Dosimetria per l'irradiazione cellulare mediante impianti a raggi X ortovolta (40-300 kV)

Riepilogo

Questo documento descrive un nuovo protocollo di dosimetria per le irradiazioni cellulari che utilizzano apparecchiature a raggi X a bassa energia. Le misurazioni vengono eseguite in condizioni che simulano il più possibile condizioni reali di irradiazione cellulare.

Abstract

L'importanza dei protocolli e delle norme dosimetriche per gli studi radiobiologici è evidente. Sono stati proposti diversi protocolli per la determinazione della dose utilizzando impianti a raggi X a bassa energia, ma a seconda delle configurazioni di irradiazione, dei campioni, dei materiali o della qualità del fascio, a volte è difficile sapere quale protocollo sia il più appropriato da utilizzare. Proponiamo pertanto un protocollo di dosimetria per le irradiazioni cellulari che utilizzano impianti a raggi X a bassa energia. Lo scopo di questo metodo è quello di eseguire la stima della dose a livello del monostrato cellulare per renderlo il più vicino possibile alle reali condizioni di irradiazione cellulare. Le diverse fasi del protocollo sono le seguenti: determinazione dei parametri di irradiazione (alta tensione, intensità, contenitore cellulare, ecc.), determinazione dell'indice di qualità del fascio (coppia di strati ad alta tensione-mezzo valore), misurazione dell'intensità di dose con camera di ionizzazione calibrata in condizioni di kerma dell'aria, quantificazione dell'attenuazione e dello scattering del mezzo di coltura cellulare con pellicole radiocromiche EBT3 e determinazione dell'intensità di dose a livello cellulare. Questa metodologia deve essere eseguita per ogni nuova configurazione di irradiazione cellulare in quanto la modifica di un solo parametro può avere un forte impatto sulla deposizione di dose reale a livello del monostrato cellulare, in particolare coinvolgendo raggi X a bassa energia.

Introduzione

L'obiettivo della radiobiologia è quello di stabilire collegamenti tra la dose erogata e gli effetti biologici; la dosimetria è un aspetto cruciale nella progettazione di esperimenti radiobiologici. Da oltre 30 anni si sottolinea l'importanza delle norme dosimetriche e dell'armonizzazione delle pratiche^1,2,3,4,5. Per stabilire un riferimento all'intensità di dose, esistono^{diversi protocolli 6,7,8,9,10}; tuttavia, come dimostrato da Peixoto e Andreo¹¹ , possono esserci differenze fino al 7% a seconda della quantità dosimetrica utilizzata per la determinazione dell'intensità di dose. Inoltre, anche se esistono protocolli, a volte è difficile sapere quale protocollo sia il più adatto per una particolare applicazione, se presente, perché l'intensità di dose per le cellule dipende da parametri come il contenitore cellulare, la quantità di mezzi di coltura cellulare o la qualità del fascio, per esempio. Anche la dispersione e il backscattering per questo tipo di irradiazione sono un parametro molto importante da prendere in considerazione. Infatti, per i raggi X a bassa e media energia, nel protocollo di riferimento AAPM TG-61¹⁰, la dose assorbita nell'acqua viene misurata sulla superficie di un fantasma d'acqua. Tenendo conto delle condizioni molto specifiche di irradiazione cellulare, il piccolo volume di mezzi di coltura cellulare circondati dall'aria è più vicino alle condizioni del kerma rispetto a quelle definite per una dose assorbita con un grande fantasma equivalente all'acqua come nel protocollo TG-61. Pertanto, abbiamo scelto di utilizzare il kerma in acqua come quantità dosimetrica come riferimento piuttosto che la dose assorbita nell'acqua. Pertanto, proponiamo un nuovo approccio per fornire una migliore determinazione della dose effettiva erogata alle cellule.

Inoltre, un altro aspetto cruciale per gli studi radiobiologici è la completa comunicazione dei metodi e dei protocolli utilizzati per l'irradiazione per poter riprodurre, interpretare e confrontare i risultati sperimentali. Nel 2016, Pedersen et^al. Un recente studio più ampio condotto da Draeger e altri¹³ ha evidenziato che, anche se sono riportati alcuni parametri dosimetrici come la dose, l'energia o il tipo di sorgente, manca gran parte dei parametri fisici e dosimetrici essenziali per replicare correttamente le condizioni di irradiazione. Questa rassegna su larga scala, di oltre 1.000 pubblicazioni riguardanti gli ultimi 20 anni, mostra una significativa mancanza di segnalazione delle condizioni fisiche e dosimetriche negli studi radiobiologici. Pertanto, una descrizione completa del protocollo e del metodo utilizzato negli studi radiobiologici è obbligatoria per avere esperimenti robusti e riproducibili.

