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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo qui un metodo di iniezione intravitreale e la successiva quantificazione batterica nel modello di topo di endoftalmite batterica. Questo protocollo può essere esteso per misurare le risposte immunitarie dell'ospite e l'espressione batterica e genica ospite.

Abstract

Le infezioni batteriche intraoculari sono un pericolo per la vista. I ricercatori utilizzano modelli animali per indagare i fattori ospiti e batterici e le vie di risposta immunitaria associate all'infezione per identificare obiettivi terapeutici praticabili e testare farmaci per prevenire la cecità. La tecnica di iniezione intravitreale viene utilizzata per iniettare organismi, farmaci o altre sostanze direttamente nella cavità vitrea nel segmento posteriore dell'occhio. Qui, abbiamo dimostrato questa tecnica di iniezione per iniziare l'infezione nell'occhio del topo e la tecnica di quantificazione dei batteri intraoculari. Bacillus cereus è stato coltivato in mezzi liquidi per infusione cerebrale per 18 ore e restituito a una concentrazione di 100 unità di formazione di colonie (CFU)/0,5 μL. Un topo C57BL/6J è stato anestetizzato usando una combinazione di chetamina e xiazina. Utilizzando un microiniettore picoliter e aghi capillari in vetro, 0,5 μL della sospensione Bacillus sono stati iniettati nel vitreo medio dell'occhio del topo. L'occhio di controllo contralaterale è stato iniettato con mezzi sterili (controllo chirurgico) o non è stato iniettato (controllo assoluto). A 10 ore dall'infezione, i topi sono stati eutanasiati e gli occhi sono stati raccolti utilizzando pinzette chirurgiche sterili e collocati in un tubo contenente PBS sterile da 400 μL e perline di vetro sterili da 1 mm. Per i test ELISA o mieloperossidasi, l'inibitore della proteinasi è stato aggiunto ai tubi. Per l'estrazione dell'RNA, è stato aggiunto il buffer di lysis appropriato. Gli occhi sono stati omogeneizzati in un omogeneizzatore tissutale per 1-2 minuti. Gli omogeneati sono stati diluiti in serie 10 volte in PBS e traccia diluiti su piastre di agar. Il resto degli omogeneati è stato conservato a -80 °C per ulteriori saggi. Le piastre sono state incubate per 24 ore e la CFU per occhio è stata quantificata. Queste tecniche si traducono in infezioni riproducibili negli occhi del topo e facilitano la quantificazione di batteri vitali, la risposta immunitaria dell'ospite e l'omica dell'espressione genica ospite e batterica.

Introduzione

L'endoftalmite batterica è un'infezione devastante che causa infiammazione e, se non trattata correttamente, può causare perdita della vista o cecità. L'endoftalmite deriva dall'ingresso di batteri all'interno dell'occhio1,2,3,4,5. Una volta negli occhi, i batteri si replicano, producono tossine e altri fattori nocivi e possono causare danni irreversibili a delicate cellule e tessuti retinali. Il danno oculare può anche essere causato dall'infiammazione, a causa dell'attivazione di vie infiammatorie che portano all'afflusso di celluleinfiammatorie all'interno dell'occhio 1,5,6. L'endoftalmite può verificarsi a seguito di chirurgia intraoculare (post-operatoria), una lesione penetrante all'occhio (post-traumatica), o dalla diffusione metastatica di batteri nell'occhio da un sito anatomico diverso (endogeno)7,8,9,10. I trattamenti per l'endoftalmite batterica includono antibiotici, farmaci antinfiammatori o interventochirurgico 3,4,11. Anche con questi trattamenti, la vista o l'occhio stesso possono essere persi. La prognosi visiva dopo l'endoftalmite batterica varia generalmente a seconda dell'efficacia del trattamento, dell'acuità visiva alla presentazione e della virulenza dell'organismo infettivo.

