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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo qui un metodo che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.

Abstract

Il fenotipo cellulare può essere invertito o modificato con metodi diversi, con vantaggi e limitazioni specifici per ogni tecnica. Qui descriviamo una nuova strategia che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Sono necessari due passaggi principali. Nella prima fase, le cellule adulte mature (differenziate terminalmente) sono esposte alla gomma epigenetica 5-aza-citidina per guidarle in uno stato pluripotente. Questa parte del protocollo è stata sviluppata, basata sulla crescente comprensione dei meccanismi epigenetici che controllano il destino e la differenziazione cellulare, e prevede l'uso del modificatore epigenetico per cancellare lo stato differenziato cellulare e quindi guidare in una finestra transitoria ad alta plasticità.

Nella seconda fase, le cellule cancellate sono incapsulate in micro-bioreattori di politetrafluoroetilene (PTFE), noti anche come marmi liquidi, per promuovere il riarrangiamento cellulare 3D per estendere e mantenere stabilmente l'elevata plasticità acquisita. Il PTFE è un composto sintetico idrofobico non reattivo e il suo utilizzo consente la creazione di un microambiente cellulare, che non può essere raggiunto nei tradizionali sistemi di coltura 2D. Questo sistema incoraggia e aumenta il mantenimento della pluripotenza attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione.

Le procedure tecniche qui descritte sono semplici strategie per consentire l'induzione e il mantenimento di uno stato di elevata plasticità nelle cellule somatiche adulte. Il protocollo ha permesso la derivazione di cellule ad alta plasticità in tutte le specie di mammiferi testate. Poiché non comporta l'uso della trasfezione genica ed è privo di vettori virali, può rappresentare un notevole progresso tecnologico per le applicazioni di medicina traslazionale. Inoltre, il sistema di micro-bioreattori fornisce un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali ricreando in vitro un microambiente specifico che consente la coltura a lungo termine di cellule ad alta plasticità, vale a dire come ESC, iPSC, cellule epigeneticamente cancellate e MSC.

Introduzione

Negli ultimi decenni, il concetto ampiamente accettato di progressione unidirezionale verso l'impegno e la differenziazione cellulare è stato completamente rivisto. È stato dimostrato che la specifica cellulare può essere invertita e una cellula differenziata terminalmente può essere spinta verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato, utilizzando metodi diversi.

Tra i diversi metodi proposti, uno dei metodi più promettenti prevede l'uso di composti chimici per indurre le cellule in una cosiddetta pluripotenza indotta chimicamente. Le piccole molecole utilizzate in questo approccio sono in grado di interagire e modificare la firma epigenetica di una cellula adulta matura, evitando la necessità di qualsiasi vettore transgenico e/o virale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosi studi hanno recentemente dimostrato che è possibile commutare le cellule da un fenotipo all'altro fornendo specifici stimoli biochimici e biologici che inducono la riattivazione dei geni ipermetilati 11,12,13,14,15. Questi eventi demetilanti consentono la conversione di cellule terminalmente differenziate in un progenitore primitivo, una cellula multipotente o ad alta plasticità/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Parallelamente, molti studi si sono recentemente concentrati sulla comprensione dei segnali correlati al meccanosensimento e, più specificamente, sulla possibilità di utilizzare forze meccaniche per influenzare direttamente la plasticità cellulare e/o la differenziazione 16,17,18,19. In effetti, è stato chiaramente dimostrato che la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo chiave nel controllo del destino cellulare. In particolare, i segnali biomeccanici e biofisici prodotti dall'ECM regolano direttamente i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione, influenzando il comportamento e le funzioni cellulari20,21. Questi dati recenti hanno spianato la strada allo sviluppo di nuovi sistemi di coltura 3D che imitano più da vicino il microambiente cellulare in vivo, replicando stimoli meccanici e fisici che guidano il comportamento cellulare.

Descriviamo qui un protocollo in due fasi che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Nella prima fase, le cellule vengono incubate con la molecola demetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Questo agente è in grado di indurre una significativa demetilazione globale del DNA attraverso un effetto combinato dell'azione diretta 8,10 mediata dalla traslocazione di dieci-undici (TET2) e l'inibizione indiretta delle DNA metiltransferasi (DNMT)22,23. Questo passaggio induce la rimozione dei blocchi epigenetici con una successiva riattivazione dell'espressione genica correlata alla pluripotenza e, quindi, la generazione di cellule ad alta plasticità 1,2,3,8,10, di seguito denominate "cellule epigeneticamente cancellate". Nella seconda fase, le celle sono incapsulate in un sistema di coltura 3D. A tal fine, il composto sintetico idrofobo non reattivo politetrafluoroetilene (PTFE; con dimensione delle particelle di 1 μm) viene utilizzato come micro-bioreattore, che consente la creazione di un microambiente cellulare irraggiungibile attraverso l'utilizzo di sistemi di coltura 2D tradizionali10. Le particelle di polvere di PTFE aderiscono alla superficie della goccia liquida in cui le cellule vengono nuovamente sospese e isolano il nucleo liquido dalla superficie di supporto, consentendo allo stesso tempo lo scambio di gas tra il liquido interno e l'ambiente circostante24. Il "micro-bioreattore PTFE" così ottenuto, noto anche come "Liquid Marble", incoraggia le cellule a interagire liberamente tra loro, promuovendo il riarrangiamento cellulare 3D 25,26,27, ed estende e mantiene stabilmente lo stato di plasticità elevata acquisito attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione10.

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Protocollo

Tutti gli studi sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico dell'Università degli Studi di Milano. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicata dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti. L'isolamento di cellule umane da individui adulti sani è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Maggiore Policlinico di Milano. Tutti i metodi nel nostro studio sono stati effettuati in conformità con le linee guida approvate.

1. Isolamento dei fibroblasti cutanei

NOTA: Tutte le procedure descritte di seguito possono essere applicate a fibroblasti isolati da diverse specie di mammiferi, tra cui topo, suino e umano. Le cellule murine sono state isolate da topi maschi di 7 settimane e il tessuto cutaneo suino è stato raccolto presso il macello locale. Le cellule umane sono state isolate da pazienti adulti, dopo il consenso informato scritto.

  1. Preparare una soluzione di gelatina suina allo 0,1%.
    1. Pesare 0,1 g di gelatina suina e scioglierla in 100 ml di acqua. Sterilizzare la soluzione di gelatina mediante autoclave prima dell'uso.
    2. Rivestire la capsula di Petri da 35 mm con gelatina suina allo 0,1% aggiungendo 1,5 ml della soluzione preparata. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
  2. Tagliare biopsie cutanee di mammiferi (topi, suini e umani) di circa 2-5 cm di lunghezza e metterle nella soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di Dulbecco contenente una soluzione antimicotica antibiotica al 2%. Conservare a + 4 °C fino all'uso.
    NOTA: Le raccolte di biopsie devono essere effettuate in accordo e dopo l'approvazione del Comitato Etico, in conformità con le linee guida stabilite.
  3. Lavare estensivamente le biopsie raccolte tre volte in PBS sterile fresco contenente soluzione antibiotica antimicotica al 2%.
  4. Raccogliere le biopsie dall'ultimo lavaggio e metterle in una capsula di Petri sterile da 100 mm. Utilizzare un bisturi sterile per tagliarli in pezzi di circa 2 mm3 .
  5. Al termine dell'incubazione di 2 ore, rimuovere l'eccesso di soluzione di gelatina dalla capsula di Petri da 35 mm (descritta al punto 1.1.2) e, utilizzando una pinzetta chirurgica sterile, posizionare immediatamente 5-6 frammenti di pelle in ciascun piatto di coltura preverniciato.
  6. Bagnare i frammenti aggiungendo 100 μL di goccioline di terreno di isolamento dei fibroblasti (Tabella 1) su ciascuno di essi. Coltura a 37 °C in incubatore a CO2 al 5%.
    NOTA: per evitare l'evaporazione del mezzo, posizionare la capsula di Petri da 35 mm all'interno di una capsula di Petri di 100 mm o più grande contenente acqua sterile. Assicurarsi di tappare entrambe le piastre di Petri.
  7. Dopo 24 ore di coltura, controllare la quantità del mezzo nella capsula di Petri da 35 mm. Se necessario, aggiungere 500 μL di mezzo di isolamento dei fibroblasti per mantenere bagnati i frammenti.
  8. Rimuovere con cura il mezzo e rinfrescarlo almeno ogni 2 giorni di coltura usando una pipetta.
  9. Quando i fibroblasti iniziano a crescere dai frammenti di pelle posti nella capsula di Petri da 35 mm (descritta nel passaggio 1.5.) e iniziano a formare un monostrato cellulare (di solito 6 giorni). Rimuovere i pezzi di pelle utilizzando una pinzetta chirurgica sterile e la coltura in 2 ml di terreno di isolamento dei fibroblasti.
  10. Continuare a coltivare il monostrato cellulare a 37 °C in incubatore a CO2 al 5% fino all'80% di confluenza e rinfrescare il mezzo a giorni alterni.

