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Method Article
Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo adattato per derivare, espandere e crioconservare le cellule endoteliali microvascolari cerebrali ottenute differenziando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e per studiare le proprietà della barriera eculare nel sangue in un modello ex vivo.
Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) possono essere differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) per sviluppare modelli cellulari ex vivo per lo studio della funzione della barriera eculare-encefalica (BBB). Questo protocollo modificato fornisce passaggi dettagliati per ricavare, espandere e crioconservare IPC dagli iPSC umani utilizzando un donatore e reagenti diversi da quelli riportati nei protocolli precedenti. Gli iPSC vengono trattati con 6 mezzi essenziali per 4 giorni, seguiti da 2 giorni di mezzo di coltura senza siero endoteliale umano integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base, acido retinoico e integratore B27. Al giorno 6, le cellule vengono sotto-coltivate su una matrice di collagene / fibronectina per 2 giorni. L'immunocitochimica viene eseguita al giorno 8 per l'analisi dei marcatori BMEC utilizzando CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 e SLC2A1. Il western blotting viene eseguito per confermare l'espressione del marcatore BMEC e l'assenza di SOX17, un marcatore endodermico. Il potenziale angiogenico è dimostrato con un saggio di germogliazione. La resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER) viene misurata utilizzando elettrodi a bacchetta e voltohmmetro a partire dal giorno 7. L'attività del trasportatore Efflux per la sottofamiglia di cassette di binding ATP B membro 1 e la sottofamiglia di cassette di binding ATP C membro 1 viene misurata utilizzando un lettore multi-piastra al giorno 8. Una derivazione riuscita dei BMEC è confermata dalla presenza di marcatori cellulari rilevanti, bassi livelli di SOX17, potenziale angiogenico, attività del trasportatore e valori TEER ~2000 Ω x cm2. I BMEC vengono espansi fino al giorno 10 prima di passare su piastre di collagene/fibronectina appena rivestite o crioconservate. Questo protocollo dimostra che i BMEC derivati da iPSC possono essere espansi e passaggi almeno una volta. Tuttavia, dopo la crioconservazione sono stati osservati valori TEER più bassi e una localizzazione più scarsa dei marcatori BMEC. I BMEC possono essere utilizzati in esperimenti di co-coltura con altri tipi di cellule (neuroni, glia, periciti), in modelli cerebrali tridimensionali (organ-chip e idrogel), per la vascolarizzazione degli organoidi cerebrali e per lo studio della disfunzione BBB nei disturbi neuropsichiatrici.
Funzione barriera ematico-encefalica
La barriera eto-encefalica (BBB) forma un confine che limita il movimento delle sostanze dal sangue al cervello. La BBB è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) che formano un monostrato che rivestono la vascolarizzazione. I BMEC, insieme ad astrociti, neuroni, periciti, microglia e matrice extracellulare, formano l'unità neurovascolare. I BMEC hanno una struttura paracellulare strettamente regolata che consente alla BBB di mantenere un'elevata resistenza elettrica trans-endoteliale (TEER), che limita la diffusione passiva e funge da indicatore di integritàdella barriera 1,2. I BMEC hanno anche proteine che aiutano con il movimento transcellulare come l'endocitosi, la tracitosi e la trasmigrazione, così come l'estravasazione dei leucociti durante una risposta immunitaria3. I BMEC si affidano ai trasportatori di afflussi ed efflux per il nutrimento e la rimozione dei prodotti di scarto, al fine di mantenere un equilibrio omeostatico nelcervello 3. Ad esempio, solute carrier family 2 membro 1 (SLC2A1) è un trasportatore di afflusso responsabile del movimento del glucosio attraverso il BBB 4 ,mentrei trasportatori efflux come la sottofamiglia di cassette binding ATP B membro 1 (ABCB1) e la sottofamiglia di cassette binding ATP membro C 1 (ABCC1) sono responsabili della restituzione dei substrati nel flussosanguigno 3,5,6,7. I substrati ABCB1 includono morfina, verapamil4e antipsicotici come olanzapina e risperidone8, mentre il trasportatore ABCC1 ha una varietà di substrati tra cui coniugati solfati, vincristina e coniugatiglucuronide 4.
Applicazione di modelli BBB nei disturbi psichiatrici
La disfunzione della BBB è stata implicata in una serie di disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui schizofrenia e disturbobipolare 9,10. Recentemente, i modelli cellulari ex vivo derivati da iPSC vengono utilizzati per interrogare le basi cellulari e molecolari dei disturbi psichiatrici, ma questi modelli attualmente non tengono conto del ruolo potenziale svolto dalla neurovascolarizzazione11,12,13. Si ipotizza che le citochine infiammatorie periferiche che circolano nel sangue possano avere un impatto negativo sulla BBB14,15,16,17, ma ci sono anche prove diparacellulare 18,19,20,21, 122, matrice transcellulare23,24,25,26,27,28,29e matrice extracellulare20,29,30,31,32 anomalie che contribuiscono alla disfunzione BBB. L'interruzione della BBB può comportare l'ingresso del contenuto di sangue nel parenchima cerebrale e l'attivazione di astrociti e / o microglia per rilasciare citochine proinfiammatorie, che a loro volta avviano unarisposta infiammatoria 33 che può avere effetti dannosi sulcervello 34. I BMEC sono la componente primaria della BBB e l'esame della struttura e della funzione di queste cellule può migliorare la comprensione della disfunzione BBB nei disturbi neurologici e psichiatrici.
