Analisi del repertorio immunitario del recettore delle cellule T e B utilizzando il sequenziamento di nuova generazione

Riepilogo

L'attuale protocollo descrive un metodo per l'isolamento del DNA da campioni di sangue e biopsie intestinali, generazione di librerie PCR TCRβ e IGH per il sequenziamento di nuova generazione, le prestazioni di una corsa NGS e l'analisi dei dati di base.

Abstract

La memoria immunologica, il segno distintivo dell'immunità adattiva, è orchestrata da linfociti T e B. In circolazione e in diversi organi, ci sono miliardi di cloni di cellule T e B unici, e ognuno può legare uno specifico antigene, portando alla proliferazione, differenziazione e / o secrezione di citochine. La vasta eterogeneità nelle cellule T e B è generata dalla ricombinazione casuale di diversi segmenti genetici. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS), sviluppate nell'ultimo decennio, consentono una visione approfondita senza precedenti del repertorio immunitario del recettore delle cellule T e B. Studi in varie condizioni infiammatorie, immunodeficienze, infezioni e neoplasie maligne hanno dimostrato marcati cambiamenti nella clonalità, nell'uso genico e nelle proprietà biofisiche del repertorio immunitario, fornendo importanti approfondimenti sul ruolo delle risposte immunitarie adattive nei diversi disturbi.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per NGS del repertorio immunitario delle cellule T e B dal sangue e dai tessuti. Presentiamo una pipeline che parte dall'isolamento del DNA attraverso la preparazione della libreria, sequenziamento sul sequencer NGS e termina con analisi di base. Questo metodo consente l'esplorazione di specifiche cellule T e B a livello nucleotidico o amminoacido, e quindi può identificare cambiamenti dinamici nelle popolazioni di linfociti e parametri di diversità in diverse malattie. Questa tecnica sta lentamente entrando nella pratica clinica e ha il potenziale per l'identificazione di nuovi biomarcatori, stratificazione del rischio e medicina di precisione.

Introduzione

Il sistema immunitario adattivo, composto da linfociti T e B, utilizza la memoria immunologica per riconoscere un antigene precedentemente incontrato e avviare una risposta rapida. I linfociti sono generati nel midollo osseo e maturano nel timo (cellule T) o nel midollo osseo (cellule B). Sia il recettore delle cellule T (TCR) che il recettore delle cellule B (BCR) mostrano configurazioni uniche che consentono il riconoscimento di antigeni specifici. Nell'omeostasi, le cellule T e B circolano e rilevano costantemente i trilioni di diversi peptidi presentati sulle cellule che presentano antigeni. La legazione TCR o BCR di un antigene specifico ad alta affinità, insieme ad un'adeguata co-stimolazione, porta all'attivazione cellulare, con conseguente secrezione di citochine, espansione clonale e generazione di anticorpi, nel caso delle cellule B.

L'enorme gamma delle diverse cellule T o B è collettivamente definita repertorio immunitario, consentendo il riconoscimento di innumerevoli epitopi diversi. Al fine di generare un repertorio così vasto, si svolge un complesso processo di assemblaggio casuale di diversi segmenti genico, creando combinazioni quasi infinite di recettori in grado di legare antigeni^{unici 1}. Questo processo, chiamato ricombinazione V(D)J, include riarrangiamenti di diversi geni variabili (V), diversità (D) e unione (J), accompagnati da deezioni casuali e inserimenti di nucleotidi nelle^{giunzioni 2}.

L'architettura del sistema immunitario adattivo ha interessato scienziati in diversi campi per molti decenni. In passato, il sequenziamento di Sanger, lo spettrotipizzazione complementare della regione determinante 3 (CDR3) e la citometria del flusso erano usati per caratterizzare il repertorio immunitario, ma fornivano una bassa risoluzione. Nell'ultimo decennio, i progressi nei metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno permesso una visione approfondita delle caratteristiche e della composizione dei repertori TCR e BCR di un^{individuo 3,4}. Questi sistemi ad alta produttività (HTS) sequenziano ed elaborano contemporaneamente milioni di prodotti TCR o BCR riorganizzati e consentono un'analisi ad alta risoluzione di specifiche cellule T e B a livello di nucleotide o amminoacidi. NGS fornisce una nuova strategia per studiare il repertorio immunitario sia in salute che in malattia. Gli studi che utilizzano HTS hanno dimostrato repertori TCR e BCR alterati nelle malattie autoimmuni^5,immunodeficienze primarie^6,7e neoplasie maligne, come nella leucemia mieloide acuta⁸. Utilizzando NGS, noi e altri abbiamo mostrato l'espansione oligoclonale di specifici cloni cellulari T e B, in pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), tra cui colite ulcerosa e malattia di Crohn^{9,10,11,12,13,14}. Nel complesso, studi provenienti da diversi campi suggeriscono che i cambiamenti nel repertorio hanno un ruolo cruciale nella patogenesi dei disturbi immuno-mediati.

L'attuale protocollo descrive un metodo per l'isolamento del DNA dalle biopsie intestinali e dal sangue, la generazione di librerie PCR TCRβ e IGH per NGS e le prestazioni di sequenziamento. Forniamo anche passaggi di base nell'analisi dei dati del repertorio immunitario. Questo protocollo può essere applicato anche per la generazione di librerie TCRα, TCRγ e IGL. Il metodo è anche compatibile con altri organi (ad esempio linfonodi, tumori, liquido sinoviale, tessuto adiposo, ecc.) purché siano utilizzati protocolli di digestione specifici per i tessuti.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale dello Sheba Medical Center e il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i soggetti partecipanti.

1. Isolamento e quantificazione del DNA

1. Digestione elisi cellulare delle biopsie intestinali
   1. Recuperare le biopsie intestinali, appena raccolte o quelle conservate a -20 °C o -80 °C. Se si utilizzano biopsie congelate, scongelare sul ghiaccio.
   2. Aggiungere 600 μL di soluzione di lysis nucleica ad un tubo sterile di micro-centrifuga da 1,7 ml, refrigerato sul ghiaccio.
   3. Mettere la biopsia in un tubo di microcentrifugo con soluzione di lisi e incubare a 65 °C per 15-30 min.
   4. Aggiungere 17,5 μL di 20 mg/mL di proteinasi K e incubare durante la notte a 55 °C, con tremoti delicati.
   5. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente per 5 minuti prima di procedere al passaggio 1.3.
2. Lisi cellulare di sangue intero
   1. Ottenere 3 ml di sangue intero in tubo contenente EDTA, eparina o citrato.
   2. Far scorrere delicatamente la provetta fino a quando non viene accuratamente miscelata e trasferire il sangue in un tubo di centrifuga sterile da 15 ml contenente 9 ml di soluzione di lisi cellulare. Invertire più volte durante un periodo di incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.
   3. Centrifugare a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi scartare il più supernatante possibile senza disturbare il pellet bianco visibile. Rimarranno circa 50-100 μL di liquido residuo.
   4. Tubo vortice vigorosamente per 15 s fino a completo rimorsi. Aggiungere più volte 3 mL di soluzione dilisi dei nuclei e pipetta. La soluzione dovrebbe diventare viscosa.
3. Precipitazione proteica
   1. Aggiungere 200 μL di tampone di precipitazione proteica al tessuto, o 1 mL al sangue. Vortice vigorosamente per 20 s e incubare sul ghiaccio per 5 minuti. Piccoli grumi proteici possono essere visibili dopo il vortice.
   2. Centrifuga a 16.000 x g per 4 min. Dovrebbe formarsi un pellet stretto contenente proteine precipitate.
   3. Trasferire con cura il supernatante, senza disturbare il pellet, in un nuovo tubo da 1,7 ml.
      NOTA: Se il pellet non è stretto, considerare un'altra centrifuga a 16.000 x g per 4 minuti.
4. Precipitazione e reidratazione del DNA
   1. Aggiungere 1 ml di 2-propanolo al tubo contenente il supernatante e mescolare delicatamente invertendo. Il DNA dovrebbe diventare visibile come sostanza bianca fluttuante.
   2. Centrifuga a 16.000 x g per 1 min. Rimuovere completamente il supernatante utilizzando una pipetta.
   3. Aggiungere 1 ml di etanolo appena preparato al 70% e invertire più volte il tubo. Centrifuga a 16.000 x g per 1 min a temperatura ambiente. Scartare con attenzione il supernatante.
   4. Ripetere il passaggio 1.4.3.
   5. Posizionare il tubo aperto invertito su carta assorbente pulita per 10-15 minuti. Invertire di nuovo il tubo e confermare l'idratazione completa. Se necessario, lasciare asciugare all'aria per ulteriori 10-15 minuti.
      NOTA: È fondamentale che il pellet si asciughi completamente.
   6. Aggiungere 50 μL di acqua ultra pura (UPW). Se necessario, il DNA può essere diluito di più dopo la quantificazione.
   7. Incubare per 1 h sul blocco termico a 65 °C, per la reidratazione del DNA.
5. Quantificazione del DNA
   NOTA: Il DNA è stato quantificato utilizzando un fluorometro e reagenti designati, come specificato nella tabella dei materiali.
   1. Porta gli standard a temperatura ambiente e prepara il kit, inclusi i tubi designati da 0,5 ml.
   2. Preparare tampone e miscela di coloranti in un tubo da 15 ml, in base al numero di campioni. Aggiungere 200 μL di tampone e 1 μL di colorante per campione. Includere 2 campioni per gli standard. Si consiglia di calcolare un campione aggiuntivo per evitare che il buffer non sia sufficiente.
      1. Per le 2 norme, posizionare 190 μL della miscela sopra preparata in un tubo da 0,5 ml. Aggiungere 10 μL dello standard.
      2. Per ciascun campione, posizionare 199 μL della miscela sopra preparata in un tubo da 0,5 ml. Aggiungere 1 μL del DNA.
   3. Leggi i campioni. Il risultato indica la concentrazione di DNA del campione.
   4. Se i campioni sono oltre il limite, diluire il DNA 1:10 con UPW e ripetere la lettura.

