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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull'agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Abstract

Il sequenziamento transposon (Tn-seq) è un metodo potente che combina la mutagenesi trasposone e il sequenziamento parallelo massiccio per identificare geni e percorsi che contribuiscono alla forma fisica batterica in una vasta gamma di condizioni ambientali. Le applicazioni Tn-seq sono estese e hanno anche permesso l'esame delle relazioni genotipo-fenotipo a livello di organismo, ma anche a livello di popolazione, comunità e sistemi. I batteri Gram-negativi sono altamente associati ai fenotipi di resistenza agli antimicrobici, che ha aumentato gli incidenti di insufficienza di trattamento antibiotico. La resistenza agli antimicrobici è definita come crescita batterica in presenza di antibiotici altrimenti letali. La colistina antimicrobica "ultima linea" viene utilizzata per trattare le infezioni batteriche Gram-negative. Tuttavia, diversi patogeni Gram-negativi, tra cui Acinetobacter baumannii possono sviluppare resistenza alla colistina attraverso una serie di meccanismi molecolari, alcuni dei quali sono stati caratterizzati utilizzando Tn-seq. Inoltre, le vie di trasduzione del segnale che regolano la resistenza alla colistina variano all'interno dei batteri Gram-negativi. Qui proponiamo un metodo efficiente di mutagenesi trasposone in A. baumannii che semplifica la generazione di una libreria di inserimento trasposone e la costruzione di librerie amplicon saturando eliminando la necessità di enzimi di restrizione, ligazione dell'adattatore e purificazione del gel. I metodi qui descritti consentiranno un'analisi approfondita dei determinanti molecolari che contribuiscono alla forma fisica di A. baumannii quando sono stati sfidati con la colistina. Il protocollo è applicabile anche ad altri patogeni ESKAPE Gram-negativi, che sono principalmente associati a infezioni ospedaliere farmacoresistenti.

Introduzione

La scoperta di antibiotici è senza dubbio uno degli eventi più impattanti legati alla salute delXX secolo. Non solo gli antibiotici risolvono rapidamente le infezioni batteriche gravi, ma svolgono anche un ruolo fondamentale nella medicina moderna. Grandi interventi chirurgici, trapianti e progressi nella medicina neonatale e nella chemioterapia lasciano i pazienti suscettibili a infezioni potenzialmente letali e queste terapie non sarebbero possibili senza antibiotici1,2. Tuttavia, il rapido sviluppo e la diffusione della resistenza agli antibiotici tra i patogeni umani ha ridotto significativamente l'efficacia di tutte le classi clinicamente importanti di antibiotici3. Molte infezioni batteriche che una volta erano facilmente cancellate con il trattamento antibiotico, non rispondono più ai protocolli di trattamento classici, causando una grave minaccia per la salute pubblicaglobale 1. La resistenza agli antimicrobici (AMR) è il luogo in cui le cellule batteriche crescono in concentrazioni altrimenti letali di antibiotici, indipendentemente dalla duratadel trattamento 4,5. È urgente comprendere i fattori molecolari e biochimici che regolano la resistenza antimicrobica, che aiuteranno a guidare lo sviluppo antimicrobico alternativo. In particolare, gli agenti patogeni ESKAPE sono problematici in ambienti clinici e associati a un'estesa AMR. Questi includono Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. Mentre diversi meccanismi contribuiscono alla AMR negli agenti patogeni ESKAPE, questi ultimi quattro organismi sono Gram-negativi.

I batteri Gram-negativi assemblano una membrana esterna che li protegge da condizioni ambientali avverse. La membrana esterna serve come barriera permeabile per limitare l'ingresso di molecole tossiche, come gli antibiotici, nella cellula. A differenza di altre membrane biologiche, la membrana esterna è asimmetrica. Il foglietto illustrativo esterno è arricchito con lipopolysaccharide esposto in superficie, mentre il volantino interno è una miscela di fosfopididi6. Le molecole di lipopolysaccharide sono ancorate alla membrana esterna da un lipidico conservato A moiety incorporato all'interno del bistratolipidico 7. Il lipide canonico Un dominio di Escherichia coli lipopolysaccharide è necessario per la crescita della maggior parte dei batteri Gram-negativi ed è sintetizzato da un percorso ezimatico in nove passaggi che è uno dei percorsi più fondamentali e conservati negli organismi Gram-negativi6,7,8.