2. Coltura della linea cellulare primaria dei fibroblasti

  1. Quando i fibroblasti raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere con attenzione il mezzo di isolamento dei fibroblasti e lavare le cellule tre volte con 3 ml di PBS contenenti soluzione antimicotica antibiotica all'1%.
  2. Per il distacco cellulare, aggiungere 600 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% nel piatto di coltura e incubare a 37 °C per 3-5 minuti.
  3. Aggiungere 5,4 ml di terreno di coltura dei fibroblasti per neutralizzare la tripsina quando le cellule iniziano a staccarsi dal piatto di coltura (Tabella 1).
  4. Rimuovere le cellule mediante pipettaggio ripetuto e delicato. Cellule piatte in nuovi piatti di coltura (senza gelatina), mantenendo il rapporto di passaggio tra 1:2 e 1:4 (a seconda del tasso di crescita).
    NOTA: La centrifugazione non è necessaria.
  5. Mantenere le cellule in coltura e cambiare mezzo ogni 2 giorni, fino a quando non hanno raggiunto l'80% di confluenza e passarle.
    NOTA: Propagare i fibroblasti due volte a settimana per mantenere una crescita vigorosa.

3. Esposizione dei fibroblasti a 5-aza-CR

  1. Preparare una soluzione madre fresca da 1 mM 5-aza-CR.
    1. Pesare 2,44 mg di 5-aza-CR e scioglierlo in 10 ml di DMEM ad alto glucosio. Risospendare la polvere vorticosamente. Sterilizzare la soluzione con filtro da 0,22 μm.
      NOTA: la soluzione madre 5-aza-CR deve essere preparata immediatamente prima dell'uso.
    2. Preparare la soluzione di lavoro 5-aza-CR diluendo 1 μL di soluzione madre 5-aza-CR (3.1.1.) in 1 mL di terreno di coltura dei fibroblasti.
      NOTA: La concentrazione della soluzione di lavoro 5-aza-CR è di 1 μM 1,2,3,8,9.
  2. Tripsinare le cellule come descritto in precedenza (2.1.-2.3.) e rimuovere le cellule mediante pipettaggio ripetuto e delicato.
  3. Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo conico.
  4. Conta le cellule usando una camera di conteggio al microscopio ottico a temperatura ambiente. Calcolare il volume di terreno necessario per sospendere nuovamente le cellule per ottenere 4 x 104 cellule in 30 μL di terreno di coltura dei fibroblasti integrato con 1 μM 5-aza-CR (vedere passo 3.1.2.).
    NOTA: La formula da utilizzare dipende dal tipo specifico di camera.
    figure-protocol-6323
  5. Centrifugare la sospensione cellulare a 150 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e il pellet risospeso con il terreno di coltura dei fibroblasti integrato con 1 μM 5-aza-CR (vedere punto 3.1.2.). Per il volume del terreno di coltura dei fibroblasti da utilizzare vedere il punto 3.4.
    NOTA: Come controllo negativo, le cellule risospese emettono la stessa concentrazione nel terreno di coltura dei fibroblasti senza 5-aza-CR e procedono con l'incapsulamento cellulare in polvere di PTFE (fase 4.1.-4.13.).

4. Incapsulamento dei fibroblasti nei micro-bioreattori in PTFE

  1. Riempire una capsula di Petri da 35 mm con polvere di politetrafluoroetilene (PTFE) per produrre un letto (Figura 1A).
    NOTA: Utilizzare piastre di Petri batteriologiche da 35 mm per evitare l'adesione del marmo liquido. Per ottenere un guscio sottile idrofobico e poroso, utilizzare una polvere di PTFE con una dimensione media delle particelle di 1 μm e prodotta con una macinatura massima di 2,0 NPIRI. Ciò consente la creazione di marmi liquidi permeabili al gas. Inoltre, il rivestimento traslucido facilita l'osservazione dei processi di aggregazione cellulare in tempo reale La maggiore dimensione delle particelle porta ad un'elevata polidispersità che può causare elevata evaporazione, deformità e perdita della forma sferica e la dissoluzione prematura dei micro-bioreattori.
  2. Erogare 30 μL di goccioline singole contenenti 4 x 104 celle (vedere passaggi 3.4.- 3.5.) sul letto di polvere (Figura 1B).
  3. Ruotare delicatamente la capsula di Petri da 35 mm con un movimento circolare per assicurarsi che la polvere di PFTE copra interamente la superficie della goccia liquida per formare un micro-bioreattore di marmo liquido (Figura 1C).
  4. Prelevare il micro-bioreattore di marmo liquido utilizzando una punta della pipetta da 1.000 μL, tagliata sul bordo, per adattarsi al diametro del marmo (Figura 1D,E). Placcare il micro-bioreattore di marmo liquido su una capsula di Petri di batteriologia pulita per stabilizzarlo (Figura 1F).
    NOTA: Per creare un attrito per afferrare il marmo all'interno della punta, tagliare le punte delle pipette con un diametro approssimativamente inferiore al diametro del marmo liquido.
  5. Trasferire il micro-bioreattore di marmo liquido dalla capsula di Petri in una piastra da 96 pozzetti (una biglia/pozzetto) (Figura 1G).
  6. Aggiungere lentamente 100 μL di media dal margine del pozzo. Il micro-bioreattore inizia a fluttuare sopra il supporto (Figura 1H).
    NOTA: Il micro-bioreattore si rompe nel contatto diretto con il liquido, a causa dell'interruzione dell'idrofobicità del PTFE. Come approccio alternativo, i micro-bioreattori di marmo liquido possono essere collocati individualmente in un piatto di coltura batteriologica da 35 mm. In questo caso, al fine di evitare l'evaporazione del marmo liquido, la capsula di Petri da 35 mm contenente il micro-bioreattore deve essere inserita in una capsula di Petri da 100 mm, precedentemente aliquotata con acqua sterile
  7. Micro-bioreattore di marmo liquido incubato per 18 ore a 37 °C in incubatore 5% CO2 1,2,3,8,9.
    NOTA: La dimensione delle particelle in PTFE di 1 μm può garantire uno scambio ottimale di gas tra il liquido interno e l'ambiente circostante.
  8. Dopo l'incubazione 5-aza-CR per 18 ore, raccogliere il micro-bioreattore di marmo liquido utilizzando una punta di pipetta da 1.000 μL tagliata sul bordo (vedere punto 4.5).
  9. Posizionare il micro-bioreattore in una nuova capsula di Petri batteriologica da 35 mm (Figura 1D-F).
  10. Utilizzare un ago per forare la biglia liquida e romperla.
  11. Recuperare sferoidi formati con una punta di pipetta da 200 μL, tagliata sul bordo, sotto uno stereomicroscopio (Figura 1I,J).
    NOTA: Le cellule epigeneticamente cancellate incapsulate in PTFE formano una struttura sferica 3D (un aggregato in ogni marmo liquido).
  12. Per valutare l'acquisizione dello stato pluripotente in risposta a 5-aza-CR, controllare l'insorgenza dell'espressione genica correlata alla pluripotenza, OCT4, NANOG, REX1 e SOX2, mediante PCR qualitativa (Tabella 2).
  13. Procedere con il secondo passaggio del protocollo come descritto di seguito.

5. Coltura in micro-bioreattori in PTFE di cellule epigeneticamente cancellate

  1. Preparare il terreno di coltura ESC fresco (Tabella 1).
  2. Trasferire gli organoidi in una capsula di Petri contenente un mezzo ESC per il lavaggio dei residui di 5-aza-CR (vedere passaggi 5.1.-5.2.).
  3. Preparare una nuova capsula di Petri batteriologica da 35 mm contenente letto di polvere di PTFE (vedere anche punto 4.1.).
  4. Erogare un singolo organoide in una goccia di terreno di coltura ESC da 30 μL sul letto di polvere utilizzando una punta di pipetta da 200 μL, tagliata sul bordo (vedere passaggi 4.9.; 5.3.).
  5. Ruotare delicatamente la capsula di Petri da 35 mm con un movimento circolare per formare un nuovo micro-bioreattore di marmo liquido, raccoglierlo usando una punta della pipetta da 1.000 μL, tagliare sul bordo e posizionare il micro-bioreattore appena formato in un pozzo di piastra a 96 pozzetti (un marmo / pozzetto) (vedere i passaggi 4.3.-4.6.).
  6. Per far galleggiare i microbioreattori, aggiungere 100 μL di mezzi dal margine del pozzo per bagnare lentamente il marmo (vedi nota 4.7.).
  7. Micro-bioreattori di marmo liquido di coltura a 37 °C in incubatore a CO2 al 5% per tutto il tempo necessario. Cambiare mezzo a giorni alterni, seguendo la procedura descritta al punto 5.3.-5.7.
    NOTA: Nel presente manoscritto vengono forniti i risultati ottenuti con la coltura di organoidi per 28 giorni. Tuttavia, se necessario, è possibile eseguire un periodo di coltura più lungo.

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Risultati

Il presente protocollo descrive tutti i passaggi da eseguire per generare e mantenere stabilmente cellule pluripotenti di mammiferi da cellule somatiche adulte. Questo metodo ha avuto successo con fibroblasti isolati da diverse specie di mammiferi, vale a dire topi, suini e umani. I risultati rappresentativi qui riportati sono ottenuti da tutte le linee cellulari, indipendentemente dalla specie di origine.

Le analisi morfologiche mostrano che, dopo 18 ore di incubazione con l'agente demetilant...

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Discussione

Negli ultimi decenni, diversi studi si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per invertire una cellula differenziata terminale verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato. Il protocollo qui descritto consente la generazione e il mantenimento a lungo termine di cellule pluripotenti a partire da cellule adulte mature differenziate terminalmente. Il metodo combina due passaggi indipendenti che comportano l'induzione di un elevato stato permissivo che si ottiene attraverso la cancellazione chimica epigene...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato da Fondazione Carraresi e MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tutti gli autori sono membri del COST Action CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7522Component of ESC medium
5-AzacytidineSigma-AldrichA23855-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing
AdenosineSigma-AldrichA4036Component of nucleoside mix for ESC medium
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)Sigma-AldrichA5955Component of fibroblast and ESC media
CFX96 Real-Time PCRBio-Rad LaboratoriesNAThermal cycler for quantitative PCR
CytidineSigma-AldrichC4654Component of nucleoside mix for ESC medium
DMEM, high glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific41966052For fibroblast isolation and culture medium
DMEM, low glucose, pyruvateThermo Fisher Scientific31885023For ESC medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD5652PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF ProteinSigma-AldrichESG1106Component of ESC medium
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivatedThermo Fisher Scientific10500064Component of fibroblast and ESC media
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Component of ESC medium
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890For dish coating
GeneAmp PCR System 2700Applied BiosystemsNAThermal cycler for qualitative PCR
Global DNA Methylation ELISA KitCELL BIOLABSSTA-380Methylation study
GoTaq G2 Flexi DNA PolymerasePromegaM7801Qualitative PCR
GuanosineSigma-AldrichG6264Component of nucleoside mix for ESC medium
Ham's F-10 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31550031For ESC medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Component of ESC medium
KOVA glasstic slide 10 with gridsHycor Biomedical87144For cell counting
Leica MZ APO Stereo MicroscopeLeicaNAFor organoid observation
L-Glutamine solutionSigma-AldrichG7513Component of fibroblast and ESC media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035Component of ESC medium
Millex-GS 0.22 µm pore filtersMilliporeSLGS033SBFor solution sterilization
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point MutantPromegaM3681mRNA reverse transcription
Multiskan FC Microplate PhotometerThermo Fisher Scientific51119000For ELISA plate reading
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast MicroscopeNikonNAFor cell observation
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNAThermal cycler for reverse transcription
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle sizeSigma-Aldrich430935For generating micro-bioreactor
PureLink Genomic DNA Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Genomic DNA estraction
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT KitThermo Fisher ScientificAM1728Quantitative PCR
ThymidineSigma-AldrichT1895Component of nucleoside mix for ESC medium
Tissue Culture Dish 100X20 mm, StandardSarstedt833902For fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, StandardSarstedt833900For Fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, SuspensionSarstedt833900500Bacteriology petri dish for liquid marble culture
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,FSarstedt833924005For liquid marble culture
Trypsin-EDTA solutionSigma-AldrichT3924For fibroblast dissociation
Tube 15ml, 120x17mm, PSSarstedt62553041For cell suspension centrifugation
UridineSigma-AldrichU3003Component of nucleoside mix for ESC medium

Riferimenti

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