2. Preparazione della biblioteca

NOTA: Il protocollo corrente utilizza un kit di saggi multiplex basato su PCR compatibile con i sequencer NGS. Il kit contiene 24 indici diversi, ciascuno dei quali prende di mira le regioni conservate_{all'interno β} V_{e le regioni β} J. Ciò consente una reazione PCR in un solo passaggio e la messa in comune di campioni diversi. Vedi tabella dei materiali per i dettagli.

1. Prepara campioni di DNA. Ottenere 150 ng di DNA e aggiungere UPW per un totale di 5 μL.
   NOTA: È possibile utilizzare meno di 150 ng di DNA per la preparazione della biblioteca, con una concentrazione minima di 10 ng/μL.
2. Posizionare pipette e punte in cappuccio con luce UV per 15 minuti per abbattere il DNA residuo. Nel frattempo, consentire a diversi tubi indice (per la preparazione della biblioteca) e DNA polimerasi di scongelarsi sul ghiaccio.
3. In una cappa biologica, aggiungere 45 μL dai diversi tubi indice nei tubi PCR. Per seguire, aggiungere 0,2 μL della DNA polimerasi e i 5 μL di DNA preparati nella fase 2.1 nei tubi PCR.
4. Eseguire la reazione PCR utilizzando un programma pre-impostato, secondo le istruzioni del produttore.

3. Purificazione e quantificazione dell'amplicon

1. Usa perline magnetiche per la rimozione di primer, nucleotidi ed enzimi in eccesso.
   1. Riscaldare le perline almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Preparare abbastanza etanolo fresco all'80% per 400 μL per campione.
   2. Aggiungere 50 μL (IGH) o 35 μL (TCRβ) delle perline a ciascun tubo PCR e mescolare tubazione 10 volte. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente.
   3. Posizionare il campione misto sul supporto magnetico per 5 minuti.
   4. Aspirare 95 μL (IGH) o 80 μL (TCRβ) del liquido limpido e scartare. Aspirare il liquido rimanente utilizzando una punta di 10 μL.
   5. Aggiungere 200 μL di 80% di etanolo a ciascun campione. Incubare 30 s. Aspirare 195 μL di etanolo e scartare. Aspirare il liquido rimanente utilizzando la punta da 10 μL.
   6. Ripetere il passaggio 3.1.5. Aprire i tappi dei tubi e lasciare asciugare l'aria per 5 minuti.
   7. Immediatamente dopo i 5 minuti, rimuovere dal supporto magnetico e aggiungere 25 μL di tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl, pH 8.0). Mescolare con pipettazione fino a omogeneo. Incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
   8. Posizionare i tubi sul supporto magnetico per 5 minuti. Trasferire 22 μL su un nuovo tubo PCR. Misurare la concentrazione di DNA (fase 1.5).
2. Quantificazione amplicon
   NOTA: L'attuale protocollo utilizza una macchina automatizzata per l'elettroforesi per il controllo di qualità della concentrazione, delle dimensioni e dell'integrità del DNA. Vedi tabella dei materiali per i dettagli.
   1. Posizionare reagenti e screentape a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
   2. In un nuovo tubo di micro-centrifuga da 1,7 ml, effettuare una diluizione di 1 ng/μL dei campioni di DNA quantificati nella fase 3.1.8 con UPW per un volume totale di almeno 3 μL.
   3. Dna diluito vortice prima dell'uso. Posizionare 2 μL di tampone, insieme a 2 μL del DNA diluito nelle strisce PCR specializzate preetichetti (fornite nel kit) e posizionare i tappi. Posizionare sullo shaker per 1 minuto, seguito da spin down di strisce PCR.
      NOTA: A causa della viscosità del tampone, assicurarsi che il tampone in eccesso venga rimosso dalla punta prima del trasferimento ai tubi campione.
   4. Posizionare nella macchina, la screentape e le strisce PCR senza i tappi. Aprire il coperchio della scatola di punta all'interno della macchina. Assegnare la posizione con etichette appropriate. Avviare la macchina.
      NOTA: L'istogramma di uscita deve essere un singolo picco alla dimensione desiderata degli ampliconi (Figura 1A). In campioni di scarsa qualità, si osserveranno picchi aggiuntivi (figura 1B), che indicano una scarsa pulizia delle perline o la formazione di dimeri primer.

