Imaging privo di etichette delle dinamiche di conservazione lipidica negli elegani di caenorhabditis utilizzando la microscopia a dispersione Raman stimolata

Riepilogo

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) consente l'imaging selettivo e privo di etichette di specifiche moieties chimiche ed è stata efficacemente utilizzata per l'immagine di molecole lipidiche in vivo. Qui, forniamo una breve introduzione al principio della microscopia SRS e descriviamo i metodi per il suo uso nella conservazione lipidica di imaging in Caenorhabditis elegans.

Abstract

Il metabolismo lipidico è un processo fisiologico fondamentale necessario per la salute cellulare e dell'organismo. La disregolazione del metabolismo lipidico spesso provoca obesità e molte malattie associate tra cui disturbi cardiovascolari, diabete di tipo II e cancro. Per far progredire l'attuale comprensione della regolazione metabolica lipidica, i metodi quantitativi per misurare con precisione i livelli di conservazione lipidica in vivo nel tempo e nello spazio sono diventati sempre più importanti e utili. Gli approcci tradizionali per analizzare la conservazione lipidica sono semi-quantitativi per la valutazione microscopica o mancano di informazioni spazio-temporali per la misurazione biochimica. La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnologia di imaging chimico senza etichette che consente il rilevamento rapido e quantitativo dei lipidi nelle cellule vive con una risoluzione subcellulare. Poiché il contrasto è sfruttato dalle vibrazioni molecolari intrinseche, la microscopia SRS consente anche il tracciamento quadridimensionale dei lipidi negli animali vivi. Nell'ultimo decennio, la microscopia SRS è stata ampiamente utilizzata per l'imaging di piccole molecole nella ricerca biomedica e ha superato i principali limiti dei metodi convenzionali di colorazione fluorescente e di estrazione lipidica. In laboratorio, abbiamo combinato la microscopia SRS con gli strumenti genetici e biochimici a disposizione del potente organismo modello, Caenorhabditis elegans, per indagare la distribuzione e l'eterogeneità delle goccioline lipidiche tra diverse cellule e tessuti e, in ultima analisi, per scoprire nuove vie di segnalazione conservate che modulano il metabolismo lipidico. Qui, presentiamo i principi di lavoro e la configurazione dettagliata del microscopio SRS e forniamo metodi per il suo utilizzo nella quantificazione della conservazione lipidica in distinti punti di tempo di sviluppo di tipo selvaggio e insulina segnalando c. elegansmutanti carenti.

Introduzione

L'obesità è diventata un problema di salute globale che minaccia un terzo della popolazione in tutto il mondo e presenta una seria preoccupazione medica, data la sua associazione con la cattiva^{salute mentale 1 e le} malattie mortali tra cui diabete², malattie^{cardiovascolari 3} e alcuni tipi di^{cancro 4}. Lo studio del metabolismo lipidico è essenziale per comprendere meglio i problemi biologici alla base dell'obesità. Una quantificazione rapida e specifica dell'immagazzinamento lipidico comporta l'individuazione degli acidi grassi e dei loro derivati, nonché dei metaboliti contenenti steroli, ad alta sensibilità e preferibilmente con informazioni spaziali. I lipidi sono obiettivi impegnativi da identificare perché mancano di fluorescenza intrinseca e non possono essere facilmente etichettati fluorescentmente. I tag fluorescenti sono spesso più grandi delle molecole lipidiche e, pertanto, possono essere chimicamente invasivi e impraticabili per applicazioni in vivo. La strategia di etichettatura senza etichette o minima è necessaria per preservare la struttura idrofobica delle molecole lipidiche⁵. I recenti sviluppi nelle tecnologie di imaging hanno creato interessanti opportunità per l'imaging senza etichette di lipidi in cellule viventi, tessuti e organismi.