Modelli BMEC alternativi
Prima dello sviluppo di protocolli efficienti per la derivazione di BMEC da iPSC1,6,35,36, i ricercatori avevano utilizzato BMECimmortalati 37 per studiare la funzione BBB. Tuttavia, molti di questi modelli non sono riusciti a raggiungere i fenotipi BBB desiderabili, un tale intervallo fisiologico di valori TEER38,39. L'utilizzo degli iPSC ha il vantaggio di mantenere il background genetico dell'individuo da cui derivano le cellule. Gli scienziati stanno lavorando attivamente alla definizione di modelli di microambiente ex vivo derivati da iPSC che ricapitolano la struttura e la funzione del cervello umano. I ricercatori hanno sviluppato metodi per ricavare BMEC strutturalmente e fisiologicamente simili ai BMEC trovati in vivo. I metodi per ottenere popolazioni purificate di BMEC derivati da iPSC richiedono una serie di passaggi diversi con protocolli ottimizzati negli ultimianni 1,6,35,36. Generalmente, i BMEC derivati da iPSC sono coltivati in mezzo Essential 6 (E6) per 4 giorni, seguiti da 2 giorni nel mezzo umano endoteliale senza siero (hESFM) integrato con fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), acido retinoico (RA) e integratore B27. Le cellule vengono quindi coltivate su una matrice di collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) per ottenere >90% BMEC omogenei1.
L'identità dei BMEC è confermata dall'immunofluorescenza che mostra la coesimozione di proteine BMEC tra cui molecola di adesione delle cellule piastrine-endoteliali-1 (PECAM1), SLC2A1 e proteine di giunzione stretta come la proteina di giunzione stretta 1 (TJP1), l'occludina (OCLN) e la claudina-5 (CLDN5)6. I test di germinazione sono stati utilizzati per confermare il potenziale angiogenico dei BMEC derivati da iPSC. 6 L'integrità BBB dei BMEC è valutata dalla presenza di valori teer fisiologici in vitro (~2000Ω x cm2)37 e attività misurabile per trasportatori di efflux come ABCB1 e ABCC11,6,36. I recenti progressi metodologici del gruppo Lippmann hanno portato a protocolli BMEC derivati da iPSC con ridotta variabilità sperimentale e maggiore riproducibilità1. Tuttavia, non è noto se possano essere espansi e superati oltre lo stadio di sotto-ristrutturazione. Il nostro protocollo modificato mira ad affrontare questo problema passando i BMEC derivati da iPSC oltre il giorno 8 e valutando se possono essere ulteriormente ampliati per mantenere le proprietà BBB dopo la crioconservazione. Sebbene nessuno studio abbia descritto la passaging di BMEC derivati da iPSC, esiste un protocollo per la crioconservazione BMEC che mantiene proprietà fisiologiche BBB dopo aver subito un ciclo di congelamento-disgelo40. Tuttavia, non è noto che i BMEC post-crioconservazione possano essere passaggi e mantenere le proprietà BBB.
I BPC derivati da iPSC che utilizzano il protocollo Lippmann sono stati utilizzati per modellare l'interruzione della BBB in disturbi neurologici come la malattia di Huntington7. Tali BMEC derivati da iPSC sono stati utilizzati anche per indagare gli effetti di infezioni batteriche come Neisseria meningitidis o Gruppo B Streptococcus sull'interruzione della barriera ematica-CSF e BBBrispettivamente 41,42. Inoltre, utilizzando BMEC derivati da iPSC da pazienti con sindrome da cancellazione di 22q con schizofrenia, i ricercatori hanno osservato un aumento della molecola di adesione intercellulare-1 (ICAM-1), una delle principali molecole di adesione nei BMEC che aiutano con il reclutamento e l'estravasione dei leucocitinel cervello 43. Nel loro insieme, questi studi dimostrano l'utilità di BMEC derivati dall'iPSC per lo studio dell'interruzione della BBB nei disturbi neuropsichiatrici complessi.
Gli iPSC umani sono stati riprogrammati dai fibroblasti di donatori sani utilizzando un protocollo approvato dagli Institutional Review Boards del Massachusetts General Hospital e del McLean Hospital, e caratterizzato come descritto negli studiprecedenti 44,45,46.
NOTA: In breve, i fibroblasti sono stati riprogrammati in iPSC tramite riprogrammazione genetica basata sull'mRNA47. Gli iPSC sono stati mantenuti in mezzo a cellule staminali (SCM) (vedi elenco dei materiali) e conservati ad una densità di ~1,2 x 102 cellule/mL con 1 mL di SCM, 10 μM con inibitore della protein chinasi rho-associata (ROCKi) Y-27632 e 10% (v/v) solfuro dimetile (DMSO), in fiale crioconservate in azoto liquido a -160 °C. Tutte le seguenti procedure sono eseguite in un armadio per la biosicurezza, salvo diversa indicazione.
1. Diluizione della matrice della membrana basale e rivestimento della piastra
2. manutenzione iPSC
NOTA: La massima confluenza per pozzo in una piastra a fondo piatto a 6 po 'è ~1,2 x 106 celle.
3. Differenziazione degli iPSC in BMEC
NOTA: L'EDTA non enzimatica separa le cellule in grumi. L'EDTA enzimatica (vedi Tabella dei materiali)separa le cellule in sospensioni a cella singola. L'acido retinoico (RA) deve essere protetto dalla luce.
4. Rivestimento collagene IV (COL4) e fibronectina (FN) Matrice per la purificazione del BMEC derivato da iPSC
5. Sottocoltura e purificazione dei BMEC derivati da iPSC
NOTA: L'incubazione con EDTA enzimatica può richiedere più di 15 minuti a seconda della confluenza delle cellule il giorno 6 della differenziazione.
6. Saggio di germinazione
7. Immunocitochimica (ICC)
NOTA: ICC viene eseguito su piastre a fondo piatto da 24 pozzi.
8. Misurazione e analisi TEER
NOTA: Le piastre filtrate Corning 12-Transwell sono dotate di filtri costituiti da membrane in polietilene tereftalatoda 1,12 cm e pori da 0,4 micrometri. Le misurazioni TEER sono ottenute in repliche tecniche (3 per pozzo) e biologiche (3 pozzi per linea cellulare e/o condizione).
9. Attività e analisi del trasportatore Efflux
NOTA: Il test di attività del trasportatore Efflux viene eseguito su una piastra a fondo piatto da 24 po '. I trasportatori Efflux di interesse includono ABCB1 e ABCC1. Si raccomanda di eseguire ogni condizione in triplice copia con pozzi di controllo (cioè pozzi vuoti senza i rispettivi inibitori).
10. BMEC di passaging, espansione e crioconservazione
Differenziazione BMEC
È necessario seguire con precisione alcuni passaggi critici di questo protocollo (figura 1). L'uso medio E6 il primo giorno è importante, poiché viene spesso utilizzato per derivare il lignaggio neuroectoderma dagli IPSC in un periodo di tempo relativamente breve producendo risultati riproducibili su più lineecellulari 36. Un altro passo importante è il giorno 4 della differenziazione, dove il mezzo E6 dovrebbe essere pas...
Modifiche e risoluzione dei problemi
In questo protocollo sono state apportate alcune modifiche all'utilizzo di una matrice extracellulare comunemente utilizzata e di supporti di coltura cellulare durante la coltura iPSC per la derivazione di BMEC (Figura 1). Queste modifiche non hanno influito sulla capacità di ricavare BMECS dagli iPSC umani come descritto nel protocolloLippmann 1. Una linea iPSC di un donatore sano dive...
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato supportato da un National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (a R.K.), un National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). un National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (a R.K.), un Sydney R Baer Jr Foundation Grant (a P.L.) il Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (a R.K.), la Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (a R.K.), il Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (a R.K.), l'Harvard Stem Cell Institute (a R.K.) e da Steve Willis ed Elissa Freud (a R.K.). Ringraziamo la dott.ssa Annie Kathuria per la sua lettura critica e il feedback sul manoscritto.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100mL | |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG | Life Technologies | A-21202 | |
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A-31572 | |
B27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb | Cell Signaling | 3528S | |
CLDN5 (Claudin-5) | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma Aldrich | C5533-5mg | |
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 8670 | |
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) | Corning | 353046 | |
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) | Corning | 353047 | |
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) | Corning | 3460 | |
Countess slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
DMEM/F12 (without phenol red) | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2438-50mL | |
Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663-10ML | |
DPBS (+/+) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 14040-117 | |
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 | World Precision Instruments | N/A | |
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F2442 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-2mg | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 24020-117 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Human endothelial serum-free medium | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
InCell Analyzer 6000 | General Electric | N/A | |
Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
MK-571 | Sigma Aldrich | M7571-5MG | |
NutriStem | Stemgent | 01-0005 | |
Occludin | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Services | 15710 | |
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
Recombinant Human VEGF 165 | Peprotech | 100-20 | |
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | |
Retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-100MG | |
Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702-10MG | |
SLC2A1 (GLUT-1) | ThermoFisher | PA1-21041 | |
SOX17 | Cell Signaling | 81778S | |
TJP-1 (ZO-1) | ThermoFisher | PA5-28869 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | |
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) | Sigma Aldrich | SML0572-5MG | |
Versene solution | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Tocris/Thermo Fisher Scientific | 1254 |
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