Bacillus cereus (B. cereus)è uno dei principali agenti patogeni batterici che causa endoftalmite post-traumatica7,12. La maggior parte dei casi di endoftalmite B. cereus ha un decorso rapido, che può causare cecità in pochi giorni. I tratti distintivi dell'endoftalmite di B. cereus includono infiammazione intraoculare in rapida evoluzione, dolore agli occhi, rapida perdita di acuità visiva e febbre. B. cereus cresce rapidamente nell'occhio rispetto ad altri batteri che comunemente causano infezionioculari 2,4,12 e possiede molti fattori di virulenza. Pertanto, la finestra per un intervento terapeutico riuscitoè relativamente corta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. I trattamenti per questa infezione di solito hanno successo nel trattamento dell'endoftalmite causata da altri agenti patogeni meno virulenti, ma B. cereus endophthalmitis si traduce comunemente in oltre il 70% dei pazienti affetti da una significativa perdita della vista. Circa il 50% di questi pazienti subisce eviscerazione o enucleazione dell'occhioinfetto 7,16,22,23. La natura distruttiva e rapida di B. cereus endophthalmitis richiede un trattamento immediato e adeguato. I recenti progressi nel discernere i meccanismi alla base dello sviluppo delle malattie hanno individuato potenziali obiettivi diintervento 19,26,27. I modelli sperimentali di topo di Endoftalmite B. cereus continuano ad essere utili per discernere i meccanismi di infezione e testare potenziali terapie che possono prevenire la perdita della vista.

L'infezione intraoculare sperimentale dei topi con B. cereus è stato un modello strumentale per la comprensione dei fattori batterici e ospiti, nonché delle loro interazioni, durante l'endoftalmite28. Questo modello imita un evento post-traumatico o post-operatorio, in cui i batteri vengono introdotti nell'occhio durante una lesione. Questo modello è altamente riproducibile ed è stato utile per testare terapie sperimentali e fornire dati per miglioramenti nello standard di cura1,6,19,29,30. Come molti altri modelli di infezione, questo modello consente il controllo indipendente di molti parametri di infezione e consente un esame efficiente e riproducibile dei risultati delle infezioni. Studi su un modello simile nei conigli negli ultimi decenni hanno esaminato gli effetti dei fattori di virulenza di B. cereus nell'occhio2,4,13,14,31. Iniettando ceppi mutanti B. cereus privi di fattori di virulenza individuali o multipli, il contributo di questi fattori di virulenza alla gravità della malattia può essere misurato da esiti come la concentrazione di batteri in diverse ore di postinfezione o la perdita della funzionevisiva 13,14,27,31,32. Inoltre, i fattori host sono stati esaminati in questo modello infettando ceppi di topi knockout privi di specifici fattori infiammatori dell'ospite26,29,33,34,35. Il modello è utile anche per testare potenziali trattamenti per questa malattia iniettando nuovi composti nell'occhio dopol'infezione 30,36. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo dettagliato che include l'infezione di un occhio di topo con B. cereus,la raccolta dell'occhio dopo l'infezione, la quantificazione della carica batterica intraoculare e la conservazione di campioni per saggiare ulteriori parametri di gravità della malattia.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite seguendo le raccomandazioni contenute nella Guida alla cura e all'uso degli animali da laboratorio e nella Dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione. I protocolli sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'University of Oklahoma Health Sciences Center (numeri di protocollo 15-103, 18-043 e 18-087).