Tenendo conto di questi diversi aspetti, per gli esperimenti radiobiologici effettuati presso l'IRSN (Istituto per la protezione dalle radiazioni e la sicurezza nucleare), è stato attuato un rigoroso protocollo per le irradiazioni cellulari in un impianto di ortotensione. Questo protocollo di dosimetria è stato progettato per simulare il più possibile le condizioni reali di irradiazione cellulare e quindi per determinare la dose effettiva erogata alle cellule. A tal fine, vengono elencati tutti i parametri di irradiazione e l'indice di qualità del fascio è stato valutato misurando lo strato di mezzo valore (HVL) per il quale sono stati effettuati alcuni adattamenti in quanto non è possibile seguire le raccomandazioni standard del^{protocollo AAPM 10.} La misurazione dell'intensità di dose assoluta è stata quindi eseguita con la camera di ionizzazione all'interno del contenitore cellulare utilizzato per le irradiazioni cellulari, e l'attenuazione e la dispersione del supporto di coltura cellulare sono state quantificate anche con pellicole radiocromatiche EBT3. Poiché la modifica di un solo parametro del protocollo può influire in modo significativo sulla stima della dose, viene eseguita una dosimetria dedicata per ogni configurazione di irradiazione cellulare. Inoltre, il valore HVL deve essere calcolato per ogni combinazione tensione-filtro. In questo lavoro attuale vengono utilizzate una tensione di 220 kV, un'intensità di 3 mA e una filtrazione intrinseca e aggiuntiva di 0,8 mm e 0,15 mm di berillio e rame. La configurazione di irradiazione cellulare scelta si trova su un pallone T25, in cui le cellule sono state irradiate con 5 ml di mezzi di coltura cellulare.

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Protocollo

1. Piattaforma di irradiazione e determinazione dei parametri di irradiazione

1. Utilizzare una piattaforma di irradiazione che fornisce raggi X a bassa e media energia. Determinare i parametri dell'esperimento per garantire la robustezza e la riproducibilità dell'esperimento radiobiologico: Alta tensione, Intensità, Filtrazione (inerente e aggiuntiva), Strato a metà valore (HVL), Energia effettiva, Rivelatore utilizzato per le misurazioni della dosimetria, Distanza del campione sorgente (SSD), Campo di irradiazione (forma, dimensione, geometria), Quantità dosimetrica, Metodo dosimetrico, Intensità di dose, Contenitore cellulare e Quantità di mezzi di coltura cellulare. Tutti i parametri utilizzati in questo protocollo sono riportati nella tabella 1.

2. Indice di qualità del fascio: determinazione dello strato di mezzo valore

NOTA: L'HVL è definito come lo spessore di un attenuatore (di solito rame o alluminio) per ridurre l'intensità della trave di un fattore due rispetto al valore originale.

1. Impostare l'apparecchiatura (supporto, collimatore, diaframma, ionizzazione) all'interno dell'involucro di irradiazione seguendo le istruzioni della figura 1. Nessun materiale attenuatore viene utilizzato in questa fase.
2. Assicurarsi che tutte le distanze riportate nella figura 1 siano corrette. Misurarli con un metro a nastro.
3. Posizionare la camera di ionizzazione in posizione orizzontale. Per questo lavoro, abbiamo utilizzato una camera di ionizzazione cilindrica 31002 (equivalente a 31010) calibrata nel kerma dell'aria.
4. Pre-irradiare la camera di ionizzazione per 5 minuti e misurare lo sfondo (questo passaggio può essere eseguito senza collimatore).
5. Eseguire 10 misurazioni di 1 min ciascuna in modalità di raccolta della carica corrispondente al_{valore grezzo} M (in coulombs).
6. Prendere la temperatura e la pressione con adeguate apparecchiature calibrate posizionate all'interno dell'involucro di irradiazione nel nostro caso (se non è possibile, posizionarlo vicino all'esperimento). Correggere la lettura_{m grezza} sull'elettrometro in base al fattore di correzione della temperatura e della pressione indicato come segue:
   