Le polimixine sono peptidi antimicrobici cationici che prendono di mira il lipidico Un dominio di lipopolysaccharide per perturbare la membrana esterna e lyse la cellula. L'interazione elettrostatica tra residui caricati positivamente di polimixine e i gruppi di lipidi A caricati negativamente interrompe la membrana cellulare batterica portando infine alla mortecellulare 9,10,11,12,13. La colistina (polimixine E) è un antimicrobico di ultima istanza utilizzato per trattare le infezioni causate da patogeni nosocomiali Gram-negativi multifarmaci, come Acinetobacter baumannii14,15,16. Scoperte per la prima volta nel 1947, le polimixine sono prodotte dai batteri del suolo, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polimixine sono stati prescritti per trattare le infezioni Gram-negative per anni prima che il loro uso clinico è stato limitato a causa di segnalazioni di nefrro- e neurotossicitàsignificativa 20,21.

A. baumannii è un patogeno nosocomiale Gram-negativo che ha aumentato drasticamente la morbilità e la mortalità degli esiti dei pazienti negli ultimidecenni 22. Quello che una volta era considerato un agente patogeno a bassa minaccia, ora rappresenta un rischio significativo per l'infezione ospedaliera in tutto il mondo a causa della sua incredibile capacità di acquisire la RSI edell'alto rischio di epidemia 23,24. A. baumannii rappresenta più del 10% delle infezioni nosocomiali negli Stati Uniti. La malattia si manifesta come polmonite, batteriemia, infezioni delle vie urinarie, infezioni della pelle e dei tessuti molli, meningite ed endocardite25. Le opzioni di trattamento per le infezioni da A. baumannii sono diminuite a causa della resistenza contro quasi tutte le classi antibiotiche, tra cui β-lactams, fluoroquinolones, tetracycline e aminoglicosides23,24. La prevalenza di isolati A. baumannii, resistenti alla droga e antifarmacorta, ha portato a una rinascita del trattamento della colistina, che si è ritenuto essere una delle poche opzioni terapeutiche rimaste ancora efficaci contro la resistenza multifarmaco A. baumannii. Tuttavia, una maggiore resistenza alla colistina tra gli isolati di A. baumannii ha ulteriormente amplificato la sua minaccia per la salute pubblica globale10,11,12,13,27,30,31.

I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, come il sequenziamento dei traspositori (Tn-seq), hanno fornito importanti strumenti per far progredire la nostra comprensione della forma fisica batterica in vitro e in vivo. Tn-seq è un potente strumento che può essere sfruttato per studiare le interazioni genotipo-fenotipo nei batteri. Tn-seq è ampiamente applicabile tra i patogeni batterici, dove combina la mutagenesi tradizionale trasposone con il sequenziamento parallelo massiccio per mappare rapidamente i siti di inserimento, che possono essere utilizzati per collegare le mutazioni del DNA alle varianti fenotipico su una scalagenomica 32,33,34,35. Mentre i metodi di mutagenesi trasposone sono stati descritti in precedenza, i passaggi generali sono simili33. In primo luogo, viene generata una libreria di inserimento utilizzando la mutagenesi trasposone, in cui ogni cellula batterica all'interno di una popolazione è limitata a un singolo inserimento di trasposone all'interno del DNA genomico (gDNA). Dopo la mutagenesi, i singoli mutanti sono in comune. gDNA viene estratto dal pool mutante di inserimento e le giunzioni trasposone vengono amplificate e sottoposte a sequenziamento ad alta velocità effettiva. Le letture rappresentano siti di inserimento, che possono essere mappati al genoma. Gli inserimenti di transposon che riducono la forma fisica cadono rapidamente dalla popolazione, mentre gli inserimenti benefici sono arricchiti. Tn-seq è stato strumentale per far progredire la nostra comprensione di come i geni influiscono sulla forma fisica batterica nello stress33.

