Transezione del nervo ottico con conservazione della guaina nei ratti per valutare la rigenerazione degli assoni e gli interventi mirati all'assone delle cellule gangliari retiniche

Riepilogo

Questo protocollo descrive una transezione del nervo ottico che preserva la guaina del nervo ottico nei ratti. La pressione idrostatica delle microiniezioni nel nervo ottico genera una transezione completa, consentendo la riapposizione senza sutura delle estremità del nervo ottico sezionato e il targeting diretto del compartimento assonale in un modello di transezione.

Abstract

Gli assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC) convergono alla testa del nervo ottico per trasmettere le informazioni visive dalla retina al cervello. Patologie come il glaucoma, i traumi e le neuropatie ottiche ischemiche danneggiano gli assoni RGC, interrompono la trasmissione degli stimoli visivi e causano la perdita della vista. I modelli animali che simulano la lesione dell'assone RGC includono paradigmi di schiacciamento e trassezione del nervo ottico. Ognuno di questi modelli presenta vantaggi e svantaggi intrinseci. Uno schiacciamento del nervo ottico è generalmente meno grave di una transezione e può essere utilizzato per saggiare la rigenerazione degli assoni nel sito della lesione. Tuttavia, le differenze nella forza e nella durata dello schiacciamento possono influenzare le risposte tissutali, con conseguente riproducibilità variabile e completezza della lesione. Con la transezione del nervo ottico, si verifica una lesione grave e riproducibile che lesiona completamente tutti gli assoni. Tuttavia, il sezionamento del nervo ottico altera drasticamente la barriera ematoencefalica violando la guaina del nervo ottico, esponendo il nervo ottico all'ambiente periferico. Inoltre, la rigenerazione oltre un sito di transezione non può essere valutata senza riapporre le estremità nervose tagliate. Inoltre, distinti cambiamenti degenerativi e percorsi cellulari sono attivati da una lesione da schiacciamento o da transezione.

Il metodo qui descritto incorpora i vantaggi dei modelli di schiacciamento del nervo ottico e di transezione, mitigando al contempo gli svantaggi. La pressione idrostatica erogata nel nervo ottico mediante microiniezione attraversa completamente il nervo ottico mantenendo l'integrità della guaina del nervo ottico. Le estremità del nervo ottico sezionato vengono riposizionate per consentire saggi di rigenerazione degli assoni. Una potenziale limitazione di questo metodo è l'incapacità di visualizzare la transezione completa, una potenziale fonte di variabilità. Tuttavia, la conferma visiva che la porzione visibile del nervo ottico è stata sezionata è indicativa di una transezione completa del nervo ottico con un successo del 90-95%. Questo metodo potrebbe essere applicato per valutare le strategie di promozione della rigenerazione assonale in un modello di transezione o per studiare interventi mirati ai compartimenti assonali.

Introduzione

Il danno assonale e la degenerazione si verificano nelle cellule gangliari retiniche (RGC) a seguito di traumi o in malattie neurodegenerative come il glaucoma ^1,2. La perdita di RGC e l'interruzione delle proiezioni retinofugali provocano una perdita permanente della vista³. Per comprendere le vie molecolari responsabili dei processi degenerativi e per sviluppare strategie per mitigare la perdita assonale e di RGC o per rigenerare gli assoni RGC, sono stati utilizzati modelli animali sperimentali per simulare la lesione del nervo ottico, inclusi modelli di schiacciamento del nervo ottico e di transezione del nervo ottico. Nella selezione di un modello sperimentale, si deve tenere conto dei vantaggi e degli svantaggi di ciascun approccio, nonché dei percorsi molecolari attivati dalla lesione⁴.

La logica per lo sviluppo del metodo qui descritto è quella di sfruttare i vantaggi dei modelli di schiacciamento del nervo ottico⁵ e transezione⁶ , mitigando gli svantaggi. Gli obiettivi di questo metodo erano generare una lesione riproducibile del nervo ottico in cui tutti gli assoni sono indiscutibilmente e completamente sezionati, l'esposizione al sistema immunitario periferico è ridotta al minimo e le estremità sezionate del nervo ottico sono facilmente riposizionate per consentire la valutazione della rigenerazione RGC. Inoltre, il metodo è stato sviluppato per consentire l'accesso compartimentalizzato alla porzione assonale delle RGC danneggiate e per fornire interventi specifici per gli assoni (ad esempio, fattori neurotrofici, trapianti cellulari) localmente al nervo ottico retroorbitale.