   dove: T (°C) e P (hPa) sono rispettivamente la temperatura e la pressione effettive. T_ref e P_{ref sono} la temperatura e la pressione di riferimento quando la ionizzazione è stata calibrata dal laboratorio standard. La pressione e la temperatura devono essere misurate con strumenti calibrati. Il valore ottenuto in modalità carica è il valore medio di riferimento M (in coulombs).
   NOTA: Questo passaggio non è strettamente necessario per la misurazione HVL, ma è raccomandato.
7. Posizionare un attenuatore di un certo spessore sopra il diaframma. Il set HVL è composto da fogli con diversi spessori (0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 e 10 mm di rame) con una dimensione che consente di coprire l'intera trave (80 x 80 mm qui).
8. Prendere una misura di 1 min (M_grezzo corretto dal K_T,P come descritto in precedenza).
   1. Se l'intensità di dose è divisa per un fattore 2 rispetto al valore iniziale, si trova il valore HVL. Effettuare 5 misurazioni di 1 minuto per stimare l'intensità media di dose.
   2. Se l'intensità di dose non è divisa per un fattore 2 rispetto al valore iniziale, aumentare o diminuire lo spessore dell'attenuatore e prendere un'altra misurazione. Regolare lo spessore dell'attenuatore in base alle esigenze.
9. Una volta trovato lo spessore dell'attenuatore che diminuisce l'intensità della trave di un fattore due, prendere 5 misurazioni di 1 min per confermare l'HVL.
   NOTA: Nella maggior parte dei casi, lo spessore esatto dell'attenuatore non può essere trovato dalle pellicole disponibili. In questo caso, procedere per bisezione e interpolare l'HVL.

3. Valutazione del campo di irradiazione (nessuna stima della dose)

1. Posizionare una pellicola EBT3 sul supporto utilizzato per l'irradiazione.
2. Irradiare questa pellicola per ottenere un campo di irradiazione ben marcato (almeno 2 Gy).
3. Scansionare la pellicola EBT3 utilizzando uno scanner dedicato.
4. Tracciate il profilo di dose utilizzando l'opzione Analizza (Image J) e quindi Traccia profilo (Plot Profile) (Figura 2).
5. Determinare la dimensione dell'utilizzo del campo di irradiazione per l'irradiazione (area omogenea, escluse le regioni di penumbra, vedere figura 2).
6. Fare segni sul supporto utilizzato per l'irradiazione per assicurarsi che il contenitore cellulare si trova nella posizione giusta.
   NOTA: In questa fase viene determinata la dimensione del campo di irradiazione e la dose non è stimata. La procedura completa per la lettura e l'analisi del film è fornita nella sezione 5. Inoltre, prendere margini per evitare errori dovuti al posizionamento del contenitore di celle.

4. Misurazione dell'intensità di dose con camera di ionizzazione

1. Prendere il contenitore della cella e rompere una piccola parte sul lato o sul fondo (a seconda del particolare contenitore e della camera di ionizzazione utilizzata) per poter posizionare la camera di ionizzazioneall'interno (Figura 3,sezione superiore) o sotto(Figura 3, sezione inferiore) del contenitore. Gli esempi sono riportati nella figura 3 con diverse camere di ionizzazione (cilindriche o parallele piane) e contenitori di celle. In questo caso è stato utilizzato un pallone T25(Figura 3, scatola rossa).
   NOTA: un ferro da saldare o bisturi riscaldato è una buona alternativa per fare fori in articoli di plastica
2. Posizionare il contenitore all'interno dell'involucro sul supporto utilizzato per l'irradiazione (lastra di carbonio qui).
3. Posizionare la camera di ionizzazione nel contenitore (Figura 3, casella rossa), nella posizione corretta e collegarla all'elettrometro.
4. Assicurarsi che tutti i parametri di irradiazione elencati nella sezione 1 siano corretti (alta tensione, intensità, filtrazioni aggiuntive, distanza del campione sorgente, ecc.).
5. Pre-irradiare la camera di ionizzazione per 5 minuti ed eseguire l'azzeramento dell'elettrometro.
6. Effettuare 10 misurazioni di 1 min per determinare l'intensità media di dose nel kerma dell'aria (Gy.min^-1). Calcolare la determinazione dell'intensità di dose_nell'aria K come segue:
   
   dove M è la lettura del dosimetro corretta per temperatura, pressione, effetto polarità, ricombinazione ionica e calibrazione elettrometrica. N_{Kair e} Kq_{sono i} fattori di calibrazione e correzione per la qualità delle radiazioni, i cui valori sono specifici di ogni camera di ionizzazione.