Il sistema di transposon di mariner Himar1 codificato in pJNW684 è stato specificamente costruito e ottimizzato ai fini della mutagenesi trasposone. Esso comprende marinerun transposon marinaio-famiglia che affianca il gene della resistenza kanamycin, che viene utilizzato per la selezione di mutanti di inserimento transposon in A. baumannii. Codifica anche un promotore specifico di A. baumannii che guida l'espressione del gene di codifica trasposizione36. Il transposon a base di marinaiocontiene anche due terminatori trasmizionali a valle del gene di resistenza kanamycin, che impedisce la lettura a valle dell'inserimento37. pJNW684 porta anche un'origine RP4/oriT/oriR6K-condizionale della replica che richiede che il gene λpir contribuito dal ceppo donatore si replica38. In assenza del gene λpir, il vettore pJNW684 che trasporta il macchinario di trasposizione non sarà in grado di replicare nel ceppo del destinatario A. baumannii 10,36,38. Pertanto, durante la coniugazione batterica, solo il trasposone viene inserito nel genoma ricevente senza inserimento in background del plasmide, che trasporta il gene trasposizione. Questo è significativo perché la perdita di attività di trasposizione insieme al plasmide si traduce in un singolo evento di trasposizione stabile che impedisce al trasposone di spostarsi in luoghi diversi una volta che si inserisce nel genoma del destinatario.

pJNW648 è stato anche testato per l'attività in un altro organismo Gram-negativo, E. coli. Il successo dell'assemblaggio di una libreria Tn-seq saturante nel ceppo E. coli W3110 ha indicato che il sistema è suscettibile di eseguire la mutagenesi in un'ampia gamma di agenti patogeni, tra cui Enterobacteriaceae. Inoltre, il promotore specifico di A. baumannii che guida l'espressione trasposizione può essere rapidamente scambiato con un promotore specifico della specie. Infine, il gene di resistenza al kanamycin può essere scambiato con altre cassette di resistenza, a seconda del fenotipo AMR dell'organismo in fase di studio.

Un fattore che contribuisce alla resistenza alla colistina in A. baumannii è la somministrazione di dosi insufficienti, dove i batteri sono esposti a pressioni selettive a livelli nonletali 39. Diversi rapporti hanno mostrato che le concentrazioni di antimicrobici subinibito possono indurre risposte regolamentate che alterano la fisiologia cellulare per ridurre la suscettibilità dell'intera popolazionebatterica 11,12,30,31. Utilizzando Tn-seq, abbiamo scoperto fattori che regolano la resistenza alla colistina nel ceppo A. baumannii ATCC 17978 dopo l'esposizione a concentrazioni inibitorie10 e subinibitory di colistina. In questo esempio viene illustrato come utilizzare un metodo Tn-seq che semplifica la costruzione e l'arricchimento di una libreria mutante trasposone satura utilizzando lafamiglia di trasposoni40,41. Mentre diversi protocolli Tn-seq generano 20.000 - 100.000 mutanti35,42,43,44,45,46, il protocollo descritto qui può generare rapidamente una libreria transposon di 400.000 mutanti, che equivale approssimativamente a un transposon ogni inserimento di coppie di 10 basi in A. baumanni10., Inoltre, le dimensioni della libreria possono essere scalate senza uno sforzo aggiuntivo significativo. Questo metodo elimina anche la necessità di endonucleasi di restrizione, legatura dell'adattatore e purificazione del gel, che può ridurre la diversità finale della libreria.

Protocollo

1. Preparazione del ceppo batterico

  1. Streak il ceppo"donatore" ( E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabella dei Materiali) per colonie isolate sull'agar Luria-Bertani integrato con acido diaminopimelico 600 M (DAP), 100 mg/L di ampicillina e 25 mg/L di kanamycin. Incubate durante la notte a 37 gradi centigradi. Utilizzando una singola colonia isolata, inoculare 50 mL di brodo di Luria (LB) integrato con 600 DAP, 100 mg/L di ampicillina e 25 mg/L di kanamycin in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL ed etichettarlo come "donatore".
  2. Streak il ceppo "destinatario" (A. baumannii ceppo ATCC 17978, Tabella dei Materiali) per colonie isolate su Luria-Bertani agar. Incubate durante la notte a 37 gradi centigradi. Utilizzando una singola colonia isolata, inoculare 50 mL di LB in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL ed etichettarla come "destinatario".
  3. Incubare entrambe le colture ("donatore" e "destinatario") durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione.