Gli approcci tradizionali per le analisi di conservazione lipidica in campioni biologici includono saggi biochimici e protocolli di colorazione con coloranti lipofili. I test biochimici di quantificazione che coinvolgono la spettrometria di massa (SM) non hanno eguali nella loro risolvibilità molecolare, ma richiedono quantità di campioni molto grandi e la preparazione del campione di solito richiede diverse ore, limitando la loro applicazione per l'imaging in tempo reale dei sistemi^{viventi 5}. Un'altra importante limitazione di questi saggi è la mancanza di informazioni spaziali. D'altra parte, i coloranti lipofili come Oil Red O e Sudan Black forniscono la distribuzione tissutale e cellulare degli organelli di stoccaggio lipidico e rispetto alle tecniche MS, questi metodi di colorazione sono anche a basso costo e facili da eseguire. Tuttavia, questi protocolli di colorazione richiedono una fissazione, che può influire sulla natura idrofobica delle goccioline lipidiche, generare cambiamenti artificiali nella loro struttura e causare incongruenze tra gli^{esperimenti 6}. Le difficoltà tecniche associate alle tecniche biochimiche e di colorazione hanno portato alla ricerca di metodi senza etichette per l'immagine delle molecole lipidiche e al rapido aumento dell'uso di microscopia a dispersione Raman coerente (CRS) nell'imaging lipidico.

L'effetto Raman è stato riconosciuto per la prima volta da Raman e Krishnan, dove hanno riferito che dopo aver interagito con un fotone, una molecola può generare luce diffusa senza alcun cambiamento di lunghezza d'onda (chiamata scattering Rayleigh) o raramente con una lunghezza d'onda alterata (chiamata scattering Raman) e questo cambiamento di lunghezza d'onda è caratteristico dei gruppi chimici funzionali all'interno^{della molecola 7}. Quando i legami chimici all'interno di una molecola si eccitano ad un livello di energia vibrazionale più elevato da un fotone incidente, chiamato fotone della pompa, l'energia del fotone sparso, chiamato fotone di Stokes, diventa più bassa. Altrimenti, i legami chimici possono raggiungere un livello di energia vibrazionale inferiore se sono originariamente ad un livello superiore, e il fotone sparso guadagna energia per essere il fotone anti-Stokes. La differenza di frequenza tra l'incidente e i fotoni sparsi è nota come spostamento di Raman. Ogni legame chimico all'interno di una molecola ha uno spostamento raman caratteristico e quantificabile. Ad esempio, il legame CH₂ ha uno spostamento Raman di 2.845 cm^-1, che è abbondante nelle catene di acidi grassi⁸. Questo segnale Raman spontaneo è generalmente molto debole, il che ha ampiamente limitato la velocità di imaging nella microscopia spontanea raman convenzionale. Nel corso degli anni, sono stati sviluppati vari approcci per aumentare la velocità di imaging e la sensibilità della microscopia spontanea Raman. La microscopia a dispersione Raman coerente, inclusa la microscopia cars (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) e la microscopia SRS (Stimulated Raman Scattering), è il progresso più recente. CARS e SRS hanno principi di lavoro leggermente diversi, ma entrambi sono tecniche senza etichette che hanno capacità di imaging dal vivo, possono fornire informazioni spaziali e temporali sulla dinamica di conservazione lipidica e richiedono solo piccole dimensioni del campione. La microscopia CARS soffre di background non risonante, che proviene da vari processi non lineari, e i segnali CARS hanno anche una relazione non lineare con la concentrazione della molecola, che insieme complicano il processo di^{quantificazione 9}. A differenza della microscopia CARS, la microscopia SRS non genera segnali di fondo non risonanti e offre una dipendenza lineare dalla concentrazione della molecola di interesse. Pertanto, attualmente la microscopia SRS è più ampiamente utilizzata per l'imaging lipidico.