5. Misurazione dell'attenuazione e dello scattering dei mezzi di coltura cellulare

NOTA: Maneggiare pellicole EBT3 con guanti durante tutta la procedura.

1. Preparazione dell'esperimento
   1. Tagliare piccoli pezzi di pellicole EBT3 almeno 24 ore prima dell'irradiazione.
   2. Determinare la dimensione delle pellicole in funzione del contenitore di cellule utilizzato per esperimenti di radiobiologia (4 x 4 cm per un pallone T25, ad esempio).
      Tagliare due serie di pellicole radiocromache: un insieme per le curve di taratura composto da tre pezzi di pellicola radiocromatica EBT3 per dose o punto di tempo (nove punti in totale per questo lavoro); e un insieme per la quantificazione dell'attenuazione dei mezzi di coltura cellulare, anche tre pezzi per punto.
   3. Numera tutti i film per l'identificazione (angolo in alto a destra qui) e scansionali nella stessa posizione sullo scanner.
   4. Tenere i film lontani dalla luce.
   5. Preparare il contenitore di celle utilizzato per le misurazioni della pellicola EBT3 e, se necessario, tagliare una parte per inserire la pellicola all'interno (un esempio con un T25 è riportato nella figura 4).
2. Stima dell'intensità di dose
   1. Misurare l'intensità di dose per la configurazione descritta nella sezione precedente.
   2. Mantenere questa configurazione in posizione per l'irradiazione delle pellicole radiocromiche EBT3 e utilizzare lo stesso tipo di contenitore di cellule.
3. Costruzione della curva di taratura
   1. Prendi le pellicole EBT3 pretata per la curva di calibrazione.
   2. Non irradiare tre pezzi (0 Gy).
   3. Posizionare il primo film all'interno del contenitore di celle, nella stessa configurazione dell'irradiazione cellulare.
   4. Irradiarlo per ottenere i primi punti di dose.
   5. Ripetere questa operazione per ottenere tre pezzi di pellicole EBT3 irradiate con la stessa dose.
   6. Eseguire questa funzione per ciascun punto di dose (nove punti dose in questo lavoro (0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5 e 3 Gy) come illustrato nella figura 5).
4. Valutazione dell'attenuazione dei mezzi di coltura cellulare e dello scattering.
   1. Scegliere lo stesso tempo di irradiazione per tutte le irradiazioni (60 s, ad esempio).
   2. Irradiare tre pezzi di pellicole EBT3 nel contenitore senza acqua.
   3. Irradiare tre pezzi di pellicole EBT3 nel contenitore con acqua come segue.
      1. Posizionare il film all'interno del contenitore.
      2. Riempire il contenitore con l'esatta quantità di acqua per rappresentare il supporto di coltura cellulare (5 mL qui). Utilizzare piccoli pezzi di nastro se le pellicole non rimangono sommerse correttamente.
      3. Posizionare il contenitore della cella all'interno dell'involucro e assicurarsi che la pellicola sia immersa correttamente.
      4. Una volta completata l'irradiazione, prendere le pellicole EBT3, asciugarle con carta assorbente e conservarle lontano dalla luce.