2. Accoppiamento batterico

  1. Trasferire le colture notturne a tubi conici da 50 mL.
  2. Pellet sia le colture ricevente che il donatore utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  3. Scartare il supernatante e risundere il pellet di ceppo "donatore" in 35 mL di LB integrato con DAP per lavare via gli antibiotici residui.
  4. Pellet le cellule di ceppo "donatore" utilizzando centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  5. Scartare il supernatant e risuspendere il pellet di ceppo "donatore" in 4,5 mL di LB integrato con DAP. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 mL.
  6. Trasferire il ceppo "donatore" rispeso nel tubo di deformazione "destinatario", che contiene le cellule "destinatarie" pellet. Utilizzare la stessa pipetta sierologica da 10 mL del passaggio 2.5 per mescolare le culture. Passare immediatamente al passaggio successivo.
    NOTA: Il volume totale della sospensione finale deve essere di 5 mL.
  7. Distribuire la sospensione di accoppiamento come singole goccioline da 100 L su piastre di agar L integrate con DAP (5-7 goccioline per piastra)(Figura 1A).
  8. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 min.
  9. Senza disturbare le goccioline, trasferire con cura le piastre in un'incubatrice di 37 gradi centigradi e consentire alle colture di accoppiarsi per 1 h.
    NOTA: periodi di incubazione superiori a 1 h rischiano la generazione di mutanti sorella.
  10. Dopo l'incubazione, aggiungere 1,5 mL di LB su ogni piatto e raccogliere riempendo i batteri dalle piastre. Utilizzare una micropipetta da 1 mL per la resussione. Il volume finale dovrebbe essere di circa 12 - 15 mL.
  11. Unire le cellule raccolte in un tubo conico da 50 mL.
  12. Pellet le cellule accoppiate utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  13. Scartare le cellule supernata e di riespetta in 50 mL di LB per rimuovere il DAP residuo.
  14. Pellet l'accoppiamento con centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  15. Ripetere il passo di lavaggio (passaggi 2.13 e 2.14).
  16. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, risundere il pellet in 10 mL di LB integrato con 25% glicerolo.
  17. Utilizzando le cellule lavate, effettuare cinque diluizioni seriali in brodo LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Stendere 100 L di ogni diluizione su 4 piastre diverse utilizzando perline di vetro sterili: agar Luria-Bertani integrato con kanamycin, agar integrato con ampicillina, agar integrato con DAP e agar solo.
  19. Piastre incubate a 37 gradi centigradi durante la notte.
  20. Aliquot l'accoppiamento rimanente in 1 mL aliquots e conservare a -80 gradi centigradi.

3. Determinare l'appropriata diluizione della libreria di trasposizioni

  1. Registrare le unità di formazione delle colonie (CFU) dalle piastre notturne.
  2. Immagine di una piastra con colonie countable per ogni diversa condizione di piastra (Figura 2A).
    NOTA: entrambi i ceppi "donatore" e "destinatario" dovrebbero crescere su piastre di agar integrate con DAP, quindi la maggior parte delle diluizioni placcate produrrà un prato. Solo il ceppo "destinatario" può crescere su piastre di agar. Né il ceppo "donatore" né il ceppo "destinatario" possono crescere su piastre di agar integrate con ampicillina, quindi non dovrebbe esserci una crescita minima. Solo le cellule di deformazione bersaglio che codificano l'inserimento del trasposone possono crescere su piastre di agar integrate con kanamycin. Le colonie dovrebbero variare di dimensioni, indicando inserimenti di traspositori nei geni che contribuiscono alla forma fisica sull'agar integrato con kanamycin.
  3. Calcolare il numero di mutanti transposon nell'accoppiamento congelato contando il numero di colonie su piastre di agar LB integrate con kanamycin.
    NOTA: Per il genoma di A. baumannii (circa 4 Mbps), l'obiettivo era quello di ottenere circa 400.000 colonie al fine di generare una libreria mutante ad alta risoluzione (circa un inserimento trasposone/10 coppie di basi). Tuttavia, questo numero dovrebbe essere ottimizzato in base alle dimensioni del genoma della specie bersaglio).