Nella microscopia SRS, i deboli segnali spontanei Raman possono essere amplificati quando eccitati da due raggi laser sincronizzati con la loro differenza di frequenza corrispondente alla frequenza vibrazionale del legame chimico. La molecola sperimenterà una transizione migliorata verso uno stato eccitato a causa di un'eccitazione coerente. Di conseguenza, il tasso di generazione di fotoni Stokes viene aumentato. Di conseguenza, l'intensità del fascio "Stokes" trasmesso aumenta (guadagno raman stimolato, SRG) e l'intensità del fascio "pompa" trasmesso diminuisce (perdita raman stimolata, SRL). Il rilevamento dei segnali SRG o SRL è alla base dell'imaging della microscopia Stimulated Raman Scattering (SRS) di molecole con specifici legami chimici^10. Se la differenza di frequenza tra i due raggi laser non corrisponde alla frequenza vibrazionale del legame chimico all'interno di una molecola di interesse, non verranno generati né segnali SRG né SRL. La velocità di imaging della microscopia SRS è di circa 2 μsec per pixel o 1 secondo per fotogramma, che è molto più veloce della microscopia raman^{spontanea 11}. La risoluzione laterale tipica per la microscopia SRS è limitata alla diffrazione e a circa 300 nm. Inoltre, i processi ottici a due fotoni della microscopia SRS consentono l'imaging 3D volumetrico di campioni di tessuto spesso relativo e la profondità di imaging potrebbe raggiungere i 300-500 μm. Nel complesso, la microscopia SRS presenta una tecnica di imaging efficiente e priva di etichette per rilevare biomolecole specifiche, in particolare lipidi.

Le goccioline lipidiche sono organelli a membrana singola, che sono il principale sito di stoccaggio cellulare per lipidi neutri, compresi i triacilgilceroli (TAGs) e gli esteri del colesterolo (CE). I legami CH₂ nelle catene di acidi grassi di queste molecole lipidiche generano forti segnali SRS a 2.845 cm^{-1 quando} eccitati^8,consentendo così il rilevamento e la quantificazione dei livelli lipidici di stoccaggio in cellule intatte, sezioni tissutali e persino organismi^{interi 12,13,14,15}. In particolare, i C. elegans sono utili per gli studi di imaging lipidico grazie alla loro trasparenza. Come i mammiferi, anche i C. elegans immagazzinano lipidi nelle goccioline lipidiche e le vie di sintesi e degradazione delle molecole lipidiche sono altamente conservate¹⁶. In questo protocollo, forniremo il principio di funzionamento della microscopia SRS, la sua configurazione fondamentale e descriveremo i metodi per il suo utilizzo nell'imaging lipidico in C. elegans.

Protocollo

1. Configurazione strumentale per microscopia a dispersione Raman stimolata

NOTA: Il sistema di microscopia SRS è costruito su un laser a picosecondi con oscillatore parametrico ottico integrato della pompa e un microscopio a scansione laser confocale. L'oscillatore fornisce due treni a impulsi picosecondi, tra cui un fascio stokes a 1.064 nm e un fascio di pompaggio toniere tra 700-990 nm. La sovrapposizione temporale e spaziale dei due fasci si ottiene all'interno del laser. Un modulatore elettro-ottico integrato (EOM) è progettato specificamente per la microscopia SRS. Questo protocollo si concentrerà sull'accoppiamento del laser con il microscopio e sul funzionamento quotidiano di questo sistema (Figura 1). La configurazione di un sistema di microscopi srs si sta evolvendo nell'ultimo decennio. Va notato che la seguente descrizione rappresenta solo una delle diverse configurazioni.

