend124808Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucoseCorning10-014-CV
192 mL MCDB201SigmaM6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024Sigma12303C
5 mL 100% ITS premixBD Bioscience354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphateSigmaA8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basicR&D systems3139-FB-025/CF
5 mL Pen/StrepCorning30-001-CI
500 µL GentamycinGibco15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.

Riferimenti

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