4. Generazione di ultima libreria di mutanti batterici

  1. Scongelare un aliquot dell'accoppiamento congelato sul ghiaccio.
  2. Accoppiamento della piastra su piastre Agar Luria-Bertani da 150 mm integrate con kanamycin sulla base di CDU calcolate al punto 3.1. Regolare il volume con LB per produrre 13.333 colonie per 150 L prima della placcatura.
    NOTA: Il conteggio CFU qui è stato determinato per essere circa 105 CFU / mL, quindi il volume di accoppiamento è stato regolato per ottenere 13.333 colonie per piastra in quanto questo fornirebbe un numero ottimale di colonie su 30 piastre per una libreria mutante ad alta risoluzione senza sovraffollare le piastre.
  3. Utilizzare perline di vetro sterili per spalmare 150 L della diluizione per piastra su piastre di agar Luria-Bertani da 150 mm integrate con kanamycin per ottenere 400.000 colonie(Figura 1C).
    NOTA: Le aste sterili o qualsiasi tipo di strumento sterile (ad esempio, perline di vetro) possono essere utilizzate per diffondere i batteri sulle piastre.
  4. Smaltire il tubo usato contenente l'accoppiamento in eccesso.
    NOTA: i cicli di congelamento/disgelo aggiungono pressioni selettive sulla coltura batterica, che possono inclinare i risultati dell'esperimento Tn-seq. Utilizzare un aliquot fresco ogni volta.
  5. Piastre incubate a 37 gradi centigradi per 14 h.
    NOTA: Il tempo di incubazione è ottimizzato per prevenire la crescita esremina (colonie che toccano). Si consiglia di ridurre al minimo la crescita riducendo i tempi di incubazione.

5. Stima della densità della libreria e del pooling per lo storage

  1. Contare CFUs su ogni piastra per stimare i mutanti totali nella libreria transposon. Contare il 20% di almeno 3 piastre per determinare la stima del conteggio delle colonie per l'intero gruppo di piastre(Figura 2A). Assicurati che le colonie non tocchino un'altra colonia.
  2. Dopo aver calcolato la resa stimata della colonia, aggiungere 3-5 mL di LB (o più se necessario) a ogni piastra e raschiare i batteri utilizzando uno strumento sterile di raschiare.
    NOTA: Per raschiare in modo efficiente le piastre sono stati utilizzati anelli sterili.
  3. Piscina sospensioni batteriche da tutte le piastre in tubi conici da 50 mL(Figura 1D). Questo richiederà più tubi conici da 50 mL, almeno 3.
  4. Pellet ha in poolato le sospensioni batteriche utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g per 7 min.
  5. Scartare il pellet supernatant e resuspend in 5 mL di LB integrato con 30% glicerolo.
  6. Aliquot 1 mL della biblioteca dei traspositori in criovials e conservare a -80 gradi centigradi.

6. Identificazione dei fattori che regolano la resistenza alla colistina in A. baumannii

  1. Preparare flaconi Erlenmeyer da 4 x 250 mL con ciascuno contenente brodo l'LB da 50 mL ed etichetta come (Figura 2B)
    1. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (-) colistin_1
    2. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (-) colistin_2
    3. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (e) colistin_1
    4. A. baumannii ceppo ATCC 17978 libreria Tn-seq; (e) colistin_2
      NOTA: nella crescita della sfida descritta di seguito, ogni condizione, (-) il controllo della colistina e la sfida della colistina (-) vengono testate in duplicato. Pertanto, l'installazione richiede 4 x 250 mL flaconi Erlenmeyer, due per condizione.
  2. Aggiungere 50 L di 0,5 mg/L di colistina a flaconi di colistina (6.1.3 e 6.1.4) e 50 lL acqua a (-) flaconi di colistina (6.1.1 e 6.1.2).
  3. Scongelare una libreria Tn-seq congelata al passo 5 sul ghiaccio.
  4. Pipette 1 L della libreria scongelata in 1 mL di PBS.
  5. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600)e moltiplicare per 1.000.
    NOTA: questo determina OD600 di 1 L della libreria Tn.
  6. Sulla base del calcolo al punto 6.5, inoculare ogni fiaschetta contenente 50 mL LB ad un ODfinale 600 0.001.
  7. Coltivare le colture in un'incubatrice tremante a 37 gradi centigradi aOD 600 0,5.
    NOTA: È importante che le culture rimangano in fase di crescita logaritmica, quindi se il tuo ceppo si trova in un OD600 diverso durante la crescita esponenziale, l'OD600 deve essere regolato per garantire che la coltura si replica il maggior numero di volte possibile all'interno della fase di crescita logaritmica. Se la coltura si replica solo 3 volte, il potere di rilevare i difetti di fitness nei mutanti è limitato a differenze di 3 volte, in teoria. Poiché diversi batteri hanno tempi di raddoppio diversi, è importante seminare le colture a un ODfisso 600 per normalizzare l'inoculum iniziale. Ciò garantisce una rappresentazione coerente dell'intera libreria in tutte le impostazioni cultura.
  8. Raccogliere le colture utilizzando la centrifugazione a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 7 min.
  9. Rimuovere il supernatant e lavare con 50 mL di PBS.
  10. Pellet con centrifugazione a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 7 min.
  11. Rimuovere il supernante e risuspendere il pellet in 1 mL di PBS. Aliquot - 200 l in 5 tubi microcentrifuge.
  12. Pellet con centrifugazione a 5.000 x g a 4 gradi centigradi per 5 min. Rimuovere tutto il supernatant utilizzando una punta pipette.
  13. Conservare i pellet a -20 gradi centigradi o procedere con l'estrazione gDNA.

7. estrazione gDNA

  1. Scongelare un pellet cellulare sul ghiaccio.
  2. Aggiungere il buffer lysis da 0,6 mL (Tabella deimateriali ) e il vortice per risundere completamente il pellet.
  3. Incubate a 37 gradi centigradi per 1 h.
  4. Aggiungere 0,6 mL di alcole fenolo/cloroformio/isoatile al campione e vortice vigorosamente.
  5. Fasi separate utilizzando la centrifugazione in un microcentrifuge alla velocità massima a temperatura ambiente per 5 min.
  6. Trasferire la fase aques superiore in un nuovo tubo. Evitare di disturbare l'interfaccia di fase durante il trasferimento.
  7. Aggiungere un volume uguale di cloroformio alla fase aques ottenuta sopra e vortice vigorosamente.
  8. Fasi separate utilizzando la centrifugazione in microcentrifuge alla velocità massima a temperatura ambiente per 5 min.
  9. Trasferire la fase aques superiore in un nuovo tubo.
    NOTA: Assicurarsi di evitare di disturbare l'interfaccia durante il trasferimento.
  10. Aggiungere 2,5 volte il volume di fase aque di freddo 100 % di etanolo e mescolare delicatamente. Il DNA precipitato sarà visibile.
  11. Posizionare il tubo a -80 gradi centigradi per almeno 1 h.
  12. Pellet DNA utilizzando centrifugazione a velocità massima a 4 gradi centigradi per 30 min.
  13. Rimuovere con cura il supernatant senza disturbare il pellet del DNA e lavare con 150 L del 70 % di etanolo mediante pipettaggio.
  14. Pellet DNA utilizzando centrifugazione a velocità massima a 4 gradi centigradi per 2 min.
  15. Rimuovere con attenzione il supernatant.
  16. Ripetere il passaggio 7.14 una volta. Rimuovere con attenzione tutto l'etanolo rimanente.
  17. DNA secco incubando a temperatura ambiente stanza per 5-10 min.
  18. Riespettire il pellet di DNA in un buffer TE da 100 L tramite pipettatura.