1. Aghi di vetro sterili

  1. Accendere l'estrattore della pipetta dell'ago.
  2. Regolare la manopola del riscaldatore fino a quando il display non mostra 12.6.
  3. Aprire la porta e alimentare manualmente il tubo capillare da 5 μL attraverso il morsetto superiore e il filamento del riscaldatore fino a quando metà del tubo si estende sotto il filamento(Figura 1A).
  4. Verificare che il tubo capillare si trova nella scanalatura a "V" nel morsetto superiore. Stringere il morsetto superiore.
  5. Con il morsetto inferiore aperto, regolare manualmente lo scivolo verticale verso l'alto fino a quando il morsetto inferiore raggiunge il limite superiore. Verificare che il tubo si trova nella scanalatura a "V" nel morsetto inferiore. Stringere il morsetto inferiore.
  6. Chiudere la porta e confermare che la luce "Pronta" è aperta. Premere il pulsante Start per avviare il riscaldatore e la sequenza di trazione ( Figura1B).
  7. Assicurarsi che il riscaldatore si scateni automaticamente dopo che il calore e la gravità allontanano il tubo capillare(Figura 1C) e che lo scivolo si muova verso il basso.
  8. Apri la porta. Tenendo la parte superiore del tubo capillare, non fissare il morsetto superiore. Rimuovere il tubo capillare superiore e rlo da parte.
  9. Tenere il tubo capillare nello scivolo inferiore e non fissare il morsetto inferiore. Rimuovere il tubo capillare inferiore e rlo da parte.
  10. Utilizzare una smussatura a microelettrode con una piastra di rettifica abrasiva in allumina da 0,05 μm per smussare il tubo capillare tirato per creare gli aghi di iniezione.
  11. Pipetta abbastanza acqua sulla piastra di rettifica per coprire la superficie (Figura 1D).
  12. Accendere la smussatrice in modo che inizi a ruotare a 60 giri/min. Posizionare il tubo capillare tirato nel morsetto della pipetta nella scanalatura a "V". Stringere il morsetto e regolare l'angolo del morsetto della pipetta a 30°.
  13. Regolare la punta del bordo appuntito del tubo capillare a circa due terzi di distanza dal centro di rotazione della piastra di rettifica.
  14. Abbassare il tubo capillare bloccato regolando la manopola di controllo grossolana nella parte superiore del manipolatore. Continuare ad abbassare il tubo capillare fino a quando la punta del tubo capillare si estende sotto la superficie dell'acqua e contatta la superficie abrasiva della piastra di rettifica.
  15. Monitorare i progressi di smussatura utilizzando il microscopio collegato alla smussatrice. Dopo 5 minuti, regolare il controllo fine per sollevare l'ago di vetro dalla piastra di rettifica.
  16. Rimuovere l'ago di vetro e posizionarlo sotto l'ingrandimento 10x per controllare la punta del tubo capillare(Figura 1E,F).
  17. Per assicurarsi che non vi siano blocchi, inserire l'ago di vetro in un supporto per pipette su una siringa e spingere l'aria in un tubo da 1 ml di etanolo al 99%. Se le bolle d'aria si formano sulla punta dell'ago, l'ago non ha blocchi e può essere utilizzato per la microiniezione. Questo processo garantisce anche la sterilità degli aghi di vetro.
  18. Un tubo capillare può contenere fino a 5 μL di liquido. Contrassegnare il tubo capillare in 10 sezioni per calcolare le distanze sull'ago da contrassegnare per volumi di 0,5 μL. Contrassegnare una scala con quella distanza che contiene 0,5 μL per la preparazione futura. Per un ago da 5 μL, distanze di 0,7 mm di distanza equivalgono a 0,5 μL(figura 1G).

2. Cultura del Bacillus cereus

  1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di biosicurezza di livello 2.
  2. Stock di congelatore a strisce di B. cereus ATCC 14579 per isolamento di una singola colonia su una piastra di agar del sangue di pecora al 5% e incubare durante la notte a 37 °C(Figura 2A).
  3. Pipetta 5 mL di brodo sterile brain heart infusion (BHI) in un tubo snap-cap sterile da 10 mL(Figura 2B). Utilizzando un anello sterile o un ago, raccogliere una singola colonia di B. cereus ATCC 14579 dalla piastra di agar e inoculare il liquido BHI.
  4. Vortice brevemente il campione. Posizionare il tubo a scatto in un incubatore rotante. Impostare la temperatura a 37 °C e la velocità a 200 giri/min. Dopo 18 ore, rimuovere la coltura dall'incubatore (Figura 2B).

3. Diluizione batterica per iniezione intravitreale

  1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di biosicurezza di livello 2.
  2. Calcola il volume della coltura di B. cereus durante la notte da aggiungere a 10 mL di BHI fresco per ottenere 200 unità di formazione di colonie per microlitro (CFU /μL). Ad esempio, una coltura notturna di B. cereus in BHI si replica a circa 2 x 108 CFU/mL, che può quindi essere diluita a 200 CFU/μL pipettando 10 μL di coltura notturna in 10 mL di BHI fresco.
  3. Pipetta 1 ml della coltura appena diluita in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Mantenere questo tubo sul ghiaccio fino all'iniezione intravitreale. Eseguire l'iniezione intravitreale entro 60 minuti dalla diluizione della coltura batterica.