1. Alimentazione di raggi laser al microscopio
   1. Impostare il periscopio per sollevare il fascio dall'uscita della sorgente luminosa picoseconda alla porta di ingresso laser a infrarossi sullo scanner del microscopio.
      ATTENZIONE: Leggere il manuale del sistema laser prima del funzionamento e prendere tutte le precauzioni necessarie perché la radiazione infrarossa vicina generata da questo sistema laser di classe IV può causare gravi danni agli occhi e alla pelle. Completare i corsi di formazione richiesti dai dipartimenti istituzionali per la sicurezza ambientale. Indossare occhiali protettivi e camice da laboratorio con maniche ammanettate.
   2. In primo luogo, impostare il fascio della pompa a 750 nm e abbassare la potenza del laser a 50 mW, che può essere ispezionata visivamente, affiliata all'allineamento. Quindi, utilizzare un espansore di travi(Figure 1, L1 e L2) per regolare il diametro del fascio in base all'apertura posteriore degli obiettivi del microscopio. Utilizzare due specchi a relè(Figura 1,M1 e M2) per guidare il raggio laser verso il periscopio(Figura 1,P1 e P2). Il periscopio solleverà il fascio fino all'altezza dell'apertura dello scanner e fungerà anche da specchio dello sterzo per l'allineamento.
   3. Impostare le manopole sul periscopio al centro dell'intervallo di sintonizzazione e scegliere la posizione e l'angolo iniziali di ogni specchio in modo che il raggio laser colpisca approssimativamente il centro dello specchio.
   4. Eseguire l'allineamento grossolano utilizzando una porta vuota sulla torretta obiettivo e posizionare la sonda del misuratore di potenza per misurare la potenza della luce trasmessa. Impostare lo scanner del microscopio con lo zoom più alto (50x), quindi misurare la potenza della luce trasmessa con il punto del raggio laser focalizzato. Ottimizzare le manopole su ogni specchio, M1 e M2, iterativamente per ottenere la massima potenza laser trasmessa.
   5. Eseguire l'allineamento fine con lo strumento di allineamento. Mettere il tappo di allineamento del bersaglio a fluorescenza sul sedile obiettivo vuoto e regolare le manopole di M1 per centrare il punto. Quindi, introdurre il tubo di estensione per il bersaglio e sintonizzare le manopole di M2 per centrare il punto.
   6. Ripetere i passaggi 1.1.4 e 1.1.5 fino a quando la trave centra il bersaglio in entrambe le posizioni.
2. Collegamento del rilevamento e dell'elettronica
   1. Impostare il modulo di rilevamento SRS. Posizionare un cuber splitter del fascio dopo il condensatore per dirigere il laser trasmesso al modulo fotodiodo. Il modulo include un telescopio per relè e modificare le dimensioni del fascio per adattarsi all'area attiva del fotodiodo, così come un filtro ottico per rimuovere il fascio di Stokes modulato e lasciare passare il fascio della pompa per la demodulazione.
   2. Impostare la connessione elettronica (Figura 1). L'intensità del fascio stokes è modulata da un EOM integrato a 20 MHz all'interno del laser tonnibile picosecondo. L'uscita della frequenza di modulazione dal laser viene immessa nell'amplificatore lock-in come frequenza di riferimento per la demodulazione. Alimentare il segnale di uscita del fotodiodo nell'amplificatore lock-in per demodulare la SRL.
      NOTA: I sistemi laser one-box possono essere aggiornati e quindi le loro specifiche possono variare a causa della diversa data di produzione. La versione precedente del sistema laser tonnibile picosecondo, utilizzato in questo protocollo, ha un fascio Stokes di 1.064 nm, ma la versione recente ha un fascio Stokes di 1.031 nm. La frequenza di modulazione dell'EOM utilizzata in questo protocollo è personalizzata a 8 MHz, ma la frequenza di modulazione predefinita per il sistema recente può essere di 10 o 20 MHz.
   3. Infine, alimenta l'uscita dell'amplificatore lock-in nella scatola analogica del microscopio per convertire il segnale analogico elettrico in segnale digitale. Il sistema dovrebbe essere pronto per elaborare il segnale SRS.
3. Ottimizzare le condizioni di imaging
   1. Creare un campione chimico per l'allineamento del sistema. Ad esempio, usa il dodecano per ottimizzare il microscopio, perché il dodecano ha un segnale SRS molto forte dai legami C-H. Utilizzare una guarnizione sicura per realizzare una mini camera; mettere 5 μL di dodecano e coprirlo con una coverlip.
      NOTA: Sostituire il campione di dodecano una volta che sembra poco chiaro o presenta detriti, con un nuovo campione che potrebbe essere utilizzato per l'allineamento per 2-3 mesi.
   2. Posizionare il campione sullo stadio del microscopio. Concentrarsi correttamente sulla goccia liquida. Può essere fatto più velocemente cercando il bordo del pad dodecane. Regolare il condensatore per l'illuminazione Kohler.
   3. Impostare i parametri di imaging. Verificare se la fase di ritardo è sui numeri giusti. Impostare la lunghezza d'onda del fascio della pompa su 795,8 nm. Utilizzando una scheda sensore IR e un visualizzatore IR, verificare se il percorso del fascio della pompa è ancora corretto.
   4. Impostare la potenza del fascio della pompa su 200 mW e il fascio Stokes a 400 mW sul pannello di controllo del sistema picosecond.
      NOTA: Le velocità di passaggio laser dall'uscita laser all'obiettivo post dei due fasci sono di circa il 25% per la pompa e del 14% per Stokes per questa configurazione del sistema. Pertanto, una potenza post-obiettiva del fascio della pompa è di circa 50 mW e per il fascio di Stokes è di circa 56 mW. La larghezza dell'impulso del recente sistema laser a picosecondi è cambiata da 6 ps a 2 ps, quindi la potenza laser applicata dovrebbe essere ancora più bassa.
   5. Impostare il guadagno dell'amplificatore lock-in al massimo. Aprire l'otturatore sia per le travi, sia per l'otturatore principale del laser.
   6. Scansiona l'esempio e controlla l'immagine sullo schermo del computer. Modificare la modalità di visualizzazione in Hi-Lo nel software di imaging. Regolare l'intervallo per visualizzare una saturazione di ~50%. Verificare se la saturazione è centrata nell'immagine. In caso meno, regolare attentamente gli specchietti sterzanti, M1 e M2, per massimizzare l'intensità dell'immagine e centrare l'intensità del picco.
   7. Mettere a punto lo stadio di ritardo e trovare l'intensità massima del segnale SRS dal campione di dodecano. Il sistema è quindi pronto per l'uso.

2. Preparazione di campioni di C. elegans per l'imaging di microscopie SRS

NOTA: Come organismi modello, caenorhabditis elegans si è dimostrato molto utile per più tecniche di imaging. Sono trasparenti per tutto il corpo, quindi vari tessuti possono essere immagini nell'animale intatto senza la necessità di dissezione. In C. elegans, i lipidi neutri sono conservati in goccioline lipidiche situate nell'intestino, che consiste di 20 cellule epiteliali situate bisemetralmente intorno al lume intestinale¹⁶. Anche le cellule ipodermiche e gli ovociti immagazzinano lipidi. La principale forma di lipidi di stoccaggio nelle goccioline lipidiche C. elegans sono i triacilgilceroli (TAGs)¹⁷, che generano forti segnali SRS a causa dell'abbondanza di legami CH₂ presenti nelle loro catene di acidi grassi. Questa sezione si concentrerà su come preparare campioni di C. elegans per l'imaging della microscopia SRS e la quantificazione dei loro livelli totali di conservazione lipidica intestinale.

1. Preparazione delle diapositive di imaging
   1. In primo luogo, preparare la soluzione di agarosio al 2% in H₂O distillato e assicurarsi che tutto l'agarosio si sciolga prima di preparare le pastiglie di agarosio.
   2. Aggiungere una goccia di agarosio caldo al 2% su una diapositiva vuota (circa 100 μL) posizionata tra diapositive di supporto con due strati di nastro da laboratorio e posizionare rapidamente una seconda diapositiva sopra la prima diapositiva. Premere delicatamente per creare un cuscinetto sottile e uniforme di agarosio.
   3. Mettere da parte queste diapositive in posizione chiusa e non separarle fino a quando i vermi non sono pronti per essere montati. Preparare diapositive fresche prima di ogni sessione di imaging, poiché i pad si asciugheranno dopo 1 giorno.
      NOTA: utilizzare camere di imaging multi-pozzo, se si imagingno diversi worm in schermi genetici ad alta produttività¹⁸. Utilizzare configurazioni di imaging dal vivo per immagini dinamiche spazio-temporali del metabolismo lipidico attraverso lo sviluppo e l'invecchiamento¹⁹.
2. Montaggio dei vermi
   1. Preparare l'agente anestetizzante aggiungendo rispettivamente azide di sodio o levamisolo nel tampone M9 alla concentrazione finale di 100 mM o 1 mM.
      NOTA: Utilizzare levamisolo se i vermi devono essere recuperati dopo l'imaging per il genotipizzazione dopo gli schermi genetici.
      ATTENZIONE: Diversi agenti anestetizzanti, tra cui l'azide di sodio e la levamisolo, sono dannosi se inalati. Indossare guanti e indumenti protettivi, nonché utilizzare una cappa aspirante chimica durante la preparazione di tali soluzioni di lavoro.
   2. Posizionare una goccia di agente anestetizzante in una busta di copertura (circa 4-5 μL per 10-20 vermi).
      NOTA: Regolare la quantità dell'agente anestetizzante in base al numero di verme per mantenere i vermi il più vicini possibile l'uno all'altro. L'uso di troppo liquido per pochi vermi può causare la diffusione dei vermi sul cuscinetto di agarosio.
   3. Selezionare i vermi da immaginire sotto la microscopia a dissezione e trasferirli nella gocciolamento dell'agente anestetizzante. Dopo che tutti i vermi sono stati aggiunti alla goccia, spostarli usando il raccoglitore di worm e assicurarsi che non si sovrappongano tra loro.
   4. Separare i vetrini (dal passaggio 2.1) senza perturpare il tampone di agarosio.
   5. Coprire la goccia di verme con lo scivolo di vetro che ha il cuscinetto di agarosio. Assicurarsi che il cuscinetto di agarosio sia rivolto verso i vermi. In alternativa, la goccia di invecchiamento anestetizzante può anche essere aggiunta sul tampone di agarosio e i vermi possono essere coperti con il copripasta.
   6. Infine, contrassegnare la posizione dei vermi utilizzando un marcatore permanente sullo scivolo di vetro.