8. taglio del DNA (Figura 3A)

  1. Diluire il gDNA con cuscinetto TE ad una concentrazione di 250 ng/mL in un volume totale di 200 L.
  2. Mettere i tubi in un sonicatore bagno d'acqua.
  3. DNA sonicato per produrre frammenti di circa 300 nucleotidi. Potenza: 60 %, Tempo totale: 20 min, Cicli: 10 s ON e 10 s OFF a 4 gradicentigradi (Figura 3A).
  4. Verificare che il DNA sia stato tosato in modo appropriato separando 10 L di DNA non sereno e 10 L di DNA tosato su un gel di agarose dell'1%. Ripetere l'ottimizzazione o ottimizzarlo in base alle esigenze (Figura 3B).

9. Aggiunta della coda poli-C alla fine 3'(Figura 3A)

  1. Impostare la reazione poli-C secondo la tabella 1.
  2. Reazione incubante a 37 gradi centigradi per 1 h.
  3. Purificare la reazione poli-C con 40 L di perline paramagnetiche di selezione delle dimensioni (Figura 3A) seguendo la procedura riportata di seguito.
    1. Aggiungere 40 L di perline paramagnetiche di selezione delle dimensioni a ciascun campione. Vortex - 5 s o pipette su e giù.
    2. Incubare campioni a temperatura ambiente per 5 min.
    3. In breve, i tubi di centrifuga per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo (2 s).
    4. Trasferire i tubi su un rack magnetico e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    5. Con i tubi su rack magnetico, rimuovere con attenzione il supernatant.
    6. Con i tubi su rack magnetico, aggiungere 200 L di etanolo appena preparato 80% (non disturbare perline).
    7. Incubare campioni per almeno 30 s fino a quando la soluzione è chiara.
    8. Con i tubi su rack magnetico, rimuovere con attenzione il supernatant.
    9. Ripetere il passaggio di lavaggio (passaggi da 9.3.6 a 9.3.8).
    10. Raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo utilizzando un breve passo di centrifugazione (2 s).
    11. Trasferire i tubi sul rack magnetico e rimuovere il liquido rimanente.
    12. Incubare a temperatura ambiente per 2-5 min per asciugare i campioni. Non asciugare troppo.
    13. Rimuovere i tubi dal rack magnetico e aggiungere 25 L di acqua a ciascuno. Vortice per 5 s o pipetta su e giù.
    14. In breve, i tubi di centrifuga per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo (2 s).
    15. Trasferire i tubi sul rack magnetico e lasciare riposare per 2 minuti fino a quando la soluzione non è chiara.
    16. Con i tubi sul rack magnetico, rimuovere il liquido senza disturbare le perline e il trasferimento in un nuovo tubo (23 dollari di DNA).