4. Iniezione intravitreale del mouse

  1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di biosicurezza di livello 2.
  2. Preparare il sito della procedura posizionando sottopad medici sul tavolo operatorio.
  3. Accendere il microiniettore e aprire la valvola del gas sul serbatoio dell'aria compressa collegato al microiniettore. Regolare il regolatore del serbatoio fino a quando l'erogazione del gas è di circa 60 psi.
  4. Sul microiniettore premere Modalità fino a quando lo schermo non mostra Bilanciamento. Premere Bilanciamento e posizionare il mouse del computer sulla tabella operatoria. Collegare il supporto della pipetta in acciaio inossidabile al tubo collegato a 'Riempimento/Uscita' dell'iniettore. Questo tubo è sempre collegato all'iniettore.
  5. Inserire l'ago capillare all'altra estremità del supporto della pipetta avvitando stretto il connettore del supporto della pipetta attorno all'ago.
  6. Accendi il microscopio oftalmico e accendi la sua luce a un'intensità del 50%. Regolare il microscopio sul sito della procedura sul tavolo operatorio e regolare il microscopio sulla messa a fuoco desiderata.
  7. Prima dell'inizio della procedura, verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato testando il riflesso di prelievo del pedale. Assicurarsi di seguire il protocollo approvato dalla IACUC per l'anestesia.
  8. Posizionare il mouse anestetizzato sugli underpad medici con il naso puntato a destra e appoggiato sul lato sinistro.
  9. Guardare l'occhio destro del mouse attraverso il microscopio oftalmico e aprire i coperchi aprendo le pinng di una pina d'azione inversa su entrambi i lati dell'occhio per esporre il sito di iniezione (Figura 3C).
  10. Riempire l'ago capillare con la diluizione di 200 CFU/μL facendo clic a sinistra sul tappetino del mouse collegato al microiniettore (Figura 3D).
  11. Fissare la testa dell'animale con la mano sinistra e posizionare la punta dell'ago sul limbo dell'occhio. Con l'ago in posizione smussata e con un angolo di 45 °, forare l'occhio del mouse, ma assicurarsi che solo la punta affilata dell'ago (~ 0,5 mm) sia inserita durante l'iniezione.
  12. Una volta inserita la punta dell'ago, spostare la mano sinistra dalla testa del mouse al tappetino del mouse e fare clic con il pulsante destro del mouse sul tappetino del mouse per iniettare 0,5 μL della diluizione B. cereus. Per evitare perdite, lasciare la punta dell'ago all'interno dell'occhio del mouse per 2-3 secondi prima di rimuovere (Figura 3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.
  13. Rilasciare le forcep e posizionare il mouse in una gabbia seduta su un pad riscaldante. Monitorare questi topi fino a quando non si sono ripresi dall'anestesia (Figura 3F).
  14. Una volta recuperati i topi dall'anestesia, riportare la gabbia al suo rack adeguato. Se i topi saranno sottoposti ad analisi della funzione retinica per elettroretinografia, le gabbie devono essere restituite in una stanza buia per un adeguato adattamento al buio.

5. Preparazione del tubo di raccolta

  1. Posizionare perline di vetro sterile da 1 mm in tubi a vite da 1,5 ml.
  2. Sterilizzare questi tubi in autoclave su un ambiente asciutto. Lasciare raffreddare i tubi a temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Aggiungere 10 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) a un tubo di centrifuga sterile da 15 ml.
  4. Aggiungere 1 compressa di compresse di cocktail inibitore della proteasi nel tubo. Mescolare con vortici19,27,29,34,35.
  5. Pipetta 400 μL di 1 saline tamponata da fosfato (PBS) contenente inibitore della proteasi in ogni tubo di raccolta autoclavato. Etichettare i tubi e posizionare sul ghiaccio. (Figura 4A).

6. Raccogliere gli occhi

  1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di biosicurezza di livello 2.
  2. Eutanasia del topo perinalazione di CO 2. Utilizzare un metodo secondario per confermare l'eutanasia.
  3. Tenere la testa del topo eutanasiata sicura e aprire le forcep della punta fine su entrambi i lati dell'occhio infetto. Spingere verso il basso verso la testa per proptosare l'occhio. Una volta che le pinng sono dietro il globo dell'occhio, spremere le pinngs insieme. Allontanare le flesse dalla testa per staccare il bulbo oculare( Figura 4B).
  4. Posizionare immediatamente il bulbo oculare in un tubo di raccolta etichettato. Posizionare i tubi sul ghiaccio per non più di 60 minuti(figura 4C).

7. Conteggio batterico intraoculare

  1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni di biosicurezza di livello 2.
  2. Verificare che tutti i tubi di raccolta siano ben chiusi e bilanciati mentre si trovano nell'omogeneizzatore tissutale (Figura 5A). Accendere l'omogeneizzatore tissutale per 1 minuto per omogeneizzare i campioni. Attendere 30 s, quindi accendere per un altro minuto. Posizionare i tubi sul ghiaccio(figura 5B,C).
  3. Diluire serialmente ogni campione di 10 volte trasferendo in sequenza 20 μL dell'omogeneato in 180 μL di PBS sterile 1x. Diluire fino a raggiungere un fattore 10-7 (Figura 5D).
  4. Etichettare ogni fila di una piastra BHI calda e quadrata con i fattori di diluizione adeguati. Trasferire 10 μL di ogni diluizione di fila nella piastra BHI superiore inclinata di circa 45°. Lasciare correre il campione fino a raggiungere quasi il fondo della piastra, quindi posare la piastra piatta (Figura 5E)39.
  5. Quando il campione viene assorbito nell'agar BHI, trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C. Le colonie dovrebbero iniziare ad essere visibili 8 ore dopo essere state posizionate nell'incubatrice.
  6. Rimuovere la piastra dall'incubatore prima che la crescita delle colonie di B. cereus interferisca con l'identificazione delle singole colonie (Figura 5F).
  7. Per una rappresentazione accurata della concentrazione nel campione, contare la riga che ha tra 10-100 colonie. Ad esempio, una fila con la frazione di diluizione di 10-4 che ha 45 colonie avrà una concentrazione di 4,5 x 105 CFU/mL.
  8. Per calcolare il numero totale di batteri per occhio, moltiplicare la concentrazione per 0,4, che rappresenta il volume millilitro di 1x PBS utilizzato per omogeneizzare l'occhio. Ad esempio, la concentrazione di 4,5 x 105 CFU/mL si tradurrebbe in 1,8 x 105 CFU B. cereus per occhio.

8. Conservazione dei campioni

  1. Mettere campioni omogenei in una scatola congelatore etichettata e posizionare questa scatola in un congelatore a -80 °C. Questi campioni possono essere utilizzati in seguito per l'analisi infiammatoria del mediatore da parte di ELISA.

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Risultati

Generare un inoculo riproducibile e l'accuratezza della procedura di iniezione intravitreale sono passaggi chiave nello sviluppo di modelli di endoftalmite microbica. Qui, abbiamo dimostrato la procedura di iniezione intravitreale utilizzando Gram-positive Bacillus cereus. Abbiamo iniettato 100 CFU/0,5 μL di B. cereus nel medio-vitreo di cinque topi C57BL6. Dopo 10 h di postinfezione, abbiamo osservato una crescita intraoculare di B. cereus a circa 1,8 x 105 CFU/occhio.

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Discussione

Anche con la disponibilità di potenti antibiotici, farmaci antinfiammatori e chirurgia della vitrectomia, l'endoftalmite batterica può accecare un paziente. Gli studi clinici sono stati utili nello studio dell'endoftalmite; tuttavia, i modelli sperimentali di endoftalmite forniscono risultati rapidi e riproducibili che possono essere tradotti in progressi nello standard di cura, con conseguente migliore risultato visivo per i pazienti.

Il volume vitreo dell'occhio del topo è di circa 7 μL<...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno conflitti finanziari da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano il Dr. Feng Li e Mark Dittmar (OUHSC P30 Live Animal Imaging Core, Dean A. McGee Eye Institute, Oklahoma City, OK, USA) per la loro assistenza. La nostra ricerca è stata supportata da sovvenzioni dei National Institutes of Health R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 e R01EY024140. La nostra ricerca è stata supportata anche da P30EY21725 (sovvenzione NIH CORE per live animal imaging and analysis, molecular biology e cellular imaging). La nostra ricerca è stata anche supportata dal programma di preparazione pre-dottorato NEI Vision Science 5T32EY023202, una sovvenzione di supporto alla ricerca della Presbyterian Health Foundation e una sovvenzione illimitata al Dean A. McGee Eye Institute da Research to Prevent Blindness.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 µL pipetteRANINL0696003GNA
37oC IncubatorFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Brain Heart InfusionBD90003-032NA
Cell MicroinjectorMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
Fine tip forcepsThermo Fisher Scientific12-000-122NA
Glass beads 1.0 mmBioSpec11079110NA
Incubator ShakerNew Brunswick ScientificNB-I2400NA
Microcapillary Pipets 5 MicrolitersKimble71900-5NA
Micro-Pipette BevelerSutter Instrument Co.BV-10NA
Microscope Axiostar PlusZeissNA
Microscope OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
Multichannel pipette 30-300 µLBiohit15626090NA
Multichannel pipette 5-100 µLBiohit9143724NA
Needle/Pipette PullerKopf730NA
PBSGIBCO1897315Molecular grade
Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001Molecular grade
Reverse action forcepsKatenaK5-8228NA

Riferimenti

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