3. Acquisizione e analisi di immagini

1. Acquisizione delle immagini tramite il sistema di microscopio SRS.
   1. Prima di creare un campione, determinare i parametri di imaging e verificare i segnali SRS (come spiegato nel protocollo 1).
   2. Montare lo scivolo con il coverslip rivolto verso l'obiettivo. Accendere la sorgente luminosa del campo luminoso e indirizzarla all'oculare per individuare i vermi.
      NOTA: Utilizzare una lente obiettiva 20x per immaginere la conservazione lipidica in tutto l'intestino. Prendi in considerazione l'uso di una lente obiettivo 60x per identificare la conservazione del grasso ipodermico o per quantificare le dimensioni /numero delle goccioline lipidiche.
   3. Portare i vermi a fuoco e regolare la posizione del condensatore di conseguenza.
   4. Spegnere la sorgente luminosa del campo luminoso e passare all'unità di scansione laser. Inizia a scansionare il primo worm a una velocità di scansione rapida (ad esempio, 512 x 512 pixel) e regola la messa a fuoco fine per trovare l'area di interesse. Per l'immagine del primo campione, regolare i poteri laser al livello in cui i segnali SRS non sono saturi.
   5. Passare a una velocità di scansione più lenta (ad esempio, 2 μs/pixel) e a una risoluzione più elevata (ad esempio, 1024 x 1024 pixel) per ottenere l'immagine SRS.
      NOTA: Mantenere costanti le potenze laser per ogni campione da immagini durante la sessione di imaging.
   6. Salvare l'immagine SRS nel formato desiderato che consente un'alta risoluzione, ad esempio un file .tiff corrente). A seconda del software di imaging e della configurazione utilizzata, salvare la posizione del primo worm prima di passare al successivo.
   7. Imaging completo di tutti i vermi montati sullo scivolo. Spegnere l'otturatore per bloccare i raggi laser. Non spegnere la sorgente laser fino a quando non vengono imageati tutti i campioni.
   8. Rimuovere la diapositiva prima di posizionare la diapositiva di esempio successiva. Ripetere i passaggi da 3.1.2 a 3.1.7.
   9. Una volta che tutti i campioni sono stati imageati, mettere la sorgente laser in standby e spegnere l'apparecchiatura associata tra cui l'amplificatore, il rilevatore, il microscopio e il computer.
2. Analisi delle immagini tramite ImageJ
   1. Aprite i file di immagine (in genere .tiff) da quantificare in ImageJ, selezionando i file e trascinandoli e rilasciandoli nella finestra ImageJ. Scaricare i plug-in ImageJ appropriati, se si utilizzano formati di microscopio Olympus specifici, ad esempio file oib.
   2. Selezionare le proprietà da analizzare (Analyze > Set Measurements). Per la quantificazione totale della conservazione lipidica, selezionare Area, Valore grigio minimo e Massimo e Valore grigio medio.
   3. Utilizzare lo strumento di selezione poligonale e delineare la regione dell'intestino del verme da quantificare. Per misurare i parametri selezionati nel passaggio 3.2.2, fare clic su Analizza > misura. Verrà visualizzata una nuova finestra con i risultati della misurazione. Ripetere questo passaggio per tutte le immagini aperte.
   4. Selezionare le misure per tutti i worm in un determinato genotipo e copiare/incollare i risultati in un nuovo foglio di calcolo. Ripetere i passaggi da 3.2.1 a 3.2.4 per tutti i genotipi nella stessa sessione di imaging.
   5. Selezionare un'area nelle vicinanze del worm che non ha alcun segnale SRS, da quantificare come sfondo. Assicurarsi che l'area selezionata per la misurazione dello sfondo non contenga batteri o detriti che potrebbero anche dare un segnale SRS.
   6. Sottrarre il valore grigio medio di sfondo dalle misurazioni di ogni singolo worm. Calcolare la deviazione media e standard dello sfondo sottratto valori grigi medi da tutti i worm in un determinato genotipo/gruppo di test. Normalizzare questo valore alla media del gruppo di controlli.
   7. Infine, eseguire l'analisi statistica appropriata utilizzando il valore grigio medio come misura per i livelli lipidici in ogni verme. In genere, utilizzare il test t diStudent per due gruppi e utilizzare ANOVA uni-way con un test di confronto multiplo appropriato per più di due gruppi.
      NOTA: quando si selezionano le immagini per la presentazione della figura, assicurarsi che le immagini selezionate abbiano la stessa distribuzione dell'intensità dei pixel. Impostare la luminosità e il contrasto sullo stesso valore per tutte le immagini della stessa figura (Image > Adjust > Brightness and Contrast).