10. Amplificazione della giunzione transposon (Figura 3A)

  1. Configurare PCR 1 come descritto nella tabella 1 per la prima PCR nidificata (Tabella 2).
  2. Eseguire la PCR 1 utilizzando le condizioni descritte nella tabella 1.
  3. Purificare i prodotti PCR con 40 L di perline paramagnetiche a selezione delle dimensioni (passaggi 9.3.1 – 9.3-12). Elute in 50 L di acqua (punti 9.3.13 – 9.3.16). A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi.
  4. Preparare perline paramagnetiche accoppiate a Streptavidin:
    1. Rispendere le perline Streptavidin agitando vigorosamente.
    2. Aggiungere 32 L di perline per campione a un tubo di microcentrifuge fresco.
      NOTA: Le perline per i campioni 6 possono essere preparate in un unico tubo.
    3. Trasferire il tubo su un rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    4. Con tubo su rack magnetico, rimuovere supernante.
    5. Rimuovere il tubo dal rack magnetico. Lavare le perline riempending in 1 mL 1x B&W buffer pipetting su e giù.
    6. Trasferire il tubo su rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    7. Con il tubo su rack magnetico, rimuovere il supernatant.
    8. Ripetere il passaggio di lavaggio con 1 mL 1x buffer B&W (passaggi 10.4.5 – 10.4.7) altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
    9. Rimuovere il tubo dal rack magnetico e rissovespendere le perline in 52 L di buffer B&W 2x per campione.
  5. Unire 50 L delle perline preparate con 50 L di PCR1 purificato (dal punto 10.3). Pipetta da mescolare.
  6. Ruotare a temperatura ambiente per 30 min.
  7. Lavare via il DNA non legato:
    1. In breve, centrifuga per raccogliere il liquido nella parte inferiore del tubo (2 s).
    2. Trasferire il tubo su rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    3. Con il tubo su rack magnetico, rimuovere il supernatant.
    4. Rimuovere il tubo dal rack magnetico, lavare le perline rievocando in buffer B&W 1x 100 e pipettando su e giù.
    5. Trasferire il tubo su rack magnetico. Incubare per 2 minuti fino a quando la soluzione è chiara.
    6. Con tubo su rack magnetico, rimuovere supernante.
    7. Ripetere i passaggi di lavaggio con 100 L LoTE (passaggi da 10.7.4 a 10.7.6) altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
  8. Impostare PCR 2 come descritto nella tabella 1 per amplificare le giunzioni di trasposizione e aggiungere un singolo codice a barre a ciascun campione(tabella 2 e tabella 3).
  9. Eseguire la PCR 2 utilizzando le condizioni descritte nella tabella 1.
  10. Purificare con 40 L di perline paramagnetiche di selezione delle dimensioni (punti 9.3.1 – 9.3.12). Elute in 17 l di acqua (passi 9.3.13 – 9.3.16), raccogliere 15 L.
  11. Quantificare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorometro. Le concentrazioni finali devono essere da 50 a 250 ng/l.
  12. Valutare la qualità del DNA utilizzando l'elettroforesi capillare a base di chip (Figura 4A).

Risultati

I metodi descritti descrivono la generazione di una libreria di transposon ad alta densità nel ceppo A. baumannii ATCC 17978 attraverso la coniugazione batterica utilizzando E. coli MFD DAP-, che replica il plasmide pJNW684 (Figura 4B). Il protocollo dettagliato utilizza la coniugazione batterica bi-parentale per il trasferimento di pJNW684 dal ceppo del donatore E. coli λpir- donatore al ceppo del ricevente A. baumannii. Si tratta ...

Discussione

A. baumannii è una minaccia emergente per la salute pubblica globale a causa della rapida acquisizione di AMR contro terapie "di ultima linea", come colistina10,11,12,23,24,30,31. Negli ultimi decenni, Tn-seq ha svolto un ruolo fondamentale nel chiarire le interazioni genotipo-feno...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institute of Health (Grant AI146829 a J.M.B.) ed è riconosciuto con gratitudine.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-TriphosphateAffymetrix77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-TriphosphateInvitrogen10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight MarkerPromegaPR-G2101
100mm x 15mm Petri DishesCorning351029
150mm x 15mm Petri DishesCorning351058
1X B&WN/AN/ADilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acidAlfa AesarB2239103used at 600 µM
2X B&WN/AN/AAdd 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTPN/AN/A9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA PolymeraseInvitrogen12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978ATCCN/AAmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)Fisher ScientificBP1760used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification systemBECKMAN COULTERA63881
BioAnalyzerAgilentG2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA AnalysisAgilent5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)New England Biolabs (NEB)N0447L
DynaMag-2 Magnetic rackInvitrogen12321D
E.coli MFD Dap-N/AN/ADAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
EthanolFisher ScientificA4094
Externally Threaded Cryogenic VialsCorning09-761-71
Glass beadsCorning72684
GlycerolFisher ScientificG33
Inoculating loopsFisher Scientific22-363-602Scraping tool
KanamycinFisher ScientificBP906used at 25 mg/L
LB agar, MillerFisher ScientificBP1425
LB broth, MillerFisher ScientificBP1426
LoTEN/AN/AAdd 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis bufferN/AN/A9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)Fisher ScientificBP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X SolutionFisher ScientificBP39920Diluted to 1X
Qubit 4 FluorometerThermo FisherQ33238
Qubit Assay TubesThermo FisherQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FisherQ32851
Sonicator with refridgerated waterbathQsonica SonicatorsQ2000FCE
Streptavidin Magnetic BeadsNew England Biolabs (NEB)S1420S
TE bufferN/AN/A10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)PromegaPR-M1875

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