I vantaggi di questa tecnica sono molteplici rispetto ai metodi alternativi. Rispetto a uno schiacciamento del nervo ottico, questo metodo seziona completamente e in modo affidabile il nervo ottico; Questo risolve un potenziale problema di risparmio indesiderato degli assoni⁷. Inoltre, il metodo descritto provoca una grave lesione assonale che non dipende dalla quantità e dalla durata della forza applicata dall'operatore come in una lesione da schiacciamento, riducendo così la variabilità⁸. A differenza dei metodi consolidati di sezionamento del nervo ottico, l'approccio descritto in questo protocollo mantiene l'integrità della guaina del nervo ottico. Un vantaggio della conservazione della guaina del nervo ottico è che impedisce al nervo ottico di essere esposto al sistema immunitario periferico. Inoltre, le forze meccaniche esercitate dalla guaina del nervo ottico sul nervo ottico sezionato riappongono le estremità nervose tagliate senza la necessità di manipolazioni microchirurgiche impegnative ^9,10,11. Infine, con la guaina del nervo ottico intatta, il metodo produce uno spazio fisico tra i monconi del nervo ottico in cui le cellule staminali, i fattori neurotrofici o i polimeri possono essere introdotti direttamente negli assoni RGC lesionati.

Lo schiacciamento del nervo ottico è il modello gold standard in cui vengono valutate le strategie di rigenerazione del nervo ottico per determinare l'efficacia dei trattamenti. Le dimensioni del nervo ottico del roditore limitano le possibili manipolazioni, in particolare la transezione e il riadattamento del nervo. Tuttavia, nel campo della lesione e della rigenerazione del midollo spinale, c'è consenso sul fatto che una transsezione completa sia il modello ideale per distinguere la rigenerazione assonale dall'assone¹² risparmiato. Il metodo qui descritto riduce le barriere tecniche per valutare le strategie rigenerative in un modello di transezione del nervo ottico. In quanto tale, questo modello potrebbe essere utilizzato per convalidare strategie promettenti identificate nei paradigmi di schiacciamento del nervo ottico con una transezione del nervo ottico. Inoltre, poiché questo modello si rivolge direttamente al compartimento assonale, consente di studiare gli interventi sugli assoni RGC adulti danneggiati e i meccanismi responsabili dei processi degenerativi e rigenerativi assonali.

Il modello di transezione del nervo ottico descritto in questo studio seziona completamente il nervo ottico preservando la guaina del nervo ottico. Questo nuovo approccio è appropriato per gli esperimenti che mirano a valutare la rigenerazione degli assoni in un modello di transsezione senza la necessità del processo tecnicamente impegnativo di riapposizione delle estremità del nervo ottico. Gli aspetti della tecnica sono simili all'esecuzione di uno schiacciamento del nervo ottico; Pertanto, l'approccio può essere eseguito da operatori esperti con uno schiacciamento del nervo ottico. L'approccio chirurgico non richiede strumenti appositamente progettati e può essere completato con strumenti chirurgici prontamente disponibili e un sistema di microiniezione, rendendolo accessibile ed economico.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Veterans Affairs San Diego Healthcare System. Gli strumenti e le soluzioni chirurgiche sono stati sterilizzati prima dell'intervento chirurgico per limitare le infezioni e le complicanze postoperatorie.

1. Tecnica chirurgica

1. Condurre esperimenti utilizzando tecniche asettiche e secondo i protocolli di utilizzo degli animali specifici dell'istituto.
2. Sterilizzare gli strumenti e i materiali che entrano in contatto con i tessuti viventi per prevenire le infezioni, evitare di avere un impatto negativo sul benessere degli animali e ridurre al minimo le potenziali influenze negative sullo studio. Pulire accuratamente gli strumenti chirurgici con acqua e detergenti o prodotti enzimatici per rimuovere i materiali estranei e sterilizzarli con sterilizzazione a vapore o flash.
3. Aliquotare i liquidi in contenitori sterili in una cappa per coltura tissutale. Sterilizzare la siringa da microlitro lavandola con etanolo al 70% e risciacquandola con soluzione fisiologica tamponata con fosfato sterile (PBS).