6. Lettura di pellicole radiocromache EBT3

1. Leggere le pellicole EBT3 almeno 24 ore dopo l'irradiazione.
2. Scansiona i film su uno scanner dedicato.
3. Impostare i parametri dello scanner come: formato tiff rosso-verde-blu a 48 bit, 150 dpi in modalità di trasmissione e nessuna correzione dell'immagine.
4. Eseguire un riscaldamento dello scanner come segue.
   1. Posizionare una pellicola non irradiata sullo scanner.
   2. Avviare un'anteprima della scansione.
   3. Avvia un timer e attendi 30 s.
   4. Avviare la scansione.
   5. Alla fine della scansione, avviare un timer e attendere 90 s.
   6. Allo stesso tempo, registra la scansione, apri l'immagine con ImageJ, traccia un ROI quadrato (sempre della stessa dimensione e nella stessa posizione) e prendi una misurazione del livello medio di pixel rossi dell'area.
   7. Alla fine degli anni '90, ripetere la procedura dal passaggio 2 (senza toccare la pellicola all'interno dello scanner).
   8. Ripetere questo problema almeno 30 volte per riscaldare e stabilizzare lo scanner (nessuna variazione del livello medio di pixel rossi dell'area selezionata sulle pellicole non irradiate). Se lo scanner, o cioè il valore medio dei pixel rossi, non è stabilizzato, continuare la procedura.
5. Scansione dei film EBT3
   1. Posizionare il primo film al centro del letto dello scanner. Delimitare un'area per posizionare sempre il film nello stesso punto e nello stesso orientamento.
   2. Avviare un'anteprima della scansione.
   3. Avvia un timer e attendi 30 s.
   4. Avviare la scansione.
   5. Alla fine della scansione, avviare un timer e attendere 90 s. Durante questi anni '90 cambiare il film EBT3.
      NOTA: Un'analisi delle pellicole radiocromache EBT3 è stata eseguita utilizzando un programma C ++ auto-programmato. È possibile utilizzare diversi metodi per l'analisi della pellicola EBT3, ad esempio il metodo del canale rosso o il metodo^{a tre canali 14,15}. In questo caso, abbiamo usato il metodo del canale rosso senza sottrazione di fondo, e le immagini sono state convertite in densità ottiche e quindi alla dose utilizzando il nostro programma. Poiché questo metodo è già ben definito, il nostro programma C ++ non è stato incluso qui. Inoltre, il software^{dedicato 16 può} essere utilizzato anche per l'analisi della pellicola EBT3.

7. Determinazione dell'intensità di dose a livello del monostrato cellulare

1. Convertire l'intensità media di dose ottenuta con la camera di ionizzazione corretta dall'attenuazione e dallo scattering del mezzo di coltura cellulare (K) nel kerma dell'acqua utilizzando il rapporto tra il coefficiente medio di assorbimento di energia di massa per l'acqua e l'aria valutato sullo spettro di fluenza fotone (μ_en/ρ).
   
   Un software dedicato^{17 è} stato utilizzato per calcolare lo spettro di energia dei fotoni nell'aria senza fantasma, e abbiamo usato la tabella^{NIST 18 per} calcolare il coefficiente medio di assorbimento dell'energia di massa.

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Risultati

In questo lavoro abbiamo utilizzato una piattaforma dedicata all'irradiazione di piccoli animali^19; tuttavia, questa piattaforma può essere utilizzata per irradiare altri tipi di campioni come le cellule. La sorgente di irradiazione è un tubo variano a raggi X (NDI-225-22) con una filtrazione intrinseca di 0,8 mm di berillio, una grande dimensione sportiva focale di 3 mm, un intervallo di alta tensione di circa 30-225 kV e un'intensità massima di 30 mA.

I parametri u...

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Discussione

Questo lavoro presenta il protocollo utilizzato e implementato per le irradiazioni cellulari utilizzando un impianto a raggi X a bassa energia. Al giorno d'oggi, molti esperimenti di radiobiologia vengono eseguiti con questo tipo di irradiatore in quanto sono facili da usare, convenienti e con pochissimi vincoli di radioprotezione, rispetto alla fonte di cobalto per esempio. Sebbene queste configurazioni abbiano molti vantaggi, in quanto utilizzano una fonte di energia a basso raggio X, una modifica di un solo parametro ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
31010 ionization chamber	PTW	ionization Radiation, Detectors including code of practice, catalog 2019/2020, page 14	https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14
EBT3 radiochromic films	Meditest	quote request	https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/
electrometer UNIDOSEwebline	PTW	online catalog, quote request	https://www.ptwdosimetry.com/en/products/unidos-webline/?type=3451&downloadfile=1593& cHash= 6096ddc2949f8bafe5d556e931e6c865
HVL material (filter, diaphragm)	PTW	online catalog, page 70, quote request	thickness foils: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 and 10 mm of copper, https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_ 58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70
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temperature and pressure measurements, Lufft OPUS20	lufft	quote request	https://www.lufft.com/products/in-room-measurements-291/opus-20-thip-1983/