4. Sequenziamento di nuova generazione

1. Quantificazione e messa in comune della biblioteca
   1. Calcolare la concentrazione finale di DNA in nM, utilizzando il valore del DNA del passaggio 3.1.8, e la dimensione in coppie di basi (bp) del picco del prodotto, ottenuta dai risultati della macchina per elettroforesi (vedere figura 1).
   2. Per ogni campione, calcolare il volume di DNA da assumere per una concentrazione finale di 4 nM, in un volume finale di 10-20 μL tampone di eluizione.
   3. Preparare un nuovo mix di diluizione per ogni campione e prendere 2 μL da esso in un nuovo mix di piscina.
      NOTA: Per i campioni con meno di 4 nM, aggiungere la quantità massima possibile di campione.
2. Esecuzione di una libreria NGS
   NOTA: il protocollo corrente utilizza una piattaforma sequencer bench-top. Vedi tabella dei materiali per i dettagli.
   1. Preparare una nuova soluzione di 0.2 N NaOH. Aggiungere 10 μL di 0,2 N NaOH alla libreria diluita preparata al passaggio 4.1.3. Aggiungere brevemente PhiX al 5% a tubo e vortice. Girare verso il basso il tubo per assicurarsi che tutta la soluzione si sia depositata sul fondo del tubo.
   2. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per denaturare il DNA a doppio filamento. Aggiungere brevemente 980 μL di tampone pre-refrigerato dal kit al tubo contenente DNA e vortice.
   3. Metti la biblioteca diluita sul ghiaccio e prepara la biblioteca come segue. Per una miscela di 17 pM, aggiungere 425 μL di DNA dai gradini 4.2.2 e 575 μL di tampone. Inverti la libreria più volte e spin down. Caricare 600 μL della libreria finale sulla cartuccia designata e posizionare i campioni nella macchina.
   4. Avviare l'esecuzione seguendo le istruzioni software.

5. Analisi del sequenziamento

1. Scaricare le metriche di sequenziamento dal sequencer e verificare che i dati di sequenziamento si all'interno degli intervalli seguenti (specifici per il kit utilizzato nel protocollo corrente). Gli esempi che non soddisfa questi criteri sono soggetti a ripetizione dell'esecuzione:
   Densità cluster (Densità (K/mm2)): 945K – 1800K
   Percentuale di letture che passano il filtro (Cluster PF (%)): >90%
   Punteggi di qualità (%>=Q30): >85%
   Allineamento PhiX (allineato %): 1,5% - 10%
   Tasso di errore PhiX (%): <1,0%

Risultati

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento del DNA dal tessuto intestinale e dal sangue, la preparazione di librerie per NGS e i passaggi di base di una corsa di sequenziamento per il sequenziamento del repertorio immunitario. L'esecuzione genererà file fastq, che possono essere ulteriormente convertiti in file fasta per l'utilizzo nella piattaforma internazionale ImMunoGeneTics (IMGT)/HighV-QUEST. Questo HTS esegue e gestisce molte analisi di decine di migliaia di sequenze TCRβ e IGH riorganizzate, al livello nucleot...

Discussione

I cambiamenti nell'abbondanza e nella funzione dei linfociti B e T si incontrano spesso in diverse neoplasie maligne^18,disturbi infiammatori cronici (ad esempio colite ulcerosa e artrite reumatoide)^10,19e in varie immunodeficienze^17,20. Il metodo attuale utilizza NGS per facilitare una visione approfondita dei repertori TCR e BCR, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti n...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-propanol	Sigma	I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes	Axygen	8187631104051
15 mL centrifuge tubes	Greiner	188261
Absolute ethanol	Merck	1.08543.0250
Amplitaq Gold	Thermo Fisher	N8080241
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
Heat block	Bioer	Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer	Agilent	5067-5603	For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit	Invivoscribe	TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019	Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003	Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer	Illumina	SY-410-1003
PCR strips	4titude	4ti-0792
Proteinase K	Invitrogen	EO0491
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32854	Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker	Biosan	Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2940CA
ultra pure water	Bio-lab	7501
Wizard DNA isolation kit	Promega	A1120	Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer