Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata

Riepilogo

Questo studio presenta metodologie per studiare i meccanismi patologici e molecolari alla base dell'interazionececi- Rhizoctonia bataticola. Il metodo della carta assorbente è utile per studiare rapidamente le risposte al genotipo dei ceci, mentre il metodo malato a base di vaso può essere utilizzato per imporre contemporaneamente siccità e infezione da R. bataticola e schermo per genotipi tolleranti.

Abstract

La malattia del marciume delle radici secche (DRR) è una minaccia emergente di stress biotico per la coltivazione di ceci in tutto il mondo. È causato da un agente patogeno fungino trasportato dal suolo, Rhizoctonia bataticola. In letteratura, i protocolli completi e dettagliati passo dopo passo sui test delle malattie sono scarsi. Questo articolo fornisce dettagli completi sui passaggi necessari per impostare una tecnica di carta assorbente per vagliare rapidamente i genotipi per la resistenza alla DRR. La tecnica della carta assorbente è facile e meno costosa. Un altro metodo, basato sull'approccio del vaso malato, è un imitatore dell'infezione naturale e può essere applicato per studiare i componenti interagenti - pianta, patogeno e ambiente - coinvolti nel triangolo della malattia.

Inoltre, in natura, la DRR si verifica principalmente nelle aree di coltivazione dei ceci piovosi, dove l'umidità del suolo si allontana con l'avanzare della crescita delle colture. Lo stress da siccità è noto per predisporre le piante di ceci alla malattia DRR. La comprensione patomorfologica e molecolare dell'interazione pianta-patogeno sotto stress da siccità può spianare la strada all'identificazione di varietà resistenti alla DRR d'élite dal pool di germoplasma ceci. Questo articolo fornisce una metodologia graduale per la preparazione di un vaso malato e il successivo saggio di malattia. Nel complesso, le informazioni qui presentate aiuteranno i ricercatori a preparare l'inoculo fungino R. bataticola, mantenere questo agente patogeno, impostare la tecnica della carta assorbente, preparare la coltura malata e il vaso malato e valutare l'infezione da agenti patogeni nelle piante di ceci.

Introduzione

Il marciume della radice secca (DRR) è una delle malattie economicamente significative nel^{ceci 1,2}. È una malattia specifica della radice causata da Rhizoctonia bataticola (teleomorfo, Macrophomina phaseolina). Le piante infette mancano di radici laterali e possiedono radici di rubinetto fragili e fogliame^{giallo 1,3}. Drr sotto stress da siccità è stato segnalato come una minaccia emergente per la coltivazione di^{ceci 1,2,3}. Inoltre, si dice che l'incidenza della DRR sia aggravata dallo stress da siccità nelle^{condizioni di campo 1,2,3}. La DRR è più diffusa nelle aree piovose che nei campi irrigati⁴. L'utilizzo di varietà resistenti è il modo per superare la malattia ed aggirare l'uso di^{fungicidi 1,13}. Poiché il germoplasma di ceci disponibile in tutto il mondo ospita variazioni genetiche per il tratto⁵, lo screening e l'identificazione di genotipi resistenti / sensibili sono fondamentali per l'allevamento molecolare per il miglioramento delle colture.

Test di malattia robusti, facili ed efficaci in termini di costi sono essenziali per indagare i modelli di infezione da R. bataticola nei ceci. Il test della malattia primaria utilizzato per osservare la risposta dei genotipi di ceci all'infezione da R. bataticola è la tecnica della carta^{assorbente 1,4}. È una tecnica semplice e può essere eseguita utilizzando inoculo fungino liquido, piantine con radici e carta assorbente sterile. Tuttavia, questa tecnica non è stata utilizzata al massimo perché non è disponibile alcun protocollo passo-passo in letteratura.

Nel frattempo, la tecnica del vaso malato prevede la preparazione di una potenziale cultura malata e l'imposizione dello stress da siccità. Dato che lo stress da siccità aggrava l'incidenza della malattia DRR³, è essenziale studiare l'interazione pianta-patogeno sotto lo stress da^{siccità 6,7}. La tecnica del vaso malato fornisce la piattaforma per uno studio così simultaneo, promuovendo migliori possibilità per lo screening del germoplasma e comprendendo le basi meccaniche dell'interazione. I cambiamenti patologici, ad esempio l'aumento della lunghezza delle radici e la riduzione del numero di radici laterale, inerenti alla malattia DRR, possono essere affrontati utilizzando la tecnica del^{vaso malato 1,3,7}.

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per la carta assorbente e le tecniche di pentola malata, che può essere utilizzato per studiare l'interazione tra ceci e R. bataticola e germplasma di ceci dello schermo. I dettagli dei materiali utilizzati nello studio sono riportati nella tabella dei materiali.

Protocollo

1. Isolamento di R. bataticola e stoccaggio

1. Dettagli del genotipo ceci e dei sintomi drr
   1. Utilizzare piante di ceci (genotipo, JG 62) che generalmente mostrano sintomi tipici della DRR, come radice primaria secca e fragile senza radici laterali e microsclerotia sotto la corteccia e all'interno del midollo^1,3.
2. Raccolta e lavaggio
   1. Piante sradiche che mostrano sintomi come fogliare di colore paglierino secco e radice primaria fragile con microsclerotia sotto lo strato di epidermide. Durante lo sradicamento, una parte importante delle radici rimarrà all'interno del terreno poiché le radici infette sono fragili. Rimuovere i detriti grossolani del terreno attaccati alla radice. Tagliare le radici separatamente e raccoglierle in buste di carta (27,5 cm x 12 cm) con l'etichetta corretta e posizionarle in una scatola di raccolta del campione.
   2. Dopo aver trasportato i campioni in laboratorio, posizionare le radici in un bicchiere da 200 mL e coprire con rete (rete di nylon con dimensioni dei pori di 3 mm di diametro) e lavare accuratamente le radici con acqua di rubinetto corrente per rimuovere le particelle del terreno aderenti.
   3. Utilizzare acqua di osmosi inversa (RO) per risciacquare una volta alla fine.
3. Sterilizzazione superficiale
   1. Rompere le radici in quattro pezzi con una lunghezza di 2 cm ciascuno con una lama bisturi e metterli in un becher pulito da 200 mL.
   2. Assembla acqua RO autoclavata, NaOCl al 2%, barattolo di scartamento e carta assorbente autoclavata (5 cm²⁾all'interno della camera di flusso laminare.
   3. Lavare le radici con 50 mL di acqua RO autoclavata tre volte e poi con 50 mL di 2% NaOCl per 10 min. Lavare le radici con 50 mL di acqua RO tre volte di nuovo per rimuovere il NaOCl.
   4. Asciugare le radici posizionando le radici su carta assorbente autoclavata e lasciare fino a quando le radici non vengono asciugate.
4. Media e incubazione
   1. Rimuovere i bordi delle radici con una lama di bisturi sterilizzata. Dividere le radici usando la lama e utilizzare le forcelle sterilizzate per posizionarle su una piastra di Petri media di destrosio di patate (PDA) contenente solfato di streptomicina (50 mg L^-1)e ampicillina (50 mg L^-1).
   2. Chiudere la piastra, sigillare con parafilm e incubare in un'incubatrice a 28 °C per due giorni al buio.
5. Metodo della punta hyphal
   1. Dopo due giorni di incubazione, portare le piastre nella camera di flusso laminare. Tagliare la punta della crescita ifale^{8 sotto} uno stereomicroscopio (stereomicroscopio educativo Leica EZ4) e trasferirla in una piastra PDA fresca con solfato di streptomicina e ampicillina.
   2. Incubare le piastre nell'incubatrice a 28 °C per dieci giorni al buio.
6. Conservazione e manutenzione dell'inoculo fungino R. bataticola
   1. Fare inclinazioni PDA in provette e trasferire una spina di agar fungina da una piastra di coltura vecchia di dieci giorni utilizzando il circuito di inoculazione sterilizzato a fiamma. Sigillare il tappo della provetta con parafilm.
   2. Incubare le inclinazioni a 28 °C per dieci giorni al buio.
   3. Sigillare nuovamente il cappuccio con parafilm e conservarlo a 4 °C in frigorifero per un uso futuro.
   4. Sottocultura ogni sei mesi per mantenere il fungo.
7. Mantenimento della virulenza
   1. Infettare le piante con puro inoculo fungino preparato come menzionato nella tecnica del vaso malato³. Isolare lo stesso fungo dalle piante infette (postulati di Koch)^{9 e} utilizzarlo per ulteriori esperimenti.
      NOTA: In questo studio è stato utilizzato un ceppo isolato sul campo del fungo (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Tecnica della carta assorbente

NOTA: La tecnica della carta assorbente comporta la preparazione di inoculo fungino liquido, preparazione delle piantine e valutazione della malattia.

1. Preparazione del liquido R. bataticola inoculum
   NOTA: L'inoculo fungino liquido R. bataticola contiene sia micelia che microsclerotia. Entrambe queste strutture fungono da inoculo primario.
   1. Preparare 500 mL di supporti PDB in un pallone da 1.000 ml e autoclave a 121 libbre per 15 minuti.
   2. Dopo che il supporto è stato raffreddato, inoculare il brodo con un loopful di spina di agar fungino da una coltura fungina e incubare a 28 °C per cinque giorni in uno shaker a 180 giri/min al buio.
   3. Assembla un imbuto in vetro autoclavato o plastica (10 cm), un pallone conico da un litro e due strati di rete (dimensioni 10 cm²⁾ (rete di nylon con la dimensione dei pori di 3 mm di diametro) sul tavolo. Filtrare la micelia fungina e la microsclerotia usando la rete. Asciugare il fungo in carta assorbente autoclavata.
   4. Pesare 100 g di mecelia per il 50% di inoculo e mantenere a temperatura ambiente.
2. Preparazione della pianta di ceci
   1. Selezionare 50 semi sani (in questo studio è stato utilizzato il genotipo JG 62 suscettibile alla DRR), metterli in un becher da 100 mL e coprire con una rete.
   2. Lavare prima i semi con acqua del rubinetto per rimuovere i detriti del terreno.
   3. Portare il becher con i semi nella camera di flusso laminare e lavarli con 50 mL sterilizzati di acqua RO tre volte per 1 minuto per lavaggio.
   4. Sterilizzare i semi con 50 mL di NaOCl acquoso al 2% per 2 minuti con scuotimento continuo e lavare i semi con 50 mL di acqua sterilizzata cinque volte per 1 minuto ciascuno.
   5. Riempire un sacchetto di politene (47,5 cm x 25 cm) con Soilrite (una miscela di perlite espansa di grado orticolo, muschio di torba irlandese e vermiculite esfoliata in rapporto uguale, cioè, 1/3:1/3:1/3), seminare i semi sterilizzati in superficie 50 semi due cm di profondità e conservare in una camera di crescita/stanza con 28 °C ± 2 °C di temperatura, 16 h fotoperiodo con un'intensità luminosa di 150 μmol m⁻² s⁻¹e umidità relativa del 70%. Innaffiarli con acqua RO e sradicare le piante otto giorni dopo la semina.
   6. Lavare le radici nell'acqua del rubinetto per rimuovere le particelle di Soilrite. Risciacquare le radici con acqua RO sterilizzata e tenerle nell'acqua RO in un bicchiere da 1000 mL.
3. Preparazione della carta assorbente in vassoi
   1. Prendi una carta assorbente e tagliali a pezzi (30 cm × 23 cm) in numero sufficiente per soddisfare le repliche.
   2. Imballare le lenzuola in un sacchetto di polietilene autoclavabile e autoclavarle a 121 libbre per 15 minuti e tenerle in un forno ad aria calda per l'asciugatura.
   3. Piegare ogni foglio di carta assorbente a metà.
   4. Posizionare la carta su un vassoio di plastica pulito e pulito dallo spirito, come illustrato nella figura 2i-iv.
4. Inoculazione delle piante mediante immersione
   1. Sciogliere 100 g di inoculo fungino in acqua RO autoclavata da 200 mL in un bicchiere da 200 mL per ottenere il 50% di inoculo.
   2. Immergere le radici della pianta nell'inoculo preparato per 1 minuto con movimento intermittente su e giù per garantire un attacco uniforme dell'inoculo fungino.
5. Posizionare le piante nella carta assorbente
   1. Bagnare il lato inferiore della carta assorbente posta sul vassoio con acqua RO sterile. Posizionare le piante sulla carta in un modo in cui solo le radici sono coperte dalla carta e i germogli vengono lasciati fuori.
   2. Chiuderlo piegando il lato superiore della carta assorbente e bagnare l'intera carta per fornire abbastanza acqua per sostenere la crescita delle piante.
   3. Innaffia il vassoio una volta al giorno e tieni i vassoi a 28 °C. Osserva quotidianamente i sintomi come necrosi, marciume radicale e ingiallimento delle foglie.

3. Tecnica del vaso malato

NOTA: La tecnica del vaso malato comporta la preparazione di inoculo virulento e una pentola malata, il mantenimento del livello di umidità e la valutazione dei sintomi della malattia.

1. Preparazione del substrato
   1. Prendi un kg di qualsiasi semi di ceci disponibile in commercio. Rimuovere i semi infetti (semi con crescita fungina, macchie di infezione e danni agli insetti). Metterli in becher di plastica da 5 L e lavare accuratamente con acqua del rubinetto 3-4 volte per rimuovere i detriti principali.
   2. Lavare i semi con 2 L di acqua RO tre volte e immergere i semi da 1 kg in un bicchiere da 5 L con tre volte più acqua per cinque ore.
   3. Una volta che i semi hanno assorbito l'acqua, lavarli nuovamente con acqua RO per rimuovere gli essudati del seme.
   4. Rimuovere completamente l'acqua e imballare i semi in bottiglie di marmellata (300 mL, 12 cm di altezza, 6 cm di diametro e 155 g di peso) a circa 1/4^di capacità (100 g per flacone di marmellata) e chiudere le bottiglie con tappi. Imballare dieci bottiglie di marmellata in un sacchetto di plastica autoclavabile (48 cm x 30 cm) autoclave due volte a 121 libbre per 15 minuti ininterrottamente.
   5. Asciugare i semi a 40 °C in forno durante la notte per rimuovere le goccioline d'acqua all'interno della bottiglia.
2. Preparazione della cultura malata
   1. Accendere la camera di flusso laminare a livello BSL-2. Pulire accuratamente il pavimento con il 70% di etanolo e accendere l'UV per 15 minuti. Quindi, tenere i semi all'interno della camera di flusso laminare.
   2. Prendi la cultura R. bataticola appena isolata di 10 giorni (parte 1). Quindi, prendere tre tappi di agar fungino (diametro 4 mm) utilizzando una punta sterile di pipetta o una borsista di sughero e metterli in bottiglie di marmellata a livello aettico. Coprire le bottiglie con tappi e sigillare con parafilm.
   3. Agitare le bottiglie per mescolare il disco fungino con i semi di ceci in modo uniforme.
   4. Incubare le bottiglie a 30 °C per 15 giorni al buio.
   5. Prendere le bottiglie di marmellata con crescita fungina nera(Figura 4iii)e trasferire la coltura malata (semi con microsclerotia) dalle bottiglie di marmellata a una piastra di Petri di vetro utilizzando forcep sterili. Asciugarli a temperatura ambiente per due giorni in una piastra di Petri di vetro.
   6. In polvere la massa fungina usando un mortaio e un pestello e conservare la polvere a 4 °C.
   7. Autoclave Soilrite due volte a 121 libbre per 15 min.
   8. Asciugare il mix di Soilrite autoclavato sotto un ombrellone.
   9. Mescolare la polvere fungina con Soilrite al 50% w/w, riempire i vasi con la miscela e mantenerli a temperatura ambiente per un giorno.
   10. Seminare un seme di ceci resistente alla DRR sterilizzato in superficie per vaso (vasi rotondi di 10 cm)(Tabella dei materiali)e mantenere un livello di umidità dell'80% di capacità di campo (FC).
   11. Osserva i sintomi come necrosi e marciume radicale sradicando le piante dopo la germinazione.
3. Valutazione dell'efficienza del vaso malato
   NOTA: Le piante mostrano sintomi fogliari gialli quando le radici sono completamente marce.
   1. Sviluppare un punteggio di malattia basato sui numeri della lesione (macchie necrotiche) (Figura supplementare 2C) e sulla gravità del marciume radicale. Vasi malati che mostrano il 90% di morte vegetale possono essere utilizzati ulteriormente.
4. Screening genotipo
   1. Preparare la coltura malata in grandi quantità e mescolarla con Soilrite sterilizzata o terreno di campo (5% w/w) in vasi alti 30 cm. Innaffiare le pentole per bagnare la superficie e lasciarle indisturbate per sette giorni.
   2. Seminare un seme sterilizzato in superficie per 10 cm di pentola rotonda e tre semi per vasi rotondi di 30 cm e annaffiarli adeguatamente.
   3. Osservare i sintomi del marciume fogliare e radicale giallo.
5. Siccità combinata e infezione da R. bataticola
   1. Imporre lo stress da siccità seguendo i protocolli menzionati in Sinha et al.

Risultati

Questo studio mirava a dimostrare tecniche come la carta assorbente e le tecniche del vaso malato per facilitare la comprensione patologica e molecolare dell'interazione pianta-patogeno sotto stress da siccità. Per raggiungere questo obiettivo, le piante che mostravano sintomi DRR^{1,3,4 sono} state raccolte da un campo di ceci e il fungo è stato isolato usando il metodo della punta ifale⁸. La coltura ...

Discussione

La tecnica della carta assorbente fornisce un approccio diretto ai genotipi di ceci dello schermo in condizioni di laboratorio. L'inoculazione a immersione consente lo studio dell'interazione su base temporale con un facile controllo del carico di inoculo(figura complementare 1)e facilita lo screening in vitro. Inoltre, possono essere utilizzate anche giovani piantine. La coltura fungina di cinque giorni(figura 1B)può produrre abbastanza inoculo da infettare le piante. L'in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901