2. Anestesia

1. Anestetizzare i ratti utilizzando un sistema di vaporizzazione a base di isoflurano. Vaporizzare l'isoflurano a una concentrazione del 4,5% utilizzando ossigeno di grado medico a una velocità di 1 L/min in una scatola per anestesia collegata. Metti l'animale nella scatola dell'anestesia fino a quando la respirazione rallenta e l'animale viene sedato.
   NOTA: Questo passaggio iniziale che utilizza l'anestesia con un anestetico gassoso non è necessario se l'operatore è a proprio agio e ha familiarità con la somministrazione di anestetici iniettabili ad animali non sedati.
2. Prelevare un volume sufficiente di un cocktail anestetico composto da ketamina (50 mg/kg), xilazina (2,6 mg/kg) e acepromazina (0,5 mg/kg) in una siringa di tubercolina da 30 G. Rimuovi l'animale sedato dalla scatola dell'anestesia. Somministrare l'iniezione di anestesia per via intraperitoneale per raggiungere una profondità di sedazione costante durante tutta la procedura e riportare l'animale nella sua gabbia.
3. Inizia la procedura quando un pizzico di dito del piede non riesce a suscitare una risposta. Valutare l'animale per la profondità e la velocità di respirazione e con un pizzico di dita ogni 5 minuti durante la procedura per garantire l'assenza di dolore.
4. Al termine dell'intervento chirurgico, rimuovere l'animale dal telaio stereotassico. Somministrare un'iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica (3 ml), ampicillina (0,15-0,2 mg/kg) e banamina (2,5-5 mg/kg) per fornire analgesia e supporto di liquidi. Trasferire l'animale in un'incubatrice riscaldata per mantenere la temperatura corporea.

3. Approccio chirurgico

1. Posizionare il ratto (7-8 settimane di età, ceppo Fischer 344) in un telaio stereotassico della testa e sopra un cuscinetto riscaldato. Posizionare il fotogramma stereotassico con la testa del ratto rivolta verso la sinistra del chirurgo e centrare l'orbita sinistra nel campo visivo chirurgico.
2. Sull'occhio sinistro applicare una goccia di proparacaina e pulire l'occhio applicando il 5% di iodio povidone sulla palpebra e sull'occhio. Spalmare un unguento oftalmico sulla cornea di entrambi gli occhi per mantenere l'umidità corneale e prevenire la formazione della cataratta.
3. Passare una sutura poliglactina 4-0 attraverso l'epidermide della palpebra superiore fino all'aspetto centrale del margine palpebrale, utilizzando questa sutura per una tarsorrafia temporanea nelle fasi successive. Usa la sutura per estroflettere la palpebra ed esporre il fornice superiore.
4. Fissare la sutura in poliglactina al telaio stereotassico per applicare una trazione e un'esposizione costanti. Evitare una trazione eccessiva in quanto ciò può limitare l'esposizione del contenuto retroorbitale.
5. Usando la pinza Colibrì, sollevare la congiuntiva superiore e incidere la congiuntiva lungo il limbus con un paio di forbici Vannas. Eseguire una peritomia a ore 4 lungo il limbus superiore.
6. Applicare una leggera trazione inferiore al globo posizionando una sutura in polipropilene ad anello lungo il limbus superiore con le estremità libere sotto il globo. Il tessuto residuo lungo il limbus superiore dopo la peritomia è sufficiente a fornire trazione sull'ansa di sutura senza la necessità di far passare la sutura attraverso la sclera o il limbus.
   1. Fissare le estremità dell'anello con un bulldog clamp e lasciare che il clamp penzoli liberamente a mezz'aria. Il peso del morsetto applicherà una trazione inferiore sul globo ed esporrà una parte maggiore dello spazio retroorbitale.
7. Sezionare con le forbici di Vannas lungo la sclera seguendo la faccia posteriore del globo e sotto il retto superiore. Disinserire i muscoli retti superiori dal globo tagliando il tendine muscolare con le forbici di Vannas per accedere allo spazio retroorbitale.