Risultati

La segnalazione dell'insulina è un'importante via endocrina che influisce sullo sviluppo, la riproduzione, la durata della vita e il metabolismo. Nei vermi, la segnalazione dell'insulina consiste di circa 40 ligandi peptidici insulino-simili, ortologo del recettore del fattore di crescita insulino-simile DAF-2, cascata pi3K / AKT chinasi a valle e ortologo del fattore di trascrizione FoxO, DAF-16²⁰. I mutanti daf-2, che mancano del recettore dell'insulina, hanno più goccioline lipidiche...

Discussione

In difesa contro l'obesità e i suoi disturbi metabolici associati, sono stati implementati importanti sforzi di ricerca per comprendere meglio i meccanismi regolatori dell'omeostasi lipidica. Per il rilevamento quantitativo di molecole lipidiche in campioni biologici, l'imaging senza etichette mediante microscopia SRS si è dimostrato un'alternativa affidabile ai saggi biochimici e ad altri metodi di colorazione. Il nostro gruppo e altri hanno rivelato nuovi meccanismi biologici nella regolazione metabolica lipidica com...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/D converter	Olympus	Analog Unit
Agarose	GeneMate	3119	For making agarose pads
Alignment tool - adapter	Thorlabs	SM1A4	For mounting the tool on scope
Alignment tool - target	Thorlabs	VRC2SM1	For viewing IR laser
Alignment tool - tube	Thorlabs	SM1L40	Length can vary
Autocorrelator (Optional)	APE	pulseCheck
Bandpass filter	minicircuits	BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz	For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope	Nikon	SMZ800	For handling and picking worms for imaging
Dodecane	Sigma-Aldrich	44010	Used for calibration of the SRS signal
Filter	Chroma Technology	890/220 CARS	For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape	VWR	89097	For making agarose pads
Glass coverslips	VWR	48393-106	For covering worms for imaging
Glass microscope slide	VWR	16004-422	For making agarose pads
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Lens	Thorlabs	L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B	For beam expander
Lock-in amplifier	Zurich	HF2LI
Lowpass filter	minicircuits	BLP-1.9+	For power supply noise suppression
Mirrors	Thorlabs	BB1-E03	For relay and periscope
Objective	Olympus	UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode	Thorlabs	FDS1010
Picosecond laser source	APE	picoEmerald
Power supply	TEKPOWER	TP1342U	For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide	Sigma	S2002	For anaesthesizing the worms
Worm picker	WormStuff	59-AWP