4. Accesso al nervo ottico

1. Sezionare con una pinza Dumont #5/45 lungo l'aspetto temporale del globo posteriore e identificare la vena del vortice laterale superiore. Smussare ulteriormente il naso alla vena del vortice laterale superiore per esporre il cono muscolare orbitale attorno al nervo ottico ed evitare di danneggiare prematuramente il nervo ottico. Evitare di ferire la vena del vortice in quanto ciò può causare un sanguinamento significativo. Se si verifica sanguinamento, è possibile applicare un applicatore con punta di cotone fino a quando l'emorragia non si ferma.
2. Utilizzando la pinza Dumont #5/45, inserire con cautela la punta nell'aspetto temporale del cono muscolare orbitale e aprire la pinza parallelamente al decorso delle fibre muscolari per rivelare il nervo ottico. Usa la pinza per spostare lateralmente le fibre muscolari sovrastanti il nervo ottico ed esporre completamente il nervo. Assicurarsi che solo la guaina del nervo ottico copra il nervo ottico poiché le fibre muscolari residue impediranno alla pipetta capillare di vetro tirata di perforare facilmente il nervo ottico.
3. Mantenere l'esposizione del nervo posizionando due pinze Dumont #5/45 lungo entrambi gli aspetti laterali del nervo e aprendo la pinza. La quantità di esposizione dovrebbe consentire lo schiacciamento del nervo ottico di 1,5-2,0 mm posteriormente al globo oculare e l'inserimento di una pipetta capillare di vetro tirata nel nervo ottico dall'aspetto dorsale.

5. Sezionare il nervo ottico all'interno della guaina ottica

1. Utilizzando la pinza Dumont #5/45, posizionare le punte su entrambi i lati del nervo ottico ad almeno 1,5-2,0 mm posteriormente al globo. Assicurati che le punte delle pinze servano per il diametro del nervo. Chiudere completamente la pinza per 5 s per schiacciare il nervo ottico e prendere nota della posizione del sito di schiacciamento.
2. Con una siringa da microlitri, riempire una pipetta capillare in vetro con 1-2 μl di PBS e collegare la pipetta a un portapipetta. Montare il supporto della pipetta su un micromanipolatore e collegare il micromanipolatore al telaio stereotassico.
3. Regolare il sistema di microiniezione per erogare un singolo impulso della durata di 4 ms a una pressione di 20 psi ad ogni pressione del pulsante. Posizionare la pipetta nel campo operatorio.
4. Sotto l'endoscopio chirurgico, utilizzare un paio di pinze #55 per rompere e smussare la punta della pipetta a una dimensione (~20-30 μm di diametro) in grado di erogare un volume ridotto ma abbastanza grande da fornire una rigidità sufficiente a penetrare la guaina del nervo ottico. Confermare la pervietà del puntale della pipetta somministrando un singolo impulso e osservando la presenza di liquido sul puntale della pipetta.
5. Affinare la posizione della punta della pipetta appena sopra il sito dello schiacciamento del nervo ottico al centro del nervo ottico e a contatto con la guaina del nervo ottico. Annotare la posizione verticale della pipetta sul micromanipolatore per determinare successivamente una profondità di 200 μm.
6. Abbassare la pipetta osservando la punta sotto l'endoscopio chirurgico fino a quando la pipetta non entra nel nervo ottico. Se la punta della pipetta si piega e non ha la rigidità necessaria per penetrare nella guaina del nervo ottico, ritrarre la pipetta e utilizzare un paio di pinze #55 per diminuire la lunghezza e aumentare il diametro della punta della pipetta. Una volta effettuate le regolazioni della punta della pipetta, ritentare di penetrare la guaina del nervo ottico con la pipetta.
7. All'ingresso nel nervo ottico con la punta della pipetta, ritrarre la pipetta se necessario. La posizione del puntale della pipetta, come indicato dal micromanipolatore stereotassico, deve trovarsi a 200 μm sotto la superficie del nervo ottico rispetto alla posizione iniziale indicata al punto 5.5.
8. Osservando il nervo ottico sotto l'oscilloscopio chirurgico, applicare impulsi di pressione idrostatica con il sistema di microiniezione. Quando vengono applicati gli impulsi, si deve notare una separazione lineare tra le estremità distale e prossimale del nervo ottico per verificare la sezione del nervo ottico.
   NOTA: Un volume di iniezione di 250-500 nL è generalmente sufficiente a fornire la forza necessaria per sezionare il nervo ottico. Le iniezioni che richiedono più di 1 μL possono indicare la necessità di riposizionare il sito di iniezione. Volumi maggiori iniettati nel parenchima intatto potrebbero non causare ulteriori danni all'RGC, dato che il metodo attraversa completamente il nervo ottico, ma è più probabile che segua lungo i fascicoli del nervo ottico. La mancata osservazione di una trassezione lineare del nervo ottico nonostante l'iniezione di un volume di fluido sufficiente probabilmente indica un posizionamento errato della pipetta nel sito di frantumazione e la necessità di un riposizionamento. Potrebbe essere necessario anche un aumento del 50% della pressione di iniezione.

6. Chiusura e recupero

1. Ritrarre la pipetta e rimuovere la pinza Dumont #5/45 retrattile. Riportare l'occhio in posizione neutra rimuovendo il morsetto per bulldog e la sutura in polipropilene ad anello dal globo.
2. Riposizionare la congiuntiva sul limbus corneale, assicurandosi di rilasciare l'eventuale congiuntiva che si è invertita per consentire una corretta apposizione del tessuto e la guarigione. Applicare un unguento antibiotico topico oftalmico sull'occhio.
3. Rimuovere il nastro dalla sutura palpebrale 4-0 in poliglactina e mantenere la sutura in posizione per utilizzarla per una tarsorrafia temporanea. Passare la sutura attraverso il margine palpebrale della palpebra inferiore, attraverso l'area sottocuticolare inferiormente ed uscendo attraverso l'epidermide. Legare la sutura con una pressione sufficiente a chiudere l'occhio.
4. Somministrare analgesici post-chirurgici secondo i protocolli istituzionali e le linee guida dell'autorità per la cura degli animali. Ospita l'animale in modo indipendente in una gabbia riscaldata per riprendersi dopo l'intervento chirurgico. Non posizionare la lettiera nella gabbia di recupero per evitare aspirazioni accidentali.

Risultati

La transezione del nervo ottico provoca tipicamente la perdita apoptotica dell'80-90% degli RGC danneggiati entro 14 giorni dalla lesione. La tecnica descritta seziona il nervo ottico mantenendo l'integrità della guaina del nervo ottico (Figura 1). Il grado di perdita di RGC è paragonabile ai modelli tradizionali di transezione del nervo ottico e di schiacciamento del nervo ottico, con il vantaggio che le estremità nervose tagliate vengono applicate senza sforzo dopo la transezione con il metodo qui descritto (Figura 2). Il ricollegamento delle estremità del nervo ottico tagliate in questo modo consente la valutazione della rigenerazione assonale RGC in un modello di trassezione fornendo un substrato su cui gli assoni possono crescere e senza la necessità di manipolazione microchirurgica per ricollegare le estremità nervose tagliate (Figura 3). Il tracciamento anterogrado degli assoni RGC con la subunità B della tossina del colera (CTB) dimostra che gli assoni CTB positivi sono completamente sezionati dopo una transezione del nervo ottico che preserva la guaina (Figura 4). La conservazione della guaina del nervo ottico durante il sezionamento del nervo ottico crea anche uno spazio chiuso in cui i materiali di indagine, come i fattori neurotrofici o le cellule, possono essere somministrati agli assoni RGC lesionati e mantenuti in posizione (Figura 5). Durante le fasi iniziali dell'addestramento, c'è un tasso di successo previsto del 60-70% della transezione totale. Con l'esperienza, il tasso di successo della transezione totale è di circa il 90-95%.

Figura 1: Sezionamento del nervo ottico preservando la guaina del nervo ottico. (A) Immagine del campo chirurgico che dimostri l'esposizione del nervo ottico intatto prima della transezione. (B) Immagine del nervo ottico dopo la transezione. Una pipetta di vetro sottile perforava la guaina del nervo ottico nel sito di transezione e rilasciava una sospensione cellulare (soluzione torbida) nello spazio tra le estremità del nervo ottico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Perdita di cellule gangliari retiniche a seguito di una guaina del nervo ottico che preserva la transezione del nervo ottico. I montaggi piatti rappresentativi dell'intera retina da occhi con (A) un nervo ottico intatto, (B) una guaina del nervo ottico che preserva la transezione del nervo ottico, (C) una transezione tradizionale del nervo ottico o (D) schiacciamento del nervo ottico 14 giorni prima sono stati immunomarcati per la gamma sinucleina (SNCG). Le immagini sono state ottenute da un microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo 10x, corrette per l'ombreggiatura e cucite per generare una singola immagine. La perdita di corpi di cellule gangliari retiniche (RGC) in tutta la retina era evidente negli occhi lesionati. Gli inserti mostrano immagini a più alto ingrandimento della retina e dimostrano una perdita significativa di RGC a seguito di lesioni del nervo ottico. (E) La quantificazione della sopravvivenza delle RGC dimostra una significativa perdita di RGC a seguito di lesioni del nervo ottico rispetto ai nervi ottici intatti di controllo. *p< 0,05 rispetto all'intatto; ANOVA unidirezionale con test di Tukey post-hoc. n = 3 animali per gruppo; le barre di errore rappresentano SD. SP-ONT, transezione del nervo ottico che preserva la guaina; ONT, transezione del nervo ottico; ONC, schiacciamento del nervo ottico. Barre di scala = 1.000 μm. Barre di scala nei riquadri = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Sezioni di nervi ottici a seguito di lesioni del nervo ottico. Immagini rappresentative della sezione longitudinale attraverso i nervi ottici 14 giorni dopo (A-C) una transsezione che preserva la guaina del nervo ottico, (D-F) la transezione tradizionale del nervo ottico o (G-I) lo schiacciamento del nervo ottico. (A,D,G) L'immunomarcatura per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) delinea l'estensione della lesione, mentre la marcatura del DNA (B,E,H) con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) dimostra una cellularità contigua lungo la lunghezza del nervo ottico e all'interno del sito della lesione. (C,F,I) Immagini unite che dimostrano la localizzazione del tessuto neurale GFAP-positivo e la cellularità nel sito della lesione. Barre di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sezione di un nervo ottico che segue una guaina del nervo ottico che preserva la transezione del nervo ottico. Immagini rappresentative di una sezione longitudinale attraverso un nervo ottico 14 giorni dopo una transezione con preservazione della guaina del nervo ottico con tracciato dell'assone anterogrado con un'iniezione intravitreale della subunità B della tossina del colera (CTB). (A) Si può osservare una lesione completa degli assoni RGC marcati con CTB che si estendono dal globo (a sinistra) verso il cervello (a destra). (B) L'immunomarcatura per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) delinea una lesione estesa che coinvolge l'intero diametro del nervo ottico. (C) La marcatura del DNA con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) dimostra cellularità all'interno del sito della lesione. (D) Un'immagine unita che dimostri la localizzazione degli assoni marcati con CTB, il tessuto neurale GFAP-positivo e la cellularità nel sito della lesione. Barre di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Sezione longitudinale di un nervo ottico sezionato che ha ricevuto un innesto cellulare. Immagini rappresentative di una sezione longitudinale attraverso un nervo ottico 14 giorni dopo una guaina del nervo ottico che preserva la transezione e il trapianto di cellule staminali neurali (NSC) che esprimono la proteina fluorescente tdTomato. (A) L'immunomarcatura per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) ha dimostrato la completa separazione delle estremità del nervo ottico sezionate. (B) Le NSC che esprimono tdTomato erano contenute all'interno dello spazio creato dalla tecnica descritta e hanno continuato a sopravvivere dopo il trapianto. (C) Le NSC innestate sono state direttamente applicate a entrambe le estremità tagliate del nervo ottico sezionato. Barre della scala, 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le procedure chirurgiche che descrivono il modello di transezione del nervo ottico sono state pubblicate in precedenza⁶. Tuttavia, le tecniche descritte in tali protocolli prevedono l'incisione della guaina meningea per sezionare il nervo ottico. Inoltre, al fine di valutare la rigenerazione degli assoni RGC nei precedenti modelli di transezione, sono state necessarie manipolazioni microchirurgiche impegnative per apporre le estremità del nervo ottico tagliate o un innesto di nervo periferico al moncone del nervo ottico prossimale^10,13. Il protocollo qui descritto interrompe minimamente la guaina del nervo ottico durante la sezionazione del nervo ottico e consente valutazioni della rigenerazione degli assoni RGC in un modello di trassezione senza la necessità di manipolazioni microchirurgiche tecnicamente impegnative.

Diversi passaggi sono fondamentali in questo protocollo. Prestare attenzione per evitare di danneggiare l'arteria oftalmica e il sistema vascolare che irrora la testa del nervo ottico. Pertanto, il passaggio 5.1 deve essere completato almeno 1,5-2,0 mm posteriormente al globo. Se si verifica un danno all'arteria oftalmica che interrompe l'afflusso di sangue alla retina, l'occhio dovrebbe essere escluso da ulteriori esperimenti poiché è probabile che segua la tisi. Durante le fasi 5.4-5.6, è importante mantenere l'integrità della guaina del nervo ottico e ridurre al minimo le dimensioni dell'apertura attraverso la quale la pipetta di vetro entra nel nervo ottico. In questo modo si forma una tenuta ermetica attorno al puntale della pipetta per ridurre il reflusso di liquidi e consentire la generazione di una pressione idrostatica sufficiente per sezionare il nervo ottico. Smussare la punta delle pipette di vetro migliorerà la facilità con cui la pipetta entra nel nervo ottico senza causare danni collaterali.

Ci sono potenziali modifiche che gli operatori potrebbero apportare per migliorare l'accessibilità di questo metodo. Le procedure descritte prevedono una dissezione e una rimozione minime del tessuto orbitale con conservazione del nervo facciale e del trigemino. Sebbene ciò riduca la morbilità e i rischi di sanguinamento, tessuti come il grasso orbitale e la ghiandola lacrimale possono limitare la visualizzazione delle strutture cruciali. Un'attenta rimozione del tessuto che ostruisce il campo chirurgico può essere necessaria per migliorare la visualizzazione, specialmente negli animali più anziani. Un approccio laterale potrebbe anche essere utilizzato per migliorare l'accesso al nervo ottico. Tuttavia, una dissezione laterale rischia di danneggiare strutture aggiuntive, tra cui il nervo trigemino, è più coinvolta e può presentare le proprie sfide per dirigere la strumentazione per le iniezioni.

Una possibile limitazione di questo metodo è l'incapacità di manipolare direttamente il nervo ottico e visualizzare completamente l'intera transezione. Pertanto, esiste la possibilità di una transezione incompleta. Tuttavia, abbiamo osservato che la conferma visiva delle terminazioni nervose che si separano durante la fase 5.8 è un indicatore affidabile di una trassezione riuscita e completa. Se le estremità nervose non riescono a separarsi, riposizionare la pipetta per iniezione o aumentare la pressione dell'iniezione del 50% dovrebbe fornire una forza sufficiente per sezionare completamente il nervo.

Rispetto ai metodi esistenti, questo approccio preserva l'integrità della guaina del nervo ottico. Nel mantenere l'integrità della guaina del nervo ottico, le estremità del nervo ottico sezionato non sono esposte all'ambiente orbitale e al sistema immunitario periferico, limitando così l'esposizione a fattori immunitari che potrebbero potenzialmente influenzare le risposte RGC. Inoltre, preservando l'integrità della guaina del nervo ottico durante il sezionamento del nervo ottico si crea uno spazio fisico chiuso delimitato dalle estremità del nervo ottico e dalla guaina del nervo ottico. La somministrazione localizzata di fattori neurotrofici, cellule o polimeri al compartimento assonale delle RGC danneggiate può essere ottenuta iniettando nello spazio appena formato. ¹⁴ In alternativa, la rigenerazione degli assoni RGC può essere valutata in un modello di trassezione consentendo alle estremità del nervo ottico sezionato di anastomizzarsi senza la necessità di tecniche microchirurgiche impegnative.

Le applicazioni di questo metodo includono la valutazione del compartimento assonale RGC danneggiato con interventi specifici per gli assoni per identificare i percorsi responsabili della degenerazione assonale e prevenire la perdita assonale a seguito di una lesione di transezione. Inoltre, questo metodo rende accessibili alla più ampia comunità di ricerca gli studi sulla rigenerazione assonale RGC in un modello di transezione, eliminando la necessità di procedure di anastomosi del nervo ottico tecnicamente difficili. Gli interventi volti a promuovere la rigenerazione degli assoni RGC potrebbero essere valutati con questo modello di lesione grave e fornire risultati coerenti e riproducibili senza la preoccupazione di risparmiare